Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tái sinh giống giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HOÀ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA GIỐNG GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 – 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HOÀ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA GIỐNG GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 – 2014 Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Ngô Xuân Bình ThS Dương Hữu Lộc Thời gian thực : Từ 12/2013 đến 05/2014 Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Được trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm thời gian thực tập tốt nghiệp em thực đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả tái sinh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum ) phương pháp in vitro” Sau tháng thực tập phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm đến em hoàn thành xong đề tài Để đạt kết ngày hôm em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình Ths Dương Hữu Lộc tận tình bảo, hướng dẫn em thời gian thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đóng góp hướng dẫn quý báu Ks Lã Văn Hiền trình thực hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Hòa DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT AND : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine Cs : Cộng Ct : Công thức CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng GA3 : Gibberellic Acid IBA : β - Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm MS : Murashige & Skoog (1962) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng hóa chất thời gian khử trùng đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy (sau ngày nuôi cấy) 25 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng BA đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam sau (10 ngày nuôi cấy) 27 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với NAA để nhân nhanh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng nồng độ GA3 đến kéo dài chồi Giảo cổ lam sau (20 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Cây giảo cổ lam Hình 2.2 Cấu trúc hóa học Flavononit Saponin Hình 4.1 Biểu đồ thể ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày nuôi cấy) 26 Hình 4.2.Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam ( sau 10 ngày nuôi cấy ) 28 Hình 4.3 Kết cảm ứng chồi giảo cổ lam môi trường nuôi cấy bổ sung BA sau (10 ngày nuôi cấy) 28 Hình 4.4 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh (sau 30 ngày nuôi cấy) 30 Hình 4.5 Kết nhân nhanh chồi Giảo cổ lam môi trường BA kết hợp NAA (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Hình 4.6 Biểu đồ thể kết ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả kéo dài chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 32 Hình 4.7 Kết kéo dài chồi môi trường bổ sung GA3 sau (20 ngày nuôi cấy) 32 Hình 4.8 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) 33 Hình 4.9 Kết tạo rễ môi trường bổ sung IBA (sau 15 ngày nuôi cấy) 34 MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Giảo cổ lam 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật học giảo cổ lam 2.1.3 Giá trị giảo cổ lam 2.1.4 Vị trí giảo cổ lam hệ thống dược liệu 2.2 Nghiên cứu giá trị y học giảo cổ lam 2.2.1 Thành phần hóa học tác dụng 2.2.2 Các nghiên cứu tác dụng tới sinh lý sức khỏe Giảo cổ lam 2.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào nhân giống thực vật 10 2.3.1 Tính toàn tế bào 10 2.3.2 Tính phân hóa phản phân hóa tế bào 10 2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 11 2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 11 2.4.3 Môi trường dinh dưỡng 11 2.5 Phương pháp nhân giống thực vật 12 2.5.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 12 2.5.2 Phương pháp đại 13 2.6 Tình hình sản suất sử dụng dược liệu giới Việt Nam 14 2.6.1 Tình hình sản suất sử dụng dược liệu giới 14 2.6.2 Tình hình sản suất sử dụng dược liệu Việt Nam 15 2.7 Nghiên cứu nhân giống giảo cổ lam nuôi cấy mô tế bào 16 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 18 3.1.1 Vật liệu 18 3.1.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 18 3.2 Điều kiện thí nghiệm 18 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.4 Nội dung nghiên cứu 19 3.5 Phương pháp nghiên cứu 19 3.6 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu tiêu đánh giá 23 3.6.1 Thu thập số liệu 23 3.6.2 Các tiêu theo dõi 23 3.6.3 Phương pháp xử lý số liệu 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết ảnh hưởng hóa chất thời gian khử trùng đến hiệu vô trùng vật liệu nuôi cấy 25 4.2 Kết ảnh hưởng BA đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam 27 4.3 Kết ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh giống Giảo cổ lam 29 4.4 Kết ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả kéo dài chồi 31 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Giảo cổ lam 33 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Giảo cổ lam có danh pháp khoa học Gynostemma pentaphyllum thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), phân bố khu vực có độ cao 200 - 2000m khu rừng thưa ẩm Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ số nước châu Á Ở nước ta Giảo cổ lam tìm thấy Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Tuyên Quang số địa phương khác [26] Giảo cổ lam loại thảo dược có đặc tính quý, chứa hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhóm saponin có tác dụng điều hòa huyết áp, tăng cường hệ thống miễn dịch, làm giảm hàm lượng colesterol, nâng cao khả chịu đựng thể [24] Vì Giảo cổ lam sử dụng làm rau ăn hay chế biến thành sản phẩm trà có tác dụng bảo vệ nâng cao sức khỏe cho người Do nhu cầu sử dụng ngày cao Giảo cổ lam bị khai thác cách qua mức làm giảm số lượng loài, nguồn gen tự nhiên Theo sách đỏ Việt Nam Giảo cổ lam xếp thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c,d [24] Nhưng việc nhân giống Giảo cổ lam tự nhiên có nhiều hạn chế: hệ số nhân chưa cao, phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên việc tìm phương pháp nhân giống có hiệu nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu (Trần Đức Thiện cs, 2010) [24], Anchalee Jala cs, 2012 [28] Một phương pháp lựa chọn phương pháp nuôi cấy mô tế bào Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, thực đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả tái sinh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum ) phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả tái sinh giảo cổ lam 1.3 Yêu cầu đề tài Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến khả tái sinh: - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chất khử trùng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến khả tái sinh - Nghiên cứu ảnh hưởng nông độ BA đến cảm ứng chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả kéo dài chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ 1.4 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học + Giúp sinh viên củng cố hệ thống lại kiến thức học nghiên cứu khoa học + Biết phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày báo khoa học - Ý nghĩa thực tiễn Xác định yếu tố ảnh hưởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho nghiên cứu 32 nồng độ GA3 tăng lên 0,5 mg/l 1,0 mg/l cho thấy chiều dài chồi tốt GA3 0,5 mg/l (5,11 cm) giảm dần GA3 1,0 mg/l (3,91 cm) Về chất lượng chồi thu công thức có giảm sút đáng kể, cụ thể chồi có biểu nhỏ, xanh vàng Hình 4.6 Biểu đồ thể kết ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả kéo dài chồi giảo cổ lam sau (20 ngày nuôi cấy) Theo nghiên cứu F.T Zohura cộng (2013) [34] đối tượng Luffa Acutangula L Roxb (thuộc họ bầu bí) cho thấy việc sử dụng kết hợp GA3 với BAP tốt cho phát triển tạo nhiều chồi So sánh với thí nghiệm việc sử dụng GA3 giúp Giảo cổ lam kéo dài chồi a b c Hình 4.7 Kết kéo dài chồi môi trường bổ sung GA3 sau 20 ngày nuôi cấy a - GA3 0,1 mg/l chồi mập, xanh ; b - GA3 0,3 mg/l chồi mập, xanh c - GA3 0,5 mg/l chồi nhỏ, xanh 33 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ giảo cổ lam Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) Công thức IBA (mg/l) Số mẫu Số rễ/cây Chiều dài rễ đưa vào (rễ) (cm) 1(Đ/C) 0,0 30 2,36e 1,26 0,1 30 5,03a 3,17 0,2 30 3,77b 2,69 0,3 30 3,4c 2,25 0,4 30 3,3d 1,75 CV(%) 3,8 4,8 LSD05 0,24 0,34 Chữ a,b,c,d,e thể kết so sánh phân hạng Duncan Hình 4.8 Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) 34 Từ kết bảng 4.5 hình 4.8 cho thấy: Với giá trị LSD05 đạt 0,24 sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% Các công thức bổ sung IBA nồng độ khác cho thấy số rễ chiều dài rễ thu tốt so với đối chứng Nhìn chung, nồng độ IBA 0,1 mg/l cho hiệu rễ tốt, với số rễ/ thu 5,03 rễ chiều dài rễ 3,17 cm Khi tăng nồng độ IBA lên 0,2 - 0,4 mg/l số rễ chiều dài rễ suy giảm đáng kể, cụ thể IBA 0,2 mg/l, 0,3 mg/l, 0,4 mg/l số rễ thu 3,77 rễ/cây, 3,40 rễ/cây, 3,30 rễ Chiều dài rễ tương ứng cho công thức đến 2,69 cm, 2,25cm, 1,75cm Số rễ chiều dài rễ thu thấp công thức đối chứng (ra rễ tự nhiên) 2,36 rễ/cây, 1,26cm Quá trình tạo rễ giảo cổ lam ghi nhận thông qua nghiên cứu Zhang ZH cs (1989) [36] Kết nghiên cứu đạt nồng độ IBA 1,0 mg/l cho hiệu rễ tốt môi trường ½ MS Theo nghiên cứu M E Haque cs (2008) [35] đối tượng bầu bí ngô (thuộc họ Cucurbitaceae) tiến hành tạo rễ môi ½ MS bổ sung 1,5 mg/l IBA cho 6,5 rễ/cây chiều dài rễ 5,5 cm bí ngô, 6,5 rễ/cây chiều dài rễ 5,8 cm Tuy kết nghiên cứu đạt có khác biệt so với nghiên cứu trước đây, khẳng định giảo cổ lam có khả rễ trình nuôi cấy in vitro để phục vụ cho nhân giống loài Như với số rễ/cây tốt đạt 5,03 rễ môi trường MS bổ sung IBA 0,1mg/l nghiên cứu lựa chọn cho nghiên cứu rễ a b c Hình 4.9 Kết tạo rễ môi trường bổ sung IBA sau (15 ngày nuôi cấy) a - đối chứng rễ dài 1,26 cm ; b - IBA 0,1 mg/l rễ dài 3,17 cm c - IBA 0,2 mg/l rễ dài 2,69 cm 35 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu thử nghiệm nuôi cấy giảo cổ lam môi trường MS có bổ sung chất hưu chất kích thích sinh trưởng BA, NAA, GA3, IBA Từ kết nghiên cứu trên, kết luận sau: - Khử trùng giảo cổ lam HgCl2 0,1% phút cho kết cao với tỷ lệ mẫu sống 77,8% - Môi trường thích hợp cho cảm ứng chồi Giảo cổ lam chồi lan: MS + đường 30g/l + agar 6g/l bổ sung BA với nồng độ 0,5 mg/l, pH: 5,6-5,8, với tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 90% - Môi trường nhân nhanh: MS + đường 30g/l + agar 6g/l bổ sung BA với nồng độ 0,5mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l, pH: 5,6-5,8 cho hệ số nhân chồi cao 4,77 lần, chất lượng chồi tôt - Môi trường kéo dài chồi: MS + đường 30g/l + agar 6g/l bổ sung GA3 với nồng độ 0,5 mg/l, pH: 5,6-5,8 với chiều dài chồi 5,11 cm - Môi trường rễ: MS + đường 30g/l + agar 6g/l bổ sung IBA với nồng độ 0,1 mg/l, pH: 5,6-5,8 khả rễ tốt với số rễ/cây 5,03 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khác chất khử trùng đến hiệu tạo vật liệu - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu (khoai tây, cà rốt, nước dừa) đến khả nhân nhanh chồi giảo cổ lam 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Khắc Bảo, Bảo tồn nguồn gen thuốc, NXB Nông nghiệp Hà Nội, năm 1991 Trần Khắc Bảo, Sử dụng bảo tồn tài nguyên di truyền thuốc Việt Nam, tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, năm 1996 Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thị Thuý Hà (2003), Giáo trình công nghệ sinh học, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Lê Đình Bình, Trần Văn Ơn (2005), Thực vật học, Trung tâm thư viện - Thông tin, Trường Đại học Dược Hà Nội Hà Thanh Bình, Nguyễn Tất Cảnh, Phùng Đăng Chinh, Nguyễn Ích Tân (2002), Trồng trọt đại cương, NXB Nông Nghiệp Bộ Khoa học Công nghệ Môi trường , Sách đỏ Việt Nam, phần thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, năm 1996 Bộ Y Tế, Hội nghị tổng kết 20 năm bảo tồn gen dược liệu Tam Đảo, Bộ Y tế 06/5/2009 Bộ môn Thực vật (2004), Thực vật Dược phân loại thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 308, 309 10 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 1322,1323 11 Nguyễn Tiến Dẫn (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học - Trường Đại học Dược Hà Nội 12 Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng Thất diệp đởm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học Trường Đại học Dược Hà Nội 13 Dược điển Việt Nam IV, 2009 xuất lần thứ tư Phụ lục 5.4 Hà Nội 14 Nguyễn Thị Hòa,Nguyễn Bá Hoạt (2001), Công trình NCKH 1987 - 2000 Viện dược liệu, NXBKH & KT 15 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, I, 563, 567 37 16 Phạm Thanh Hương (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Giảo Cổ Lam Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Trường Đại học Dược Hà Nội 17 Phạm Thanh Kỳ chủ biên (2006), Thực tập dược liệu hóa học, trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội in 18 Phạm Thanh Kỳ, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2007), Nghiên cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch dược liêu Giảo Cổ Lam (cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makinio,Tạp chí thông tin Y Dược số 24 19 Ngô Quốc Luật, Vũ Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Bình (2010), Biện pháp nhân giống vô tính chất lượng hạt giống dền toòng Tạp chí dược liệu, tập 15, số 1/2010, trang 20 Ngô Quốc Luật, Nguyễn Văn Thuận, Đinh Văn Mỵ (2008), Ảnh hưởng phân bón tới dược liệu kết xác định hàm lượng nitrat actiso trồng Sa Pa Công trình nghiên cứu khoa học tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc Viện Dược liệu 1988 - 2008 Viện Dược liệu Hà Nội T: 77-86 21.Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Thùy Châu, Trương Thị Bích Phượng (2011), “Nhân giống in vitro Sa Nhân tím (Amomumlongiligulare T.L.Wu)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4A), 689698 22 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 23 Hoàng Ngọc Thuận (2000), Nhân giống vô tính ăn (chiết, ghép, giâm cành, tách chồi nuôi cấy in vitro, Nxb Nông nghiệp, Huế 24 Trần Đức Thiện, La Quang Độ Trần Quốc Hưng (2010), “Nghiên cứu đặc điểm sinh thái học số loài Giảo cổ lam (Gynostemma spp) vườn quốc gia Ba Bể, Bắc Kạn”, Tạp chí Nông nghiệp Phái triển nông thôn(Hà Nội), tháng 11/2010, trang 52 25 Viện Dược liệu, 2000, Tuyển tập công trình nghiên cứu viện Dược liệu từ 1997 đến 2000 NXB khoa học kỹ thuật hà Nội 26 Viện Dược liệu, 2010, Phương pháp nghiên cứu thuốc từ thảo dược NXB khoa học kỹ thuật hà Nội 38 27 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục Tài liệu tiếng Anh 28 Anchalee Jala and Wassamon Patchpoonporn, (2012) “Effect of BA NAA and 2,4D on Micropropagation of Tiaogulan (Gynostemma pentaphy llum Makino), International Transaction Journal of Engineering, Management 29 Akihisa, Toshihiro, Tamura (1990), “4α- methyl sterol isolated from Gynostemma pentaphyllum”, phytocchemistry, 29 (5), 1647 - 1651 30 Ankang Pharmaceutical Intitution of Beijing Medcal University Promotional meterial, 1999 31 Arichi S, Takemoto T & Uchida Y (198b) Prevention of glucocorticoid side effects by saponin of Gynostemma pentaphyllum, Paten - Japan Kokai Tokyo Koho - 60 105 625 32 Chen J.C et al (2000), “Therapeutic effect Gypenoside on chronic liver injury and fibrosis by CCl4 in rats”.Am J Chin Med, 28 (2), 175 - 185 33 Cui J., Eneroth., Bruhl J.G (1999), Gynostemma pentaphyllum : “indentification of major sapogenins and differentation from Panax species”, Eur J Pharm Sci, (3), 187 - 191 34 F.T Zohura, M.E Haque, M.A Islam, M Khalekuzzaman, B Sikdar (2013), Regeneration System Of Ridge Gourd (Luffa Acutangula L Roxb) From Immature Embryo And Cotyledon Explants, International journal of scientific & technologyreses 39 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số kết ảnh thí nghiệm Cảm ứng chồi Vật liệu Ra rễ Nhân nhanh Kéo dài chồi 40 Phụ lục 2: Kết xử lý số liệu Bảng 4.1: Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 1,0 %, HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMC FILE TN1 3/ 6/** 16:51 PAGE Anh huong cua thoi gian khu trung NAClO 1,0%, HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo VARIATE V003 TLMC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 6816.70 973.815 ****** 0.000 * RESIDUAL 16 2.07990 129994 * TOTAL (CORRECTED) 23 6818.78 296.469 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMN FILE TN1 3/ 6/** 16:51 PAGE Anh huong cua thoi gian khu trung NAClO 1,0%, HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo VARIATE V004 TLMN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 19386.2 2769.46 ****** 0.000 * RESIDUAL 16 11.9187 744921 * TOTAL (CORRECTED) 23 19398.1 843.398 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMSKN FILE TN1 3/ 6/** 16:51 PAGE Anh huong cua thoi gian khu trung NAClO 1,0%, HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo VARIATE V005 TLMSKN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 13239.1 1891.30 ****** 0.000 * RESIDUAL 16 23.5001 1.46876 * TOTAL (CORRECTED) 23 13262.6 576.634 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN1 3/ 6/** 16:51 PAGE Anh huong cua thoi gian khu trung NAClO 1,0%, HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 TLMC 0.000000 0.000000 TLMN 100.000 62.2000 TLMSKN 0.000000 37.8000 41 3 3 3 0.000000 40.0000 0.000000 0.000000 0.000000 37.8000 53.3000 31.1000 100.000 71.1000 22.2000 31.1000 46.7000 28.8000 0.000000 28.9000 77.8000 31.1000 SE(N= 3) 0.208162 0.498304 0.699704 5%LSD 16DF 0.624072 1.49392 2.09772 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 3/ 6/** 16:51 PAGE Anh huong cua thoi gian khu trung NAClO 1,0%, HgCl2 den kha nang tao vat lieu vo F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLMC TLMN TLMSKN GRAND MEAN (N= 24) NO OBS 24 9.7250 24 58.875 24 31.388 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 17.218 0.36055 3.7 0.0000 29.041 0.86309 1.5 0.0000 24.013 1.2119 3.9 0.0000 | | | | 42 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng nồng độ BA đến cảm ứng chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONG CHO FILE TN2 2/ 6/** 9:44 PAGE Anh huong cua nong BA den cam ung choi Giao co lam VARIATE V003 TONG CHO CHO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 114.400 28.6000 85.80 0.000 * RESIDUAL 10 3.33335 333335 * TOTAL (CORRECTED) 14 117.733 8.40952 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 2/ 6/** 9:44 PAGE Anh huong cua BA den cam ung choi Giao co lam MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TONG CHO 5.33333 6.66667 7.66667 13.3333 9.33333 SE(N= 3) 0.333334 5%LSD 10DF 1.05035 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 2/ 6/** 9:44 PAGE Anh huong cua nong BA den cam ung choi Giao co lam F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TONG CHO GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 8.4667 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 2.8999 0.57735 6.8 0.0000 | | | | 43 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ BA tốt kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONG CHOI FILE TN3 24/ 5/** 7:33 PAGE Anh huong cua nong BA va NAA den kha nang nhan nhanh choi VARIATE V003 TONG CHO CHO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 2404.93 601.233 140.92 0.000 * RESIDUAL 10 42.6664 4.26664 * TOTAL (CORRECTED) 14 2447.60 174.829 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNH FILE TN3 24/ 5/** 7:33 PAGE Anh huong cua nong BA va NAA den kha nang nhan nhanh choi VARIATE V004 HSNH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 24.0493 6.01233 140.91 0.000 * RESIDUAL 10 426669 426669E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 24.4760 1.74829 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 24/ 5/** 7:33 PAGE Anh huong cua nong BA va NAA den kha nang nhan nhanh choi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TONG CHOI HSNH 11.3333 1.13333 16.3333 1.63333 3 26.6667 2.66667 47.6667 4.76667 31.0000 3.10000 SE(N= 3) 1.19257 0.119257 5%LSD 10DF 3.75782 0.375784 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 24/ 5/** 7:33 PAGE Anh huong cua nong BA va NAA den kha nang nhan nhanh choi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TONG CHOI HSNH GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT (N= 15) SD/MEAN | NO BASED ON BASED ON % | OBS TOTAL SS RESID SS | 15 26.600 13.222 2.0656 7.8 0.0000 15 2.6600 1.3222 0.20656 7.8 0.0000 | | | | 44 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả kéo dài chồi BALANCED ANOVA FOR VARIATE T.CCC FILE TN4 24/ 5/** 7:46 PAGE Anh huong cua nong GA3 den kha nang keo dai choi VARIATE V003 T.CCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 2439.20 609.799 ****** 0.000 * RESIDUAL 10 3.72014 372014 * TOTAL (CORRECTED) 14 2442.92 174.494 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TB.CCC FILE TN4 24/ 5/** 7:46 PAGE Anh huong cua nong GA3 den kha nang keo dai choi VARIATE V004 TB.CCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 24.3920 6.09799 ****** 0.000 * RESIDUAL 10 371994E-01 371994E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 24.4292 1.74494 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4 24/ 5/** 7:46 PAGE Anh huong cua nong GA3 den kha nang keo dai choi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 T.CCC 14.6333 22.3000 31.5000 51.1333 39.1667 TB.CCC 1.46333 2.23000 3.15000 5.11333 3.91667 SE(N= 3) 0.352143 0.352133E-01 5%LSD 10DF 1.10961 0.110958 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4 24/ 5/** 7:46 PAGE Anh huong cua nong GA3 den kha nang keo dai choi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE T.CCC TB.CCC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 31.747 15 3.1747 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 13.210 0.60993 1.9 0.0000 1.3210 0.60991E-01 1.9 0.0000 | | | | 45 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONG SO FILE TN5 30/ 5/** 9:12 PAGE Anh huong cua nong IAA den kha nang re Giao co lam VARIATE V003 TONG SO SO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 1118.93 279.733 155.41 0.000 * RESIDUAL 10 18.0001 1.80001 * TOTAL (CORRECTED) 14 1136.93 81.2095 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SO RE/CA FILE TN5 30/ 5/** 9:12 PAGE Anh huong cua nong IAA den kha nang re Giao co lam VARIATE V004 SO RE/CA RE/CA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 11.1893 2.79733 155.41 0.000 * RESIDUAL 10 180000 180000E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 11.3693 812095 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEU DA FILE TN5 30/ 5/** 9:12 PAGE Anh huong cua nong IAA den kha nang re Giao co lam VARIATE V005 CHIEU DA DA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 6.81009 1.70252 ****** 0.000 * RESIDUAL 10 346717E-02 346717E-03 * TOTAL (CORRECTED) 14 6.81356 486683 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 30/ 5/** 9:12 PAGE Anh huong cua nong IAA den kha nang re Giao co lam MEANS FOR EFFECT CT CT NOS TONG SO SO RE/CA CHIEU DA 23.6667 2.36667 1.26333 50.3333 5.03333 3.17667 3 37.6667 3.76667 2.68667 34.0000 3.40000 2.25333 33.0000 3.30000 1.75000 SE(N= 3) 0.774598 0.774597E-01 0.107505E-01 5%LSD 10DF 2.44079 0.244078 0.338751E-01 - 46 Phụ lục 3: Môi trường Table 1: Preparation of modified Murashige AND Skoog’s MS medium Bottle Component Stock Solution (g/l) I NH4NO3 KNO3 82,5 95 II MgSO4 7H2O MgSO4 4H2O ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O 37,0 2,23 1,058 0,0025 III CaCl2.2H2O KI CoCl2.6H2O 44,0 0,083 0,0025 IV V KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O FeSO4 7H2O Na2EDTA 2H2O 17,0 0,62 0,025 2,784 3,724 Amount to take preparation (ml) Final concentratic (mg/ l) 20 1.650,0 1.900,0 10 370,0 22,3 10,6 0,025 10 440,0 0,83 0,025 10 170,0 6,2 0,25 10 27,85 37,25 0,5 2,0 0,1 0,5 0,5 2,0 0,1 0,5 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid Glycine ThiamineHCl PyridoxineHCl 100 100 100 100 Inositol 100,0 Sucrose 30.000,0 Agar 8.000,0 PH 5,8 [...]... Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến cảm ứng chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ 3.5 Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng - Cách... tiến hành nghiên cứu (Trần Đức Thiện và cs, 2010; Anchalee Jala và cs, 2012) [24],[28] Một trong những phương pháp được lựa chọn hiện nay là phương pháp nuôi cấy mô tế bào Việc nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro mở ra một hướng mới cho việc nhân, giữ giống cây giảo cổ lam - Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro: + Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống. .. [16] 2.2.2 Các nghiên cứu tác dụng tới sinh lý sức khỏe của Giảo cổ lam 2.2.2.1 Các kết quả nghiên cứu trong nước Do phát hiện nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh dược cao có trong giảo cổ lam nên nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu Các công trình nghiên cứu hóa học của tác giả Viện Dược liệu Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2002) [18] đã chứng minh dịch chiết từ dược liệu Giảo Cổ Lam có nhóm... ra một hướng mới cho việc nhân, giữ giống cây Giảo cổ lam - Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro: + Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1-10mm + Hoàn toàn tiến hành trong môi trường vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh, sử dụng vật liệu sạch virus và có khả. .. + 8h tối/ngày - Cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux 19 3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm: Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2013 đến 06/2014 3.4 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 1%, HgCl2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng... pentaphyllum (Thunb) Makino - Loài Giảo cổ lam 3 lá: Gynostemma laxum (Wall.) Cogn - Loài Giảo cổ lam 5 lá: Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino - Loài Giảo cổ lam 7 lá: Gynostemma pubescens (Gagnep) C.Y.Wu - Loài Giảo cổ lam 9 lá: Gynostemma sp 4 2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây giảo cổ lam 2.1.2.1 Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Cây thân thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, ít lá... cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột cống lão hóa nuôi bằng glucose (2g/kg) [30] Trong một số nghiên cứu gần đâu, gypenosid (250mg/kg) làm giảm sự tăng kích thích tăng glucose ngoại sinh trên chuột béo phì đái đường Zucker do cải thiện được sự nhạy cảm của receptor insulin [30] - Tác dụng đến tim mạch Giảo cổ lam có thể ảnh hưởng tới hoạt động của tim mạch [69] Trong nghiên cứu do Circosta... khả năng nhân nhanh giống sạch bệnh virus 14 + Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây - Tuy nhiên, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cũng có hạn chế như: + Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện dạng cây không mong muốn + Cây nhân giống in vitro được cung cấp nguồn hydrocacbon nhân tạo nên khả năng. .. nhân giống bằng gieo trồng bằng hạt, giâm hom hai phương pháp này phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên …do đó việc tiềm ra phương pháp nhân giống có hiệu quả đã và đang được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu (Trần Đức Thiện và cs, 2010; Anchalee Jala và cs, 2012) [24], [28] Một trong những phương pháp được lựa chọn hiện nay là phương pháp nuôi cấy mô tế bào Việc nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro. .. hóa học: Flavononid Saponin Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của Flavononit và Saponin 2.2.1.2 Tác dụng và công dụng của giảo cổ lam - Tác dụng dược lý Các đặc tính dược lý của giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [11] Tính chất đa tác dụng của loài cây này đã được đặt tên là cất trường sinh - “the immortality