Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) in vitro

NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở DƯA CHUỘT ĐƠN BỘI VÀ CÁC CÂY TRONG HỌ BẦU BÍ ..... Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, các tiểu bào tử và noãn đã trở thành một công cụ tối ưu, cu

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

Đà Nẵng – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả khóa luận

Châu Thị Vượng

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện Khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường,

Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức

lý thuyết cũng như thực hành thí nghiệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực

vật, qua đó bản thân tôi đã trưởng thành hơn trong tư duy, bố trí và tiến hành các

nghiên cứu khoa học

Để hoàn thành được Khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi

xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự tận tình hướng dẫn, giúp đỡ về mặt khoa học của TS

Nguyễn Minh Lý

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô thuộc khoa Sinh- Môi trường

đã truyền dạy cho tôi rất nhiều kiến thức cũng như phát triển kĩ năng thực hành thí

nghiệm trong quá trình tôi thực hiện đề tài Khoá luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên trong nhóm nghiên cứu, đã luôn

giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động

viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất

Xin trân trọng cảm ơn

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Châu Thị Vượng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯA CHUỘT 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây dưa chuột 4

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng 5

1.1.3 Giá trị kinh tế 6

1.1.4 Các giống dưa chuột lai đang sử dụng sản xuất hiện nay 8

1.2 VAI TRÒ CỦA CÂY ĐƠN BỘI TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG 8

1.2.1 Giá trị của cây đơn bội 8

1.2.2 Phương pháp tạo cây đơn bội 9

1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN 11

1.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng và kiểu gen cây mẹ 11

1.3.2 Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển bao phấn 12

1.3.3 Ảnh hưởng của việc xử lí vật liệu trước khi nuôi cấy 12

1.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy 12

1.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy 13

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở DƯA CHUỘT ĐƠN BỘI VÀ CÁC CÂY TRONG HỌ BẦU BÍ 14

1.4.1 Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trên thế giới 14

1.4.2 Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Phương pháp thu nụ dưa chuột 20

2.3.2 Phương pháp vào mẫu 20

2.3.3 Bố trí thí nghiệm và xử lí thống kê 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 26

3.1 CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU NỤ HOA 26

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA KIỂU GEN DƯA CHUỘT ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS 27

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC NỤ HOA DƯA CHUỘT ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS 28

3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THU MẪU VÀ THỜI GIAN XỬ LÝ LẠNH ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS 29

3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 29

3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 30

3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG (ĐHST) ĐẾN SỰ PHÁT SINH CALLUS ĐƠN BỘI VÀ TÁI SINH CÂY 31

3.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 31

3.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và KIN đến hiệu quả tạo callus từ

nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 33

3.5.3 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ callus bao phấn dưa chuột 34

3.5.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của KIN và NAA đến khả năng tái sinh cây từ callus bao phấn dưa chuột 36

3.6 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO CALLUS TỪ NUÔI CẤY IN VITRO BAO PHẤN DƯA CHUỘT 38

3.6.1 Điều kiện nhiệt độ 38

3.6.2 Điều kiện ánh sáng 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Kiến nghị 41

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : Dichlorophenoxylacetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine

ĐHST : Điều hòa sinh trưởng KIN : Kinetin

MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : α-Naphthaleneacetic acid

SH : Schenk và Hildebrandt (1972) TDZ : Thidiazuron

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

bảng

1.2 Thành phần dinh dưỡng ăn được trong 100 dưa chuột

(Theo“Bảng thành phần hóa học thức ăn Việt Nam - 2007”) 5

1.3 Tình hình sản xuất dưa chuột của 1 số nước trên thế giới

giai đoạn 2012-2016 (Nguồn FAOSTAT 2018) 6

1.4 Điều kiện nuôi cấy bao phấn một số cây thuộc họ bầu bí 16 2.1 Đặc điểm giống dưa chuột sử dụng trong thí nghiệm

(Nguồn: Công ty East West Seed Lucky Seed)

19 2.2 Các công thức khử trùng 21 3.1 Hiệu quả của các công thức khử trùng mẫu nụ hoa 26

3.2 Sự ảnh hưởng của kích thước nụ hoa dưa chuột đến khả

năng phát sinh callus

bao phấn dưa chuột

35

3.8 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng tái sinh cây từ callus bao

phấn dưa chuột

36

3.9 Sự ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến khả năng tạo

callus từ bao phấn dưa chuột

38

3.10 Sự ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến khả năng tạo

callus từ bao phấn dưa chuột

39

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

3.2 Callus sau 3 tuần nuôi cấy (A) Giống dưa chuột HMT 356 (B)

3.3 Sự ảnh hưởng của kích thước nụ hoa dưa chuột đến khả năng

phát sinh callus sau 3 tuần nuôi cấy

29

3.4 Callus phát sinh trên môi trường MS có bổ sung 0,33 mg/l 2,4-D

và 0,22 mg/l KIN, nụ hoa xử lý (40C) trong 2 ngày

31 3.5 Sự tăng trưởng về kích thước của callus 32

3.6

Callus phát sinh trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D

và 0,2 mg/l KIN quan sát dưới kính hiển vi Thanh ngang tỷ lệ 5

mm

34

3.7 Tái sinh 1 rễ từ phôi sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung

BAP 1,0 mg/l, thanh ngang tỉ lệ 5 mm

35

3.8 Tái sinh 4 rễ từ phôi sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung

BAP 1,0 mg/l, thanh ngang tỉ lệ 5 mm

36

3.9 Rễ từ phôi sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung BAP 1,0

mg/l tái sinh trở lại mô sẹo; thanh ngang tỉ lệ 5 mm

36

3.10 Tái sinh 1 rễ từ phôi sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung

KIN 4,0 mg/l; thanh ngang tỉ lệ 4 mm

37

3.11 Tái sinh 4 rễ từ phôi sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung

KIN 4,0 mg/l; thanh ngang tỉ lệ 4 mm

37

3.12 Tái sinh 6 rễ từ callus sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ

sung KIN 4,0 mg/l; thanh ngang tỉ lệ 4 mm

37

3.13

Callus sau 3,4,5 tuần nuôi cấy với điều kiện nuôi cấy thích hợp

ở nhiệt độ 320C 1 ngày sau đó 250C các ngày tiếp theo và 250C trong quá trình nuôi cấy, tối hoàn toàn

39

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) là một loại cây có giá trị kinh tế được trồng phổ biến tại nhiều nơi trên thế giới, chúng được sử dụng chủ yếu dưới dạng tươi, cũng

có thể được dùng để chế biến một số loại món ăn, và một phần được bảo quản và chế biến cho mục đích sử dụng lâu dài [10] Ngoài ra, dưa chuột còn có giá trị như một

vị thuốc quý, trong quả dưa chuột có chứa hàm lượng vitamin C khá cao và một số men có lợi kích thích tiêu hoá rất tốt cho sức khỏe Nhiều sản phẩm chế biến sau thu hoạch từ cây dưa chuột như dưa chuột muối, đóng hộp rất được ưa chuộng trên thế giới Đối với Việt Nam dưa chuột còn là một sản phẩm có giá trị xuất khẩu cao, hiện nay sản phẩm từ dưa chuột Việt Nam đã được xuất khẩu sang nhiều thị trường rộng lớn như: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapo… [10] Tính chung trong 5 tháng đầu năm 2017 giá trị xuất khẩu dưa chuột đạt 20 nghìn USD [2] Các tiêu chuẩn và các quy định về hình thức, chất lượng dưa chuột dùng trong xuất khẩu là rất cao, vì vậy bên cạnh yếu tố năng suất các giống dưa chuột được dùng cho mục đích này cần đáp ứng được những yêu cầu hết sức khắt khe khác như độ dày cùi, màu sắc vỏ, kích thước quả, thời gian bảo quản, hàm lượng các chất [13].Thời gian gần đây, tuy đã có nhiều cố gắng trong công tác chọn giống cây trồng, nhưng bộ giống dưa chuột của nước ta vẫn còn hạn chế, các giống dùng cho tiêu thụ nội địa thì năng suất và chất lượng thấp, các giống dùng cho chế biến thì rất ít, và hầu hết đều là các giống nhập nội từ Nhật Bản, Liên Bang Nga, Thái Lan…[2]

Dưa chuột là cây rau ăn quả ngắn ngày Ở nước ta nó có thể trồng nhiều vụ trong năm, quả cho thu hoạch nhiều đợt, năng suất trung bình đạt xấp xỉ 17 tấn/ha tương đương với năng suất trung bình toàn thế giới Trồng trong điều kiện nhà che phủ nylông ứng dụng công nghệ cao tại Hà Nội, năng suất đạt tới hơn 120 tấn/ha, bằng 1/3 năng suất dưa chuột ở nước ngoài trong điều kiện tương tự [13] Mặc dù là cây rau đa dụng, được trồng phổ biến, song năng suất và chất lượng dưa chuột ở nước ta còn thấp, một phần do còn sử dụng nhiều giống địa phương, độ đồng đều không cao, mẫu mã kém; các giống lai nhập nội có tính chống chịu yếu với sâu bệnh hại và môi

trường bất thuận đã làm ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất của giống cây trồng này [7]

Ngoài ra, trong điều kiện nhiệt đới gió mùa ẩm quá trình sản xuất dưa chuột của người nông dân gặp rất nhiều các loại sâu, bệnh hại do các yếu tố phi sinh học, và sinh học gây nên (bệnh đốm lá, bệnh đốm phấn, bệnh sương mai, bệnh thối rễ, bệnh thối quả, bệnh héo rủ, bệnh vàng lá), dẫn đến năng suất và chất lượng dưa chuột bị giảm đi Vì vậy, nhiệm vụ quan trọng của các nhà chọn giống hiện nay là phải tạo ra các giống lai dưa chuột có năng suất cao, kháng bệnh tốt và thích hợp cho xuất khẩu cũng như sử dụng ở dạng tươi Tuy nhiên, quá trình tạo giống bằng phương pháp thông thường đòi hỏi rất nhiều thời gian và chi phí Ở hầu hết các nước việc chọn tạo các giống dưa mới đều theo hướng tạo ra các giống dưa F1 có ưu thế lai cao từ các dòng bố mẹ thuần chủng [2] Nhưng dưa chuột có đặc điểm là cây đơn tính cùng gốc, giao phấn chủ yếu nhờ côn trùng nên việc tạo ra các dòng thuần bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và công sức Dòng thuần được tạo ra bằng cách tự thụ phấn và chọn lọc qua nhiều thế hệ (7 - 8 thế hệ) Mặc dù vậy phương pháp này nhiều khi vẫn không đạt được dòng bố mẹ đồng hợp tử ở tất cả các cặp alen [2] Điều này dẫn đến một sự cần thiết là phải sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để tạo ra những giống dưa chuột có phẩm chất tốt, nhằm cải thiện vốn gen của dòng dưa chuột hiện tại, khắc phục được những nhược điểm tồn tại của phương pháp chọn giống truyền thống Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, các tiểu bào tử và noãn đã trở thành một công cụ tối ưu, cung cấp giống cây đơn bội phổ biến, nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu phát triển cây dưa chuột đồng hợp, phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng Qua đó tạo ra nguồn biến dị phong phú, đồng thời phục vụ trong công tác chuyển gen ở cây trồng Sản xuất cây đơn bội dưa chuột thông qua nuôi cấy bao phấn cho phép các nhà nhân giống dưa chuột tạo các dòng mới nhanh hơn

Trong Họ Dưa chuột Cucurbitaceae, sinh sản đơn tính đực đã được báo cáo đối với cây bí, dưa hấu [39] Sinh sản đơn tính cái bằng nuôi cấy noãn sản xuất giống lai F1 đã được báo cáo trong họ bầu bí [50, 57]

Các thí nghiệm, các nghiên cứu trên cùng cho rằng nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn phụ thuộc vào kiểu gen Việc xác định được callus từ giao tử hay tế bào

soma còn nhiều hạn chế Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả, sự thành công của việc nuôi cấy bao phấn (kiểu gen cây trồng, điều kiện sinh trưởng của cây mẹ cho bầu nhụy và bao phấn, các giai đoạn phát triển của bao phấn, tiền xử lý nụ hoa, điều kiện

và môi trường nuôi cấy [26] vẫn chưa khảo sát đầy đủ Vì những lý do trên, chúng

tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát

sinh callus từ bao phấn cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) in vitro’’

2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng quy trình tạo callus từ bao phấn dưa chuột in vitro tạo nguồn vật liệu cho quá trình tái sinh cây đơn bội phục vụ công tác chọn giống

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của các yếu tố nội và ngoại sinh đến quá trình phát sinh callus từ bao phấn dưa chuột đơn bội

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯA CHUỘT

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây dưa chuột

Dưa chuột là loại rau ăn quả trồng lâu đời nhất, được biết đến cách đây khoảng 5.000 năm Song cho đến nay vẫn có nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc xuất xứ của loại cây này Phần lớn các nhà nghiên cứu đều thống nhất rằng cây dưa chuột có nguồn gốc từ Tây Ấn Độ (Nam Á), nơi tồn tại các loài họ hàng hoang dại với số lượng nhiễm sắc thể 2n = 14 Loài hoang dại Cucumis hardiwickii Royle là loài dưa chuột quả nhỏ, có vị đắng, có gai quả cứng và thưa được tìm thấy mọc hoang dại ở dưới chân núi Hymalaya Một số nhà khoa học Liên Xô như Vavilov, Tcachenco (1967), Taracanov cho rằng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam giáp Lào là nơi phát sinh cây dưa chuột vì ở đây còn tồn tại dạng dưa chuột hoang dại [11]

Từ kết quả nghiên cứu qua các chuyến thám hiểm thực địa, nhà thực vật học Vavilov (1926) đã cho rằng Trung Quốc là trung tâm khởi nguyên thứ 2 của loài dưa này Các tài liệu cổ của Trung Quốc cũng ghi nhận ngay từ thế kỷ thứ IV ở đây đã trồng dưa chuột Từ việc phát hiện ra dạng cây dưa chuột hoàn toàn hoa cái (Gynoecious) trong tập đoàn giống từ Trung Quốc, giống như các dạng cây này của Nhật Bản được phát hiện trước đó, Mochshorov cho rằng dưa chuột Trung Quốc được trồng từ lâu ở những vùng có điều kiện khí hậu mát mẻ của Nhật Bản Từ vùng nguyên sản, dưa chuột được du nhập vào Châu Âu từ thế kỷ XV Từ Châu Âu, dưa chuột được đưa tới Châu Mỹ và cuối thế kỷ XVII chúng mới được phổ biến rộng rãi tại lục địa này Hiện nay dưa chuột được trồng hầu như khắp nơi trên thế giới, từ vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi đến tận 63 vĩ độ Bắc [16]

Việc phân loại dưa chuột theo đặc tính sinh thái và di truyền học giúp các nhà chọn tạo giống dễ dàng lựa chọn nguồn vật liệu khởi đầu Theo Trần Khắc Thi (1985) bảng phân loại của Gabaev (1932) loài C sativus L được chia thành 3 loài phụ là: loài phụ Đông Á (ssp rigidus Gab.), loài phụ Tây Á (ssp.graciolor Gab.) và loài hoang dại (ssp agrostis Gab., var Hardwickii (Royle) Alef.)

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Quả dưa chuột có hàm lượng nước thấp hơn các loại quả khác thuộc họ bầu bí (Cucrbitaceae) nhưng lại có hàm lượng protein cao Dưa chuột chứa nhiều loại đường, một số loại axit amin, beta-carôten, vitamin B1, C, các chất canxi, phốt pho, sắt và kali Do đặc điểm giàu các nguyên tố khoáng như Kali và ít Natri, dưa chuột kích thích sự lưu thông nước trong cơ thể, có tác dụng lợi tiểu và tái tạo khoáng [3] Ngoài

ra, dưa chuột có công dụng thanh nhiệt, chống khát, giải độc, tốt cho người tiểu tiện khó, rôm sảy Dưa chuột có tác dụng ức chế sự hình thành mỡ trong cơ thể, người béo ăn nhiều dưa chuột rất có lợi, đồng thời giảm lượng cholesterol và chống khối u Bên cạnh đó dưa chuột còn có tác dụng làm đẹp, đắp mặt nạ bằng dưa chuột có tác dụng bảo vệ da và chống lại các nếp nhăn

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng ăn được trong 100 dưa chuột

(Theo “Bảng thành phần hóa học thức ăn Việt Nam - 2007”)

Thành phần dinh dưỡng Đơn vị Hàm lượng

1.1.3 Giá trị kinh tế

a Tình hình sản xuất dưa chuột trên thế giới

Quả dưa chuột có thể chế biến thành nhiều mặt hàng khác nhau Do đó loại cây này đang là nguồn thu của nhiều quốc gia Trong những năm gần đây đã có nhiều nước trên thế giới xuất, nhập khẩu dưa chuột dưới dạng ăn tươi hay chế biến [2] Dưới đây là bảng số liệu thống kê tình hình sản xuất dưa chuột của 1 số nước trên thế giới giai đoạn 2012- 2016

Bảng 1.3 : Tình hình sản xuất dưa chuột của 1 số nước trên thế giới giai đoạn

Mỹ 162.235 158.786 162.005 158.717 167.015 TBN 844.189 931.358 871.899 866.408 906.242 TNK 454.644 459.648 465.751 472.059 482.330

Mỹ 806.630 774.080 799.820 790.570 802.220 TBN 749.302 754.400 775.903 705.776 770.704 TNK 1.741.878 1.754.613 1.780.472 1.822.636 1.811.681

Thế

giới

Nhìn chung, diện tích, năng suất và sản lượng dưa chuột của các nước trên thế giới đều tăng qua các năm Diện tích trồng dưa chuột trên thế giới năm 2016 là 2.144.672 ha tăng 1,37% so với năm 2012 với diện tích 2.115.757 ha Sản lượng dưa chuột đạt 375.893 tấn (năm 2016) tăng 12,5% so với năm 2012 (334.132 tấn) Do nhu cầu về rau xanh nói chung và dưa chuột nói riêng của người tiêu dùng ngày càng cao khi lương thực và các loại thức ăn giàu đạm được đảm bảo Đặc biệt là các nước phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản, Anh Canada, Đức…

Năm 2005, 5 nước nhập khẩu dưa chuột lớn nhất thế giới là Hoa Kỳ (423.431 tấn), Đức (410.084 tấn), Anh (104.054 tấn), Newtherlands (66.091 tấn) và Pháp (59.019 tấn) Trong khi đó, 5 nước xuất khẩu dưa chuột lớn nhất thế giới là: Tây Ban Nha (399.256 tấn), Mexico (398.971tấn), Newtherlands (360.054 tấn), Jordan (64.308 tấn) và Canada (54.967 tấn), như vậy nhiều quốc gia vừa xuất khẩu vừa nhập khẩu dưa chuột Điều đó cho thấy rằng công nghệ chế biến đồ hộp chỉ đang tập trung vào một số nước phát triển như Hoa Kỳ, Canada, Newtherlands Những nước này, ngoài lượng dưa chuột sản xuất trong nước, đã nhập khẩu một lượng lớn dưa chuột ở dạng quả tươi, sau quá trình chế biến, xuất khẩu dưa chuột dưới dạng đồ hộp

b Tình hình sản xuất dưa chuột ở Việt Nam

Trong số các cây thực phẩm thì dưa chuột là cây trồng ngắn ngày cung cấp nguyên liệu cho ngành chế biến rau quả xuất khẩu, được nhiều quốc gia ưa thích Diện tích, năng suất, sản lượng dưa chuột tăng mạnh trong những năm gần đây

Ở nước ta, dưa chuột được sản xuất chủ yếu ở một số tỉnh như Tây Ninh, Đồng Nai, Tiền Giang, Đồng Tháp, An Giang, Lý Nhân (Hà Nam), Nam Định, Bắc Giang, Thanh Hóa thu lợi nhuận cao Các mặt hàng dưa chuột xuất khẩu chủ yếu dưới dạng dưa quả tươi, dưa bao tử, dưa chuột muối, dầm giấm sang một số nước châu Âu, châu Mỹ, châu Á: Trung Quốc, Đài Loan, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc [11] Năm

2007, tổng công ty rau quả Việt Nam đã xuất khẩu được 47.423 tấn dưa chuột hộp và

522 tấn dưa chuột đóng lọ thủy tinh Năm 2008, tổng diện tích trồng là 1.685,56 ha, sản lượng xuất khẩu là 70.478 tấn Năm 2009, diện tích trồng dưa chuột: 31.570 ha/năm (tăng gấp 18 lần so với năm 2008) Sản lượng dưa chuột: 577.218 tấn/năm (năm 2009) (Số liệu Tổng cục Thống kê Việt Nam, năm 2009)

1.1.4 Các giống dưa chuột lai đang sử dụng sản xuất hiện nay

Các giống dưa chuột hiện đang trồng phổ biến ở Việt Nam khá đa dạng và theo xu thế phát triển chung của thế giới Phân theo kích thước quả gồm có nhóm giống quả nhỏ, nhóm quả trung bình và nhóm quả to Phân theo mục đích sử dụng các giống được chia thành 02 nhóm: nhóm giống ăn tươi và nhóm giống phục vụ chế biến Theo thị hiếu vùng miền các giống dưa chuột lại được chia thành 02 nhóm là nhóm giống sử dụng cho các tỉnh phía Nam và nhóm giống sử dụng cho các tỉnh phía Bắc Nhóm các giống sử dụng cho các tỉnh phía Nam (bao gồm cả miền Trung) gồm các giống: Ninja 179, Amata 765, Trang Nông 20, Hưng Thịnh Nhóm các giống được trồng tập trung ở các tỉnh phía Bắc như các giống Yên Mỹ, CV5, Ninja 179 Một số giống đã được chọn tạo như:

Nhìn chung các giống dưa chuột hiện có của chúng ta còn chưa đáp ứng được yêu cầu về sản xuất và tiêu dùng Các giống địa phương vẫn chưa được khai thác triệt để trong công tác chọn giống dưa chuột ở Việt Nam Chưa có những giống chuyên dùng cho chế biến và phục vụ xuất khẩu mà thường phải nhập từ nước ngoài như: giống dưa chuột lai F1 TO, TK của Nhật Bản; giống dưa chuột bao tử nhập từ Thái Lan MTXTE; giống Marina quả chùm hoặc giống Levina quả đơn, v.v , giá hạt giống cao Đó là một yếu tố quan trọng dẫn đến chi phí sản xuất trên đơn vị diện tích tăng [9]

1.2 VAI TRÒ CỦA CÂY ĐƠN BỘI TRONG CHỌN GIỐNG CÂY

TRỒNG

1.2.1 Giá trị của cây đơn bội

Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã được phát hiện từ lâu Cây đơn bội đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt cây trồng khác nhau Các nhà khoa học đã tìm ra những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thành công của quá trình nuôi cấy như ảnh hưởng của kiểu gen, giai đoạn phát triển của hạt phấn và các điều kiện môi trường nuôi cấy Ngoài nuôi cấy bao phấn, các nhà khoa học còn có những thành công rất lớn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, nuôi

cấy hạt phấn tách rời Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào

tử hoặc đại bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép tạo ra nhanh chóng hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho mục đích nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng

Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiến hành

đa bội hóa đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra allen hoàn toàn giống nhau Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể các gen lặn Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống

Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã được phát hiện từ lâu Karpachenco là người đầu tiên ngay từ năm 1929 đã chỉ ra khả năng

và triển vọng của việc sử dụng đơn bội vào mục đích chọn giống, vì trong bất kỳ một quần thể nào, một tổ hợp mong muốn của các gen trong giao tử thường là cao hơn so với trong hợp tử Do đó về mặt lý thuyết sẽ thường xuyên và rất nhanh nhận được các dạng đồng hợp tử có những tổ hợp các dấu hiệu mong muốn bằng cách gấp đôi trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể ở các thể đơn bội [4] Thời gian cần thiết để tạo ra dòng vật liệu nguồn- dòng đơn bội kép như vậy được rút ngắn rất nhiều, khoảng 3-4 lần, tùy đối tượng cây [1]

1.2.2 Phương pháp tạo cây đơn bội

Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n) Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học

đã tiến hành nghiên cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm nguồn vật liệu cho công tác chọn giống

Tạo cây đơn bội in vitro là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện dụng và

nhanh chóng của phương pháp này Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội Kỹ thuật

tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi

nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích thích các tế bào

trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội Đặc biệt với cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống cây trồng

- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Nuôi cấy các hạt phấn

đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensis) Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực như sau:

+ Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n)

+ Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n

+ Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua

- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Sự hình thành cây đơn

bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh (gynogensis) Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn bội Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng

là rất cao Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v đã không cho kết quả như mong muốn Trên cơ sở đó, vào những năm 70 các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

và đã thu được nhiều thành tựu

Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau Đối với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5 - 20%; ở lúa là 1,5 - 12%; ở dâu tằm là 3 -6%, … Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn Nhằm tăng hiệu quả của

quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …

Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản và thu được nhiều thành công hơn cả

Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:

- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen

- Tạo đột biến ở mức đơn bội

- Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng

1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO

PHẤN

1.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng và kiểu gen cây mẹ

Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện nhiều hơn nếu nhiệt độ dưới điều kiện ngày ngắn duy trì ở 18oC Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn Xử lý cây bằng cách bơm thuốc trừ sâu hoặc các chất độc khác cần phải được tránh Cây thiếu nitrogen có thể ảnh hưởng xấu đến bao phấn hơn so với cây được cung cấp đủ nitrogen Vì thế, có thể khuyến cáo rằng chỉ có những nguyên liệu sinh trưởng ở các điều kiện môi trường được điều chỉnh tốt chẳng hạn như nhà kính (greenhouse) mới có thể dùng cho việc sinh sản đơn tính tiểu bào tử [16]

Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong một loài Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một đặc điểm có khả năng di truyền [25], [26]

Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn dưa chuột Tác giả T.Suprunova và N.Shmykova đã nuôi cấy 10 giống (Hiziz, Gordion, Hana,

Melen, Kedet, Asak, Reisa, Tristan, Tarantutka và Rostovchanin) Kết quả chỉ có giống Gordion có thể tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn [26]

Zagorska N.A khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn chỉ thu được callus từ bao phấn của 53 giống trong số 85 kiểu gen và sự tái sinh cây chỉ có được từ callus của 15 giống Số liệu thu được cho thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn [29]

1.3.2 Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển bao phấn

Giai đoạn phát triển của bao phấn cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, đồng thời tỷ lệ cây bạch tạng tăng Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây trồng nào cũng có hiệu suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hoà thảo có nhiều điểm khác nhau Một

số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thay đổi về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 6 đến 9% [28] Đối với lúa các nhà khoa học ở Viện lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạt phấn ở các giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhân giữa đến đơn nhân muộn là tốt nhất, có nghĩa là cần lấy hoa khi khoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là 2- 4cm [47] Trên cây thuốc lá Reed đã xác định được giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và tràng hoa có chiều dài tương đương nhau [43]

1.3.3 Ảnh hưởng của việc xử lí vật liệu trước khi nuôi cấy

Áp dụng tiền xử lý nhiệt là một nhân tố quan trọng làm tăng hiệu quả kích thích sinh trưởng ở các loại cây khác nhau [37] Tiền xử lý nhiệt đã được sử dụng để tạo ra phôi từ bao phấn, nó phá vỡ khung tế bào trong bào tử giai đoạn đầu và nhiệt độ tối ưu, thời gian xử lý thay đổi từ loài này sang loài khác Tiền xử lý nhiệt độ cao

sẽ phá vỡ sự phát triển tích hợp bình thường của các mô bao phấn soma và sau đó có thể đồng bộ hóa các trạng thái sinh lý của 2 mô từ đó kích thích quá trình cảm ứng

1.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy

Nhiệt độ trong phòng nuôi có ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus và tái sinh cây Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 250C với biên độ là 25 – 280C

và cho tái sinh cây là 20 – 250C Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích hợp chính là nguyên nhân làm tăng cây bạch tạng Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt độ phòng nuôi cao hơn 300C thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch tạng Wang và cộng sự (1974) kết luận: việc hình thành cây xanh hay cây bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ thêm [49]

1.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của nuôi cấy bao phấn, nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White (1953), môi trường MS, môi trường Nitsch (1969), môi trường B5 (1968) Tuỳ theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau những môi trường cơ bản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp [8],[37]

Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn và sự cân bằng giữa auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định phản ứng giữa bao phấn với môi trường và thay đổi sự biểu hiện di truyền Auxin cao và cytokinin thấp

sẽ xúc tiến cho quá trình tăng sinh callus, ngược lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con Trong một vài trường hợp lại không cần thiết đến sự có mặt của auxin [37] Những auxin được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy bao phấn là: αNAA, IAA, 2,4-D và CPA ở nồng độ 1 – 2 mg/l được coi là có hiệu quả hơn so với các auxin đơn lẻ hay kết hợp khác [34], [29]

Chọn lọc cây đơn bội: Không phải tất cả các cây tái sinh trong quá trình nuôi cấy bao phấn là cây đơn bội Khi nuôi cấy bao phấn có một số trường hợp xảy ra như:

Mô giao tử có thể tự lưỡng bội hóa khi đó mô hoặc cây tạo ra từ mô này sẽ là cây lưỡng bội Callus hoặc phôi lưỡng bội cũng có thể được tạo ra từ tế bào vỏ bao phấn lưỡng bội nên sau này cây tái sinh từ mô này sẽ cho ra cây lưỡng bội nhưng giống hệt với cây mẹ Có thể xác định cây đơn bội bằng phương pháp như: đếm trực tiếp số

lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước và khả năng sinh trưởng và phát triển [30]

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở DƯA

CHUỘT ĐƠN BỘI VÀ CÁC CÂY TRONG HỌ BẦU BÍ

1.4.1 Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trên thế giới

Đối với các cây trong họ bầu bí kỹ thuật nuôi cấy bao phấn để tạo cây đơn bội cũng được nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu và đã thu được những thành công nhất định Tuy nhiên, dòng đơn bội kép được tạo ra thông qua nuôi cấy bao phấn còn nhiều hạn chế [30], [33], [38] Những yếu tố như đặc tính di truyền, điều kiện trồng của cây mẹ, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy, môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến kết quả của quá trình nuôi cấy bao phấn [26]

Năm 1974 Eun và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột đã phát hiện callus phát triển từ bao phấn sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường có bổ sung 2,4D Sau

30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện [38] Theo Lazarte, và Sasser, (1982) bao phấn dưa chuột được trên nuôi cấy môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau đó tạo callus trên môi trường cơ bản MS Phôi phát triển thành cây con trên môi trường Nitsch and Nitsch đặc có chứa 20 g/l raffinos [41]

Hamidvand Y và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh callus và phôi từ nuôi cấy bao phấn cây dưa chuột trên 2 giống dưa chuột Beta Alafa và Esfahani Hai giống cây trồng được trồng trong điều kiện nông học tốt nhất, cây mẹ lấy mẫu từ 30- 45 ngày tuổi Bao phấn được lấy từ 9-10 h sáng Kích thước bao phấn 3-5mm Kết quả thu được tốt nhất đối với giống Beta Alafa (môi trường cảm ứng) trên môi trường MS có bổ sung 2 µM 2,4-D kết hợp với 1,5 µM Kinetin Cho kết quả trung bình ở cả 2 giống: MS có bổ sung 2 µM 2,4-D + 1µM BAP Điều kiện nuôi cấy 250C±10C, trong thời gian chiếu sáng là 16h Môi trường biệt hóa: MS có bổ sung 13,32 µM BAP + 0.54 µM NAA; 3% sucrose; 0,8% agar [25]

Kumara H.G.A và cs Đã quan sát được sự tái sinh callus dưa chuột được tối ưu hóa trên môi trường B5 có bổ sung 2 µM 2,4-D và 1 µM BAP Tiền xử lý nụ tốt nhất

ở 40C trong 2 ngày Môi trường biệt hóa B5 + 0,09 M sucrose + 0,25 µM NAA +0,25

µM KN, sau đó cấy chuyển sang môi trường B5 + 5µM ABA, tiếp tục cấy chuyển phát triển cây B5+ 0.09 M sucrose Nụ hoa được xử lý, rửa sạch 1% Laboline, 0,5% Carbendazim trong 10 phút, sau đó khử trùng bề mặt bằng 5% dd Natrihypoclorit trong 20 phút, cuối cùng khử trùng 0,1% HgCl2 5 phút Xử lý lạnh 40 C trong 2 ngày Trong số 24 cây tái sinh ở mỗi giống đã phát hiện được 21 cây giống Calypso và 17 cây giống Green Long là đơn bội [34]

Suprunova T và cs đã tiến hành nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn cây dưa chuột Nụ hoa được xử lý, tiệt trùng bề mặt trong 0,1% HgCl2

trong 10 phút sau đó rửa sạch 3 lần bằng nước cất vô trùng Khảo sát trên môi trường cảm ứng MSm chứa 8% sucrose, 100 mg/l serine; 800 mg/l glutamine + 2mg/l 2,4 D + 1mg/l BA Môi trường biệt hóa: MSm + 2% sucrose; 0.2 mg/l BA; và 0,05 mg/l NAA, được nuôi cấy trong 220C thời gian chiếu sáng 14h [26]

Kết quả nghiên cứu trên 20 kiểu gen dưa chuột Kết quả khảo sát cho thấy: Môi trường tốt nhất cho sự phát sinh callus là môi trường MS có bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M KIN, 3% sucrose và 0,8% agar Môi trường cho sự phát sinh phôi là MS có bổ sung 0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar Môi trường cho sự tái sinh cây là MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar [29]

Bảng 1.4 Điều kiện nuôi cấy bao phấn một số cây thuộc họ bầu bí

phát triển

của hạt phấn

Tiền

xử lý lạnh

Sốc nhiệt

Môi trường cảm ứng

Môi trường biệt hóa

320C,

1 ngày

B5+0,44mg/l 2,4-D +0,23mg/lBAP

B5 + 0,06 mg/l

KN + 0,055 mg/l NAA

[37]

Đơn nhân

giữa

40C, 2 ngày

330C,

1 h

MS+1mg/lBAP+ 1,11 mg/l KN + 0,5 mg/l 2,4-D +3% sucrose +0,

8 % agar

MS + 0,5 % mg/l BAP + 6% sucrose

[39] Đơn nhân

giữa

40C, 2–

3 ngày

B5 + 0,442 mg/l 2,4-D + 0.225 mg/l BAP + 5%

sucrose

MS + 0,2 mg/l BAP + 0,05 mg/l NAA +2

MS + 2,5 sucrose + 0,44 mg/l 2,4-D + 0,23 mg/l BAP + 0,37 mg/l KN

MS + 3%

sucrose + 3 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA

[47]

Đơn nhân

giữa

250C, 30-35 ngày

MS+0,5mg/l2,4D+1mg/l BAP+

1,5mg/l KN

MS + 0.1 mg/l NAA + 3 mg/l BAP

320C,

1 tuần

MS + 10%

sucrose + 5mg/l 2,4-D

MS + 0,05 mg/l KN + 0,05 mg/ NAA

[49]

Đơn nhân

giữa

40C, 4 ngày

350C,

1 tuần

MS + 15%

sucrose + 5mg/l 2,4-D

MS + 0,057 mg/l KN + 0,05mg/l NAA

[39]

40C, 4 ngày

350C,

1 tuần

MS + 10% sucrose + 6mg/l 2,4-D

MS + 0,05 mg/l KN + 0.05mg/l NAA

MS + 3%

sucrose

[52], [53] Đơn nhân

muộn

40C, 2 ngày

350C,

2 ngày

MS+3% sucrose + 3mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA

MS + 3%

sucrose + 0,5 mg/l BAP

[25]

Đơn nhân

muộn

40C, 4 ngày

350C,

1 tuần

MS + 9%

sucrose + 1 mg/l 2,4-D

MS + 0,05 mg/l KN +0,05 mg/l NAA

[43]

1.4.2 Nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam

Nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuôi cấy tạo cây đơn bội, tác giả Nguyễn Đức Thành (2000) cho thấy vật liệu ban đầu cho nuôi cấy có thể là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời Sử dụng bao phấn để nuôi cấy đơn giản hơn về mặt kỹ thuật và môi trường nuôi cấy nhưng mô và cây có thể tạo thành từ mô soma của thành bao phấn

và như vậy rất khó phân biệt với cây tự lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn Tuy nhiên thành bao phấn lại có vai trò quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn Hạt phấn được khởi đầu phân chia trong bao phấn và chỉ những hạt phấn được khởi đầu phân chia mới tiếp tục phát triển [11]

Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạt phấn

và đóng vai trò như bể chứa chất trao đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến đổi các chất từ môi trường nuôi cấy Đối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó khăn để nuôi cấy và môi trường nuôi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn Sự ổn định pH là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào vì vậy pH môi trường cũng cần được quan tâm Sự bền vững và hấp thu nhiều chất phụ thuộc vào pH môi trường như αNAA, giberelin, vitamin, sắt, pH thường là 5,5-5,8 trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muối trong môi trường có khuynh hướng kết tủa [30]

Nuôi cấy bao phấn lúa là phương pháp tạo ra dòng thuần đơn bội kép chỉ trong một thời gian ngắn Sử dụng môi trường SK-I và N6 làm môi trường tạo callus cho

tỷ lệ callus tối ưu và sử dụng môi trường MS và môi trường M-019 làm môi trường tái sinh cây thu được tỷ lệ cây tái sinh cao hơn Trong khoảng thời gian từ 1 tuần đến

10 ngày nên chuyển callus sang môi trường tái sinh cây sẽ cho tỷ lệ cây xanh cao nhất

và tỷ lệ cây bạch tạng thấp hơn Như vậy, nếu giữ callus trong thời gian dài trong môi trường nuôi cấy mà không chuyển sang môi trường tái sinh, tỷ lệ cây bạch tạng sẽ tăng lên và tỷ lệ cây xanh sẽ giảm [32]

Việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội phục vụ công tác tạo dòng thuần trong chọn tạo giống cây trồng vẫn còn nhiều hạn chế Hiện nay, kỹ thuật này mới chỉ ứng dụng được một phần rất nhỏ trong chọn tạo lúa, ngô còn các đối tượng cây trồng khác

chưa được nghiên cứu nhiều, đặc biệt cây dưa chuột chưa có nhiều bài báo hay nghiên cứu về quy trinh nhân giống cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn

Đặng Thị Mai (2009), theo luận án Thạc sĩ khoa học nông nghiệp “Nghiên cứu

kỹ thuật tạo cây dưa chuột đơn bội từ nuôi cấy in vitro bao phấn” : Môi trường dinh dưỡng cơ bản thích hợp nhất cho sự phát sinh, phát triển callus đối với cả 2 giống là môi trường MS, cho tỷ lệ bao phấn tạo callus: từ 22,17% đến 28,83%; tỷ lệ callus màu vàng 32,33% đến 28,84% đồng thời callus tăng trưởng nhanh nhất sau 5 tuần nuôi cấy có thể cấy chuyển callus để tái sinh cây Nuôi cấy nụ hoa có kích thước trong khoảng 10 - 15 mm và xử lý lạnh nụ hoa ở 40C trong 24 giờ là thích hợp nhất cho bao phấn tạo callus đối với cả 2 giống, sau 5 tuần nuôi cấy có thể cấy chuyển callus để tái sinh cây Môi trường tạo callus có hiệu quả nhất đối với cả 2 giống là môi trường MS + 1,5ppm 2,4D + 1,0ppm KI, cho tỷ lệ bao phấn tạo callus đạt 70,50% (Marinda) và 69,17% (Valaspik), callus thu được có chất lượng tốt, sau 4 tuần có thể cấy chuyển tái sinh cây Đối với cả 2 giống Marinda và Valaspik môi trường tái sinh tốt nhất là môi trường MS + 0,03ppm TDZ + 1,0ppm BAP, cho tỷ lệ mẫu tái sinh từ 38,44 - 41,33%, tỷ lệ mẫu tái sinh cây đạt 70,53 - 74,75%, tỷ lệ cây xanh 77,10 - 74,91% Callus tạo được từ môi trường có bổ sung MS + 2,4D + Kinetin cho hiệu quả tái sinh cao nhất trên cả 2 giống Marinda và Valaspik, cho tỷ lệ mẫu tái sinh từ 45,78 - 51,33%, tỷ lệ mẫu tái sinh cây đạt 69,90 - 71,42% trong đó tỷ lệ cây xanh thu được 68,52 - 69,84% Bổ sung dịch chiết cao nấm men vào môi trường làm tăng chất lượng chồi Môi trường thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội của cả 2 giống là: MS + 2,0ppm BAP + 0,1 ppm IAA, hệ số nhân chồi đạt 3,28 - 3,64 (lần) sau 4 tuần nuôi cấy đồng thời chất lượng chồi cũng được đánh giá tốt [2]