vật
Cơ chế sát nhập T-DNA vẫn chưa được biết một cách đầy đủ, không giống như transposon và retrovirus, T-DNA không mã hóa các enzyme cần cho quá trình sát nhập, vì vậy T-DNA chèn vào DNA thực vật phải thông qua các protein vận chuyển trung gian của bản thân Agrobacterium và các nhân tố của tế bào chủ.
Ở thực vật, sự chèn DNA xảy ra phần lớn là do tái tổ hợp không tương đồng. Tái tổ hợp không tương đồng cũng chịu trách nhiệm cho sự chèn T-DNA vào bộ gen thực vật trong suốt quá trình gây nhiễm Agrobacterium. Vai trò của các nhân tố thực vật và vi khuẩn trong quá trình này vẫn chưa rõ ràng.
Bằng việc phân tích trình tự của đoạn T-DNA gắn xen và vị trí trước khi gắn vào, nhận thấy rằng quá trình gắn xen của T-DNA và vai trò của protein VirD2 như sau: đầu tiên đầu 3‟ của T-DNA tìm những vùng trình tự tương đồng trên DNA bộ gen của thực vật và bắt đầu quá trình „tôi luyện‟ DNA. Tiếp đến nuclease sẽ cắt bỏ đoạn trùng lắp (vùng T-DNA đầu 3‟ và vùng bổ sung trên bộ gen thực vật) và nucleotide trên virD2 bắt cặp với tiểu trình tự tương đồng trên DNA thực vật và lại tiếp tục „tôi luyện‟ DNA. Quá trình „tôi luyện‟ này làm cho liên kết phosphotyrosine có ái lực với điện tử ở đầu 5‟ của T-DNA gần lại với đầu 3‟- OH của DNA thực vật đã được cắt xén. Những đầu này được nối lại, mạch trên (upper strand) của DNA thực vật bị thoái hóa và bộ máy sửa sai của thực vật sẽ tổng hợp mạch trên của T-DNA để tạo ra trình tự đầy đủ của T- DNA sáp nhập.
Có hai giả thuyết về vai trò của VirD2 trong quá trình sáp nhập T-DNA:
VirD2 hoạt động như một integrase. Trên trình tự amino acid của VirD2 có một motif H-R-Y (điển hình cho integrase của bacteriophage) và vị trí nhận biết đặc hiệu cho enzyme recombinase.
VirD2 hoạt động như một ligase, VirD2 không chỉ có khả năng cắt DNA mạch đơn tại trình tự của bờ phải mà còn có thể nối DNA mạch đơn sau khi cắt vào đầu 3‟ của phân tử DNA khác đã được hình thành trước.
Tuy nhiên, các nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các yếu tố khác của thực vật cũng liên quan đến việc nối và gắn xen của T-DNA. Hoạt tính này đã được tìm thấy trong dịch chiết tế bào BY-2 của cây thuốc lá.
Mặc dù vai trò của các gen vir ở Ti-plasmid đã được xem như đóng vai trò chủ chốt trong sự chuyển nạp thì nhiều gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium cũng cần thiết cho tiến trình này như các gen tạo ra exopolysaccharide, các gen biến đổi và tiết (psc/exoc, chvB) và các gen có vai trò khác trong sự gắn dính vi khuẩn vào tế bào thực vật (gen att), các gen tạo ra chất vận chuyển đường liên quan đến sự cảm ứng gen vir (chvE), gen điều hòa cảm ứng gen vir (chvD) và vận chuyển T-DNA (acvB). Các gen khác như miaA cũng có thể đóng một vai trò nhỏ trong quá trình chuyển nạp.
CHƢƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Các giống mía đƣợc sử dụng