Cũng tương tự như việc khảo sát sự hình thành chồi từ giống mía VN84 – 4137, đối với giống mía Suphanburi 7 của Thái Lan cũng cho kết quả tương tự nhưng thấp hơn. Biểu hiện là những chồi đầu tiên hình thành được quan sát vào ngày thứ 13 – 15 sau khi cấy. Cùng 1 thời gian nuôi cấy nhưng số chồi trung bình ở 1 mẫu và chiều cao của chồi là thấp hơn so với giống mía VN84 – 4137 (bảng 9). Có thể thấy rõ rằng ở nghiệm thức số 1 (nồng độ BAP và NAA lần lượt là 2 và 0,1 mg/l), tất cả các mẫu đều tạo chồi và đây được chọn là môi trường tối ưu để tái sinh chồi trong nghiên cứu này. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Bảng 9: Số liệu khảo sát sự tái sinh chồi của giống mía Suphanburi 7
Tên NT Tổng số mẫu/ nghiệm thức Số mẫu tạo chồi % số mẫu tạo chồi Số chồi trung bình/mẫu
Chiều cao của chồi (cm) TL ĐC 30 14 46,67C ± 5,80 8,21 ± 2,19 0,1 – 0,4 TL 1 30 100A 22,77 ± 3,84 0,3 – 1,0 TL 2 28 93,33A ± 5,80 11,54 ± 3,18 0,3 – 0,7 TL 3 24 80,0B ± 10,0 17,96 ± 3,87 0,1 – 0,5 TL 4 16 53,33C ± 5,80 9,19 ± 2,83 0,1 – 0,3
*: các chữ cái A, B, C, D trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng. Mức ý nghĩa p = 0,05.
Hình 32: Các mẫu tái sinh tạo chồi của giống mía Suphanburi 7 ở môi trường số 1 (2 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA) và môi trường số 4 (2 mg/l BA và 1,5 mg/l NAA)
Qua kết quả ở trên, có thể cho rằng việc nuôi cấy để tạo mô sẹo càng khó khăn thì việc tái sinh chồi càng đơn giản. Khi khảo sát sự hình thành chồi bằng việc kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng (auxin và cytokinin), ở cùng một nồng độ của cytokynin
(BAP), khi nồng độ của auxin (NAA) càng cao thì sự hình thành chồi bị hạn chế, thay vào đó là sự tăng sinh mô sẹo. Qua quan sát, có thể dễ dàng nhận thấy các khối mô sẹo ở những nghiệm thức có nồng độ auxin cao, số lượng chồi hình thành là rất ít, và xuất hiện những mô sẹo mới.
Hình 33: Khối mô sẹo tái sinh chồi nhiều sau 30 ngày
Theo một số nghiên cứu, Kambaska Kumar Behera và cs (2009) đã cho thấy sự kết hợp của BAP 2,0 mg/l và NAA 0,5 mg/l hoặc IBA 0,5 mg/l là điều kiện tối ưu để hình thành cụm chồi khi nuôi cấy mô sẹo mía Nayana, tương ứng với mỗi môi trường trên là 90 và 92% số mẫu cấy mô sẹo cho chồi nhưng đối với sự kết hợp của BAP và IBA luôn cho số lượng chồi và chiều cao của chồi cao hơn [17]. Hay trong một nghiên cứu khác của M.Z. Karim và cs (2002) qua nghiên cứu trên 2 đối tượng mía là lsd – 28 và lsd – 16 cho thấy sự kết hợp của BAP 1 mg/l và NAA 0,5mg/l cho kết quả là cao nhất (tương ứng là 89 và 95% số mẫu cấy là mô sẹo hình thành chồi) khi khảo sát sự kết hợp của 2 chất này lên sự hình thành chồi, nhưng kết quả này vẫn thấp hơn khi kết hợp BAP 1 mg/l và IBA 0,5 mg/l (% số mô sẹo tái sinh chồi của 2 giống lsd – 28 và lsd – 16 lần lượt là 92 và 100%) [18]. Ramanand và cs (2006) lại thấy rằng sự kết hợp của BAP 1,0 mg/l với Kn 1,0 mg/l và NAA 0,5 mg/l lại là môi trường thích hợp để hình thành chồi từ mô sẹo của giống mía S – 3807/99 [16]. P.J. Larkin (1982) đã công bố rằng môi trường có bổ sung và mg/l BAP và 0,5 mg/l IAA là điều kiện tối ưu để hình thành chồi [20]. Hay Hamad Rashid và cs (2009) qua nghiên cứu khảo sát sự kết hợp của GA3 và kinetin lên sự hình thành và phát triển chồi từ mô sẹo mía trên đối tượng là giống mía HSF – 240 đã ghi nhận ở môi trường có nồng độ 1,0 mg/l GA3 và 0,5 mg/l kinetin cho kết quả tái sinh tối ưu [15]. Và rất nhiều nghiên cứu khác về ảnh hưởng của việc kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng (cytokinin và auxin) lên sự hình thành và phát triển chồi mía từ mô sẹo đã cho thấy cytokinin trong môi trường nuôi cấy là yếu tố kích thích mạnh sự tái biệt hóa (redifferentiation) hình thành chồi.
4.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo
Để khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo đối với giống mía của Việt Nam (VN84 – 4137), các mẫu cấy lá non được cấy và môi trường tối ưu cho sự hình thành mô sẹo. Vào khoảng ngày thứ 14 sau khi cấy, các mẫu này sau khi đã bắt đầu hình thành mô sẹo sẽ được cấy chuyển vào môi trường tối ưu cho sự hình thành mô sẹo (môi trường MS + 4 mg/l 2,4 D) nhưng có bổ sung những nồng độ khác nhau từ 0 – 5 mg/l PPT. Sau khoảng thời gian 30 ngày, kết quả được ghi nhận như sau:
Sự hình thành và tăng sinh mô sẹo giảm dần theo nồng độ tăng dần của PPT trong môi trường khảo sát. Ở môi trường không bổ sung PPT, ở hầu hết các mẫu cấy mô sẹo đều tăng sinh và phát triển tốt, chỉ một phần nhỏ mô sẹo bị bở, nhầy nhớt. Môi trường số 4 (4 mg/l PPT) và 5 (5 mg/l PPT), các mô sẹo bị hỏng hoàn toàn, các mẫu cấy ban đầu cũng bị đen, đặc biệt là ở môi trường số 5. Như vậy, nồng độ PPT càng cao càng ảnh hưởng đến sự hình thành và tăng sinh mô sẹo, làm cho mô sẹo bị hư, nhầy nhớt, mẫu cấy cũng bị hỏng. Trong thí nghiệm này, nhận thấy PPT ở nồng độ 4 – 5 mg/l đã gây ức chế sự hình thành, tăng sinh/gây chết mô sẹo. Do vậy, 4 mg/l là nồng độ được dùng để sàng lọc tế bào trong nghiên cứu chuyển gen.
Bảng 10: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo
Tên NT Tổng số mẫu/ nghiệm thức
Số mẫu hình thành mô sẹo mới
% số mẫu hình thành mô sẹo mới PPT 0 60 59 98,33 ± 2,37 PPT 1 31 51, 67 ± 2,37 PPT 2 22 36,67 ± 4,70 PPT 3 12 20,0 ± 0,00 PPT 4 0 0 PPT 5 0 0
*: các chữ cái A, B, C, D trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng. Mức ý nghĩa p = 0,05.
Hình 36: Các nghiệm thức của quá trình khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo
4.4 Thí nghiệm chuyển gen
Thí nghiệm chuyển gen này chỉ được thực hiện trên giống VN84 – 4137.
4.4.1 Sự biểu hiện của gen gusA
Hai ngày sau khi rửa các mẫu bằng dung dịch cefotaxime và cấy vào môi trường nuôi cấy MS (đường 30 g/l, casein 500 mg/l) có bổ sung 4 mg/l 2,4 – D, một số mẫu cấy được đem nhuộm với dung dịch X-Gluc (xử lý qua đêm ở 37C) nhằm mục đích xem xét sự biểu hiện tạm thời của gen gusA. Sau khi nhuộm, đã ghi nhận được trên bề mặt một số cụm mô sẹo có các vị trí mô có màu xanh chàm (indigo) ở dạng từng điểm riêng rẽ hoặc ở dạng lan tỏa (hình 39); điều này cho thấy thí nghiệm chuyển gen đã có diễn biến theo chiều hướng tích cực. Như chúng ta đã biết, sự biểu hiện tạm thời tốt của gen, ở đây được ghi nhận đối với gen gusA, là tiền đề để đánh giá sự biểu hiện bền vững (stable expression) của gen chuyển ở giai đoạn sau. Theo nhiều nghiên cứu, biểu hiện bền vững của gen có tỷ lệ thuận với biểu hiện tạm thời của gen xét về góc độ phần trăm biểu hiện.
4.4.2 Tăng sinh mô sẹo sau chuyển gen trên môi trƣờng chứa chất chọn lọc PPT
Sau giai đoạn đồng nuôi cấy và được rửa bằng dung dịch cefotaxime, các cụm mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường có chứa PPT với nồng độ đã được xác định ở giai đoạn trước - gây chết hoàn toàn đối với tế bào không chuyển gen. Như vậy, những cụm mô sẹo hình thành mới và có khả năng tăng sinh nhanh trên môi trường chọn lọc đạt ngưỡng rất có thể là những cụm mô chuyển gen. Trong nghiên cứu này, đã phát hiện được 03 cụm mô sẹo hình thành mới và tăng sinh trên môi trường chứa PPT sau 4 tuần nuôi cấy (hình 40, 41); qua đánh giá sơ bộ thì tỷ lệ sống sót này là không cao. Các cụm mô này sẽ được cấy chuyển qua nhiều chu kỳ chọn lọc nhằm thu các dòng (line) mô có khả năng tăng sinh tốt trước khi cấy chuyển sang môi trường tái sinh tạo cây chuyển gen.
Hình 39: Khối mô sẹo mới hình thành sau chuyển gen.
Đến nay, có nhiều phương pháp chuyển gen vào mô tế bào thực vật, nhưng 2 phương pháp thông dụng nhất vẫn là phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium và phương pháp bắn gen do ưu nhược điểm vốn có ở từng loại phương pháp. Đối với cây mía đường, vấn đề được quan tâm nhiều là sâu bệnh và chất lượng mía (độ đường). Trên thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu xoay quanh việc thực hiện chuyển gen vào cây mía, đặc biệt là gen kháng sâu, đa số là bằng phương pháp bắn gen, nhưng kết quả chuyển gen thu được nhìn chung là chưa cao.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Sự hình thành mô sẹo, trên 2 đối tượng mía là VN84 – 4137 (Việt Nam) và Suphanburi 7 (Thái Lan), tốt nhất trên môi trường MS (có 30 g/l saccharose, 500 mg/l casein) có bổ sung 4 mg/l 2,4 – D.
Môi trường tối ưu cho quá trình tái sinh tạo chồi của 2 giống mía trên qua khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp BA và NAA là môi trường MS (có 30 g/l saccharose) có bổ sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA.
Khảo sát ảnh hưởng của PPT cho thấy nồng độ tối thiểu ức chế sự hình thành, sự tăng sinh và gây chết mô sẹo là 4 mg/l (trên môi trường MS có 30 g/l saccharose, 500 mg/l casein, 4 mg/l 2,4 – D) (đối với giống mía VN84 – 4137).
Qua bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIA(c), đã nhận được 03 - 04 cụm mô sẹo hình thành mới trên môi trường có 4 mg/l PPT. Sự biểu hiện tạm thời của gen gusA đã được thực hiện với kết quả dương tính (đối với giống mía VN84 – 4137).
5.2 Đề nghị
Một số vấn đề sau đây cần được tiếp tục thực hiện:
Chọn lọc các cụm mô trên môi trường có PPT thêm nhiều chu kỳ, tái sinh chồi/cây chuyển gen và trồng các dòng cây chuyển gen ra vườn ươm.
Ngoài thử nghiệm GUS, các phương pháp như PCR, Southern blot,… cần được thực hiện để khẳng định thể chuyển gen.
Khảo sát khả năng kháng sâu của các dòng mía mang gen cryIA(c).
Nghiên cứu chuyển gen đối với giống mía khác (ví dụ Suphanburi 7 – Thái Lan) nhằm tạo nguồn nguyên liệu mía kháng sâu hướng đích phục vụ nghiên cứu và sản xuất thâm canh trong tương lai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006. Công nghệ tế bào. NXB ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh.
[2] Thái Nghĩa, 2001. Mía đường Việt Nam. NXB Nông Nghiệp.
[3] Trần Văn Sõi, 2001. Kỹ thuật trồng mía ở vùng đồi núi. NXB Nông Nghiệp. [4] Trần Quốc Dung, 2006. Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật). Đại học
Huế.
[5] Nguyễn Hoàng Lộc, 2007. Nhập môn công nghệ sinh học. NXB Đại học Huế. [6] Cao Anh Đương, 2008. Báo cáo tham luận Hội nghị Phát triển sản xuất Mía
đường khu vực Đông Nam bộ, Tây Ninh. Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
Mía đường, Viện Khoa học và Công nghệ Miền Nam (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam).
[7] Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2003. Atlat côn trùng hại cây trồng nông nghiệp ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 97.Đỗ Ngọc Diệp,
2001. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến vòng đời sâu đục thân 4 vạch. Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 2/2001, tr. 3 – 7.
[8] Đỗ Ngọc Diệp, 2006. Nghiên cứu sự thay đổi thành phần chủng loài, quy luật phát sinh, gây hại của nhóm sâu đục thân hại mía và các biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp trong chuyển dịch cơ cấu cây trồng ở miền Đông Nam bộ.
Báo cáo tổng kết đề tài trọng điểm cấp Bộ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Bình Dương.
[9] Viện Bảo vệ thực vật, 1976. Kết quả điều tra côn trùng cơ bản trên cây trồng
nông nghiệp năm 1967 – 1968. Nhà xuất bản Nông thôn, Hà Nội, tr. 451 – 455.
[10] Cao Anh Đương, 2007. Cây mía – Sugarcane crop. Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển Mía đường.
[11] Lakshmanan P, Geijskes RJ, Aitken KS, Grof CLP, Bonnett GD, Smith GR, 2005. Invited review: Sugarcane biotechnology: The challenges and opportunities. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 41: 345 – 363.
[12] Al – Jibouri AAM, Al – Shamarri IA, 2009. Response of three sugarcane (Saccharum officinarum L.) genotypes for callus formation and salinity tolerance. The 2nd Kurdistan Conference on Biological Sciences, J. Duhok Univ,
Vol.12, No.1 (Special Issue), pp 74 – 79.
[13] Asad S, Arshad M, Mansoor S, Zafar Y, 2009. Effect of various amino acids on shoot regeneration of sugarcane (Sacchrum officinarum L.). African Journal of
Biotechnology, Vol. 8, pp. 1214 – 1218.
[14] Rashid H, Alikhan S, Zia M, Chaudhary MF, Hanif Z, Chaudhary Z, 2009. Callus induction and regeneration in elite sugarcane cultivar HSF – 240. Pak. J.
Bot., 41: 1645 – 1649.
[15] Kureel RN, Subhanand N, Lal M, Singh S.B, 2006. Plantlet regeneration through leaf callus culture in sugarcane. Sugar tech 8: 85 – 87.
[16] Behera K.K, Sahoo S., 2009. Rapid in vitro micro propagation of sugarcane (Saccharum officinarum L. cv – Nayana) through callus culture. Nature and Science, 7: ISSN 1545 – 0740.
[17] Karim MZ, Amin MN, Hossain MA, Islam S, Hossin F, Alam R., 2002. Micropropagation of two sugarcane (Saccharum officinarum) varieties from callus culture. Online journal of Biological Science 2: 682 – 685.
[18] Khalil S.M, 2001. Regeneration via somatic embryogenesis and microprojectile mediated co–transformation of sugarcane. Agricultural Genetic Engineering Research Institute (AGERI), ARC, 12619, Giza, Egypt.
[19] Larkin P.J, 1982. Sugarcane tissue and protoplast culture. Plant Cell Tissue Organ Culture 1: 149 – 164.
[20] Vázquez Molina DE, De Los Santos A, Lecona Guzmán KA, Súmano Muniz O, Velázquez Méndez M, Rincón Rosales R, Olivallaven MA, Dendooven L, Gutiérrez – Miceli FA, 2005. Sugar cane buds as an efficient explant for plantlet regeneration. Biologia plantarum 49: 481 – 485.
[21] Tiel K, Enríquez GA, Ceballo Y, Soto N, Fuentes AD, Ferreira A, Coll Y, Pujol M, 2006. Development of a system for rapid plant regeneration from in vitro sugarcane (Saccharum officinarum L.) meristematic tissue. Plant Division,
Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB), Havana 10600, Cuba.
[22] Chengalrayan K, Gallo - Meagher M, 2001. Effect of various growth regulators on shoot regeneration of sugarcane. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 37: 434 –
439.
[23] Chengalrayan K, Abouzid A, Gallo - Meagher M, 2005. In vitro regeneration of plants from sugarcane seed – derived callus. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 41: 477–482.
[24] Ather A, Khan S, Rehman A, Nazir M, 2009. Optimization of the protocols for callus induction, regeneration and acclimatization of sugarcane cv. Thatta – 10.
Pak. J. Bot. 41: 815 – 820.
[25] Arencibia A, Vázquez RI, Prieto D, Téllez P, Carmona ER, Coego A, Hernández L, De la Riva GA, Selman - Housein G, 1997. Transgenic sugarcane plants resistant to stem borer attack. Molecular Breeding 3: 247–255.
[26] Meyer GM, Keeping MB, Watt DA, Cassim TN, Botha FC, Huckett BI, 2000. A wild – type insecticidal gene from a bacterium is poorly expressed in sugarcane: an overview. Proc S Afr Sug Technol Ass. 74: 184 – 185.
[27] Arencibiaa AD, Carmona ER, Téllez P, Chan MT, Yu SM, Trujillo LE, Oramas P, 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research 7: 213 – 222. [28] http://giongmia.wordpress.com/download/
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Số liệu thô số mẫu tạo mô sẹo từ lá mía non của giống mía VN84 –
4137 sau 45 ngày nuôi cấy.
NT VN 0 VN 1 VN 2 VN 3 VN 4 VN 5
Số
mẫu 0 0 0 3 3 5 10 9 9 11 11 12 17 18 18 18 17 18
Phụ lục 2: Số liệu thô số mẫu tạo mô sẹo từ lá mía non của giống mía
Suphanburi 7 sau 45 ngày nuôi cấy.
NT TL 0 TL 1 TL 2 TL 3 TL 4 TL 5
Số
mẫu 0 0 0 17 16 16 17 15 19 18 18 19 20 20 20 20 20 20
Phụ lục 3: Số liệu thô số mô sẹo tạo chồi của giống mía VN84 – 4137.
NT VN R0 VN R1 VN R2 VN R3 VN R4