Gen cryIAc mã hóa cho một loại độc tố delta – endotoxin có nguồn gốc từ vi
khuẩn Bacillus thuringiensis. Loại protein này theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể côn trùng. Tại ruột giữa, dưới tác động của môi trường kiềm và một protease, tiền độc tố bị phân hủy thành những phân tử nhỏ có hoạt tính độc, liên kết với chất nhận glycoprotein tại vị trí đặc hiệu trên màng nguyên sinh của tế bào biểu mô ruột giữa
và proton bị phá vỡ, nước đi vào tế bào ruột làm chúng sưng lên, phân hủy. Thiếu sự điều hòa ion còn gây ra hiện tượng liệt cơ ở ruột và các phần của miệng. Kết quả sâu ngừng ăn và chết.
Protein nội độc tố tách chiết từ vi khuẩn B. thuringiensis từ lâu đã được sử dụng để diệt sâu ở dạng chế phẩm sinh học. Tuy nhiên, chế phẩm chỉ có thể chứa tinh thể protein độc tố do vi khuẩn trực tiếp sản xuất, và không có tính lưu dẫn, khó xâm nhập – hoạt động ở những phần bên trong cây (ví dụ: lõi), nhạy cảm với tác động của môi trường. Vì vậy, cho đến nay, tỷ lệ sử dụng chế phẩm Bt trên toàn thế giới
chưa đạt 1% lượng thuốc trừ sâu. Hơn 90% trong số đó là chế phẩm dạng đơn. Ngược lại, trước khi đưa gen Bt vào cây trồng, người ta có thể sửa đổi, cắt đi một phần của đoạn gen nguyên thủy nhằm nâng cao hiệu quả thể hiện của gen trong cây hoặc chuyển nhiều gen Bt khác nhau vào cùng một cây để mở rộng khả năng
kháng được nhiều loại côn trùng khác nhau của cây. Mặt khác, đối với sự tấn công của một số bệnh và sâu hại, khi triệu chứng có thể quan sát được trên đồng ruộng thì việc phòng trừ đã trễ, không còn đạt hiệu quả. Do đó, gen kháng sâu được đưa hẳn vào cây đã tạo cho cây khả năng chủ động ngăn cản từ đầu sự tấn công của côn trùng và truyền lại được cho thế hệ sau đặc tính này.
3.3 Phƣơng pháp
Thành phần môi trường Murashige và Skoog (1962) (môi trường MS) [1]: Khoáng đa lượng (macro): 50 ml/l
Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l)
NH4NO3 1650,00
KNO3 1900,00
CaCl2.2H2O 440,00
MgSO4.7H2O 370,00
KH2PO4 170,00
Khoáng vi lượng (micro): 2 ml/l
Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l)
ZnSO4.7H2O 8,60 H3BO3 6,20 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 Vitamin: 2 ml/l FeEDTA: 5 ml/l Đường: 30 g/l pH: 5,8
3.3.1 Khảo sát sự hình thành mô sẹo
Để khảo sát sự hình thành mô sẹo mía, môi trường được sử dụng là môi trường MS đặc (10 g/l agar) có bổ sung thêm hỗn hợp acid amin nhằm mục đích tăng khả năng hình thành mô sẹo [18]. Hỗn hợp acid amin được chọn ở đây là casein với nồng độ 500 mg/l. Auxin sử dụng là 2,4 – D. Các mẫu sau khi được khử trùng sẽ được cấy vào các đĩa petri, cụ thể như sau:
Số nghiệm thức (số NT): 6 Số đĩa/1 nghiệm thức: 2
Số mẫu/1 đĩa: 10 Số lần lặp: 3
Tổng số mẫu/1 lần lặp/1 nghiệm thức: 20 Tổng số mẫu/1 nghiệm thức: 60
Khảo sát sự hình thành mô sẹo mía trên môi trường MS đặc (có 500 mg/l casein) với các nồng độ khác nhau của 2,4 – D như sau:
MC 0 1 2 3 4 5
Nồng độ 2,4 – D (mg/l) 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
3.3.2 Khảo sát sự tạo chồi
Ở đa số các loài thực vật, sự hình thành chồi cần sự kết hợp của auxin và cytokinin. Theo một số tài liệu nghiên cứu trước cho thấy sự kết hợp giữa BA với NAA hoặc IBA trong khảo sát sự hình thành chồi mía thu được kết quả là tốt nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của cytokinin (BAP) lên sự tái sinh chồi với nồng độ được cố định là 2 mg/l kết hợp với auxin (NAA) nồng độ từ 0,1 – 1,5 mg/l. Môi trường sử dụng để khảo sát sự hình thành chồi mía (vẫn là môi trường MS, 10 g/l agar) được thể hiện như sau:
MT 0 1 2 3 4
Nồng độ BA (mg/l) 0 2,0 2,0 2,0 2,0
Nồng độ NAA (mg/l) 0 0,1 0,5 1,0 1,5
MT là ký hiệu môi trường nuôi cấy tạo chồi mía. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp thực hiện: Các mẫu là mô sẹo được chọn sau quá trình khảo sát tạo sẹo sẽ được cấy vào bình tam giác với cách bố trí sau:
Số nghiệm thức (số NT): 5 Số đĩa/1 nghiệm thức: 2
Số mẫu/1 bình: 5 Số lần lặp: 3
Tổng số mẫu/1 lần lặp/1 nghiệm thức: 10 Tổng số mẫu/1 nghiệm thức: 30
3.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo
Khảo sát ảnh hưởng của PPT lên khả năng hình thành/tăng sinh mô sẹo nhằm mục đích xác định nồng độ tối thiểu gây ức chế hình thành, tăng sinh/chết mô sẹo và nồng độ này sẽ được sử dụng để chọn lọc mô tế bào chuyển gen. Các nghiệm thức thực hiện trên cơ sở dùng môi trường tối ưu cho sự hình thành mô sẹo được bổ sung PPT với các nồng độ khác nhau từ 0 – 5 mg/l.
MT PPT 0 1 2 3 4 5
Nồng độ PPT (mg/l) 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
MT PPT là ký hiệu môi trường khảo sát sự ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo
Phương pháp thực hiện: các mô sẹo sẽ được cấy vào các đĩa petri với môi trường tương ứng như trên, với cách bố trí sau:
Số nghiệm thức (số NT): 6 Số đĩa/1 nghiệm thức: 2
Số mẫu/1 đĩa: 15 Số lần lặp: 2
3.4 Phƣơng pháp tạo cây chuyển gen
Phƣơng pháp xử lý mẫu mía
Mẫu mía được dùng để nuôi cấy là các phần lá non ở ngọn mía. Các ngọn mía sẽ được tách bỏ phần lá già ở phía ngoài để lộ ra phần lá non bên trong. Phần lá non này sẽ được đem đi khử trùng, phương pháp khử trùng như sau: Các đoạn ngọn sẽ được rửa dưới vòi nước để rửa sạch các bụi phấn và đất cát bám trên lá sau khi tách. Tiếp theo các phần này được cắt thành các mẩu nhỏ hơn có độ dài khoảng 1,5 – 2 cm trong tủ cấy vô trùng. Những mẫu lá non này được xử lý với cồn 70% (v/v) trong khoảng 30 giây – 1 phút. Tiếp tục được xử lý trong nước javel 50% (v/v) trong khoảng 7 – 10 phút, lắc nhẹ rồi đem rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần để sạch javel. Sau đó những khối mẫu này được loại bỏ phần bị hư, cắt và tách từng lớp lá thành những phần có chiều dài từ 1,0 – 1,2 cm, chiều rộng từ 0,3 – 0,4 cm.
Hình 23: Ngọn mía trước khi được khử trùng
Hình 24: Hình dạng mẫu cấy mía
Các mẫu lá được cấy vào môi trường MS bổ sung 500 mg/l casein, 30 g/l sucrose với những nồng độ auxin (2,4-D) khác nhau.
Phƣơng pháp chuyển gen
Các cụm mô sẹo tốt (có khả năng sinh phôi) được chọn để thực hiện nghiên cứu chuyển gen. Các mô sẹo này được ngâm trong dung dịch có chứa vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens có bổ sung acetosyringone (nhằm mục đích kích thích khả
năng chuyển gen của vi khuẩn) trong khoảng 15 – 20 phút. Sau khi ngâm, các mẫu được lấy ra và để ráo trên giấy thấm vô trùng (khoảng 30 phút), sau đó được cấy vào môi trường sau chuyển gen – là môi trường tốt nhất sau khảo sát sự hình thành mô sẹo có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM và được đặt trong tối. Sau 2 – 3 ngày đồng nuôi cấy (co-cultivation) để Agrobacterium phát triển và chuyển gen vào tế bào mô
sẹo, các mẫu được lấy ra và rửa sạch bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime (nồng độ 500 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn. Sau khi rửa, các mẫu được nuôi cấy trên môi trường tối ưu có chứa PPT đã được khảo sát và có bổ sung thêm kháng sinh cefotaxime (nồng độ 500 mg/l).
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ và BIỆN LUẬN 4.1 Thí nghiệm khảo sát sự hình thành mô sẹo
Các mẫu lá non mía sau quá trình khử trùng được cấy vào môi trường có bổ sung những nồng độ auxin (2,4 – D) khác nhau để khảo sát quá trình hình thành mô sẹo. Với mỗi giống mía, sự hình thành và phát triển mô sẹo là khác nhau.
Phương pháp đánh giá lượng mô sẹo hình thành: + Rất ít
++ Ít
+++ Trung bình ++++ Nhiều +++++ Rất nhiều
4.1.1 Sự hình thành mô sẹo của giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam)
Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo ở giống mía VN84 – 4137 đã thu được kết quả như sau. Quan sát cho thấy mô sẹo bắt đầu hình thành vào ngày thứ 12 – 13 sau khi cấy, trước khi hình thành mô sẹo thì có hiện tượng kéo dài của các mẫu. Sự hình thành mô sẹo có thể phân biệt rõ rệt ở các nghiệm thức, đặc biệt là ở các nghiệm thức có nồng độ 2,4 – D từ 4 – 5 mg/l. Sau đây là kết quả thu được sau 45 ngày nuôi cấy tạo mô sẹo mía VN84 – 4137 (bảng 6). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 6: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của 2,4 – D lên sự hình thành mô sẹo ở giống mía VN84 – 4137.
Tên NT Tổng số mẫu/ nghiệm thức số mẫu hình thành mô sẹo % số mẫu hình thành mô sẹo % số mô sẹo bở % số mẫu nâu Đánh giá VN 0 60 0 0,00E 0 100 VN 1 11 18,33D ± 5,75 13.33 86,67 + VN 2 28 46,67C ± 2,90 13,33 53,33 + VN 3 34 56,67B ± 2,90 13,33 25 + VN 4 53 88,33A ± 2,90 10 16,67 +++ VN 5 53 88,33A ± 2,90 10 20 +++
*: các chữ cái A, B, C, D trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng. Mức ý nghĩa p = 0,05.
Kết quả sau khi đã xử lý bằng chương trình thống kê MSTATC cho thấy rằng các kết quả có sự khác biệt bắt đầu từ nghiệm thức không bổ sung 2,4 – D. Giữa nghiệm thức có chứa 4 hoặc 5 mg/l 2,4 – D thì không thấy sự khác biệt. Do vậy, theo chúng tôi, nồng độ 2,4 – D được xem là thích hợp cho sự hình thành mô sẹo ở giống mía VN84 – 4137 là 4 mg/l.
Vào khoảng tuần thứ 4 có thể nhận thấy được các mẫu lá non của giống mía này có hiện tượng đen dần, và hiện tượng hóa đen giảm dần với nồng độ tăng dần của 2,4 – D. Đặc biệt, ở môi trường không bổ sung 2,4 – D các mẫu cấy bị hỏng hoàn toàn, không có hiện tượng hình thành mô sẹo. Sự hình thành mô sẹo tăng dần theo nồng độ 2,4 – D đến 4 – 5 mg 2,4 – D (hình 25). Nhìn chung, lượng mô sẹo hình thành là không nhiều. Nhận thấy có sự phát sinh rễ ở mẫu cấy nhưng không đáng kể. Dường như không thấy hiện tượng làm nâu môi trường từ mẫu cấy.
Hình 25: Các nghiệm thức của quá trình khảo sát sự hình thành mô sẹo của giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam)
Trong quá trình nuôi cấy, trong số các mô sẹo hình thành có những cụm mô sẹo trở nên bở, nhầy nhớt. Có những mô sẹo có dạng chắc (compact) và vàng hoặc trắng được cho là mô sẹo tốt và được thu nhận để phục vụ cho nghiên cứu ở các giai đoạn sau.
Hình 26: Mô sẹo từ giống mía VN84 – 4317 A: Mô sẹo chắc, vàng
4.1.2 Sự hình thành mô sẹo của giống mía Suphanburi 7 (Thái Lan)
So với giống mía VN84 – 4137 của Việt Nam, giống mía Suphanburi 7 của Thái Lan cũng cho kết quả tạo mô sẹo tương tự, theo đánh giá khách quan thì mô sẹo hình thành sớm hơn và nhiều hơn. Cụ thể, vào ngày thứ 6 – 7 sau khi cấy đã có thể thấy những mô sẹo đầu tiên hình thành. Sau 45 ngày nuôi cấy, ở nghiệm thức không bổ sung 2,4 – D, hoàn toàn không thấy sự xuất hiện của mô sẹo, các mẫu cấy bị đen và hỏng; ở các nghiệm thức còn lại, sự hình thành mô sẹo cũng tăng dần theo nồng độ tăng dần của 2,4 – D nhưng với tỷ lệ hình thành mô sẹo cao hơn. Đặc biệt là ở các nghiệm thức có nồng độ 2,4 – D từ 4 – 5 mg/l, tất cả các mẫu cấy đều tạo mô sẹo, các mô sẹo hình thành có dạng chắc, vàng, lượng mô sẹo bị nhầy nhớt ít hơn so với giống VN84 – 4137 (bảng 7). Hoàn toàn không thấy sự phát sinh rễ, hiện tượng hóa nâu cũng ít. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Bảng 7: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của 2,4 – D lên sự hình thành mô sẹo ở giống mía Suphanburi 7.
Tên NT Tổng số mẫu/ nghiệm thức số mẫu hình thành mô sẹo % số mẫu hình thành mô sẹo % số mô sẹo bở % số mẫu nâu Đánh giá TL 0 60 0 0,00D 0 100 TL 1 49 81,67C ± 2,90 31,67 0 +++ TL 2 51 85,00BC ± 10,0 21,67 0 +++ TL 3 55 91,67B ± 2,90 21,67 0 ++++ TL 4 60 100A 3,33 0 +++++ TL 5 60 100A 25 0 +++++
*: các chữ cái A, B, C, D trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng. Mức ý nghĩa p = 0,05.
Qua quan sát suốt quá trình nuôi cấy, các mẫu mía của giống mía Suphanburi 7 này đều không bị hư hỏng (trừ những mẫu cấy trên môi trường không bổ sung 2,4 – D), nhưng lại thấy hiện tượng hóa nâu do các mẫu cấy tiết ra, điều này có thể ảnh
hưởng đến sự hình thành và tăng sinh mô sẹo. Nếu không có biện pháp xử lý, các mô sẹo này sẽ ức chế tăng trưởng.
Hình 27: Các nghiệm thức của quá trình khảo sát sự hình thành mô sẹo của giống mía Suphanburi 7 (Thái Lan)
Hình 28: Mô sẹo của giống mía Suphanburi 7 – Thái Lan A: Mô sẹo chắc
B: Mô sẹo bở, nhầy nhớt
C: Mẫu cấy bị hóa nâu của giống Suphanburi 7 – Thái Lan Ở một số nghiên cứu trước về nuôi cấy tạo mô sẹo mía từ lá non, Abed Aljasim M. Al – Jibouri và Ibrahim A. Al – Shamarri đã khảo sát trên 3 giống mía (Co.J.64, Co.J.86 và Missan) và cho chung một kết quả là sự cảm ứng sự hình thành mô sẹo mía từ lá non trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/l 2,4 – D cho hiệu quả cao nhất [13]. Ramanand và các cộng sự qua khảo sát ảnh hưởng của các loại auxin lên sự hình thành mô sẹo từ lá non của giống mía S – 3807/99 đã thu được kết quả tốt nhất là 67,3% số mẫu cấy hình thành mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/l 2,4 – D [16]. Gần đây, năm 2009, Kambaska Kumar Behera và Santilata Sahoo cũng đã khảo sát sự hình thành mô sẹo từ lá mía non của giống mía Nayana trên môi trường MS có bổ sung 2,4 – D và thu được kết quả sự hình thành mô sẹo là 100% trên môi trường có nồng độ 2,4 – D là 2,5 mg/l [17].
có bổ sung 10% nước dừa với những nồng độ khác nhau của 2,4 – D, kết quả cho thấy ở nồng độ 3 mg/l 2,4 – D thì mô sẹo được hình thành nhiều nhất. Hamid Rashid và các cộng sự qua nghiên cứu sự ảnh hưởng của các nồng độ 2,4 – D khác nhau lên sự hình thành mô sẹo mía HSF 240 từ các mắt chồi đã cho thấy nồng độ 2,4 – D tối ưu để hình thành mô sẹo mía là từ 2 – 3 mg/l [14].
Từ những dẫn chứng trên, chúng ta có thể nhận thấy rằng, đối với mỗi một điều kiện nuôi cấy hoặc giống mía sử dụng mà thu được những kết quả khác nhau.
Qua thí nghiệm và các nghiên cứu khác cho thấy, cùng một điều kiện nuôi cấy tạo mô sẹo nhưng sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng auxin lên các giống mía là khác nhau. Ở môi trường không bổ sung auxin (2,4 – D), ở các mẫu cấy hoàn toàn không có hiện tượng hình thành mô sẹo, điều này cho thấy vai trò quan trọng của auxin 2,4 – D đối với quá trình phản biệt hóa (dedifferentiation) tạo mô sẹo trong nuôi cấy mô in vitro.
4.2 Thí nghiệm khảo sát sự hình thành chồi (tái sinh)
Sau khi có được mô sẹo, một phần mô sẹo được dùng cho giai đoạn tái sinh tạo