Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng LC MS trên MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG

MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG

NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC

BẰNG LC- MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG

MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG

NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC

BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ : 60720410

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn ThịKiều Anh, người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên

Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài Em cũng xin cảm ơn quỹ Nafosted đã tài trợ một phần kinh phí để em thực hiện đề tài này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động viên em hoàn thành luận văn

Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng không trách khỏi những thiếu sót, em kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon 3

1.1.1 Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon 3

1.1.2 Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu 5

1.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ 6

1.2.1 Sắc ký lỏng 6

1.2.2 Khối phổ 7

1.2.3 Một số kỹ thuật ghi phổ 11

1.2.4 Ứng dụng của sắc ký lỏng 2 lần khối phổ 12

1.2.5 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký 12

1.3 Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.2.1 Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn 15

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử 16

2.3.2 Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký 17

2.3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 18

2.3.4 Thẩm định phương pháp 18

2.3.5 Ứng dụng phân tích mẫu thực 20

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Xây dựng quy trình phân tích 21

3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo khối phổ 21

3.1.2 Khảo sát các điều kiện của sắc ký 23

3.1.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29

3.1.4 Quy trình phân tích 33

3.2 Đánh giá phương pháp 35

3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống 35

3.2.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 36

3.2.3 Độ tuyến tính 39

3.2.4 Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp 40

3.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn đ ịnh lượng 43

3.3 Ứng dụng quy trình, xác định dư lượng kháng sinh có trong nước thải công nghiệp dược 46

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 48

4.1 Về phương pháp xử lý mẫu 48

4.2 Về phương pháp phân tích 48

4.3 Về thẩm định phương pháp 50

4.4 Về ứng dụng phương pháp 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

chromatography)HPLC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (High performance liquid chromatography

–Mas Spectrometry)

tR Thời gian lưu

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

IS Chuẩn nội (Internal Standard)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

AOAC Association of Official Agricultủal Chemists

PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

API Ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization)ESI Ion hóa tia điện (Electrospray Ionizaton)

APCI Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure

Chemical Ionization) APPI Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric

Pressure Photoionization)USP 38 Dược điển Mỹ 38 (The United States Pharmacopoeia) (bản

online)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon 48

Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu ……5

Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS 23

Bảng 3.2 : Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích chiết 31

Bảng 3.3: Hiệu suất chiết các kháng sinh khi dùng các dung môi rửa giải khác nhau 32

Bảng 3.4 : Kết quả xác định độ thích hợp hệ thống 36

Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 39

Bảng 3.6.a : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức LQC) 41

Bảng 3.6.b : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức MQC) 42

Bảng 3.6.c : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức HQC) 43

Bảng 3.7 : Kết quả giá trị LOD, LOQ của phương pháp 45

Bảng 3.8 : Kết quả phân tích mẫu nước thải ở một số cơ sở sản xuất 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống LC- MS 6

Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI 9

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba 10

Hình 3.1: Phổ đồ của các chất phân tích 22

Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột SB- C18 với các thể tích tiêm mẫu 1, 5, 10 µl 24

Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột Eclipse- C18 với các thể tích tiêm mẫu 5, 10, 20 µl 25

Hình 3.4: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khảo sát các tốc độ dòng 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút 27

Hình 3.5: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát pha động 29

Hình 3.6: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát thể tích chiết 31

Hình 3.7: Biểu đồ hiệu suất chiết của các dung môi rửa giải 33

Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu 38

Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định giá trị LOD, LOQ của phương pháp 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thực trạng kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam với gánh nặng về các bệnh nhiễm khuẩn và chi phí bắt buộc cho việc thay đổi kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới Trong khi các kháng sinh mới ra đời ngày càng ít, thì việc kháng các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế

hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người Nguyên nhân dotrình độ dân trí còn hạn chế, lạm dụng kháng sinh liều cao, kháng sinh mạnh,

sử dụng kháng sinh mà không có chỉ định của bác sĩ làm gia tăng tỷ lệ kháng kháng sinh Ngoài ra, lượng kháng sinh tồn dư trong nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay từ các công ty sản xuất dược phẩm cũng là nguyên nhân quan trọng dẫn tới sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn [7] Theo kết quả nghiên cứu

ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng (2009- 2010)

về tình trạng kháng thuốc kháng sinh, tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm cephalosporin thế hệ 3,4 là 66-83%, fluoroquinolon 60%, imipenem 35% [9]

Theo qui định của cục Quản lý Dược hiện nay, các công ty sản xuất thuốc nói chung và các công ty sản xuất kháng sinh nói riêng muốn sản xuất kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP với hệ thống xử lý nước thải Tính từnăm 2009 đến tháng 7/2014, theo số liệu của Cục quản lý Dược Việt Nam, sốkháng sinh sản xuất trong nước nhóm quinolon được cấp số đăng ký chiếm tỷ

lệ tương đối so với các kháng sinh nhóm khác Nếu như kháng sinh Ciprofloxacin có 49 lượt, Ofloxacin có 31 lượt cấp phép đăng kí sản xuất thì Cefadroxil có 27 lượt, Metronidazol 37 lượt được cấp số đăng kí Tuy vậy, theo quy định hiện hành về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường của

Bộ Tài nguyên và Môi trường năm 2011, lại chưa có quy định giới hạn mức hàm lượng cụ thể của kháng sinh trong nước thải [3] Trong khi đó, chỉ một lượng nhỏ tồn dư kháng sinh trong môi trường tích tụ lâu ngày sẽ làm biến

đổi gen của các vi sinh vật Nguyên nhân này góp phần làm gia tăng tỷ lệkháng kháng sinh ở nước ta Vì vậy, vấn đề cấp thiết đặt ra là phải có phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải của các công ty sản xuất nhằm hạn chế sự phát tán của kháng sinh trong môi trường.

Ở Việt Nam, đã có một vài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định

dư lượng kháng sinh trong nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay công ty dược Các nghiên cứu này tập trung phân tích, định lượng hàm lượng của một kháng sinh cụ thể hoặc hỗn hợp nhiều kháng sinh Tuy nhiên, chưa có đề tài nào vềxác định hàm lượng nhóm kháng sinh quinolon trong nước thải từ các cơ sởsản xuất dược phẩm trong khi đây là nhóm kháng sinh được sử dụng và sản xuất khá rộng rãi ở nước ta Vì vậy, cần thiết phải xây dựng được một phương pháp xác định giúp phát hiện sự có mặt, với dư lượng kháng sinh ở hàm lượng thấp trong nước thải công nghiệp dược góp phần giảm thiểu nguy cơ phát tán kháng sinh ra ngoài môi trường, từ đó, làm giảm khả năng kháng kháng sinh

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

xác định dư lượng một số kháng sinh Quinolon trong nước thải công nghiệp Dược bằng LC- MS/MS” với các mục tiêu chính như sau:

1 Xây dựng được phương pháp xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon (Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin) có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng LC- MS/MS ở nồng độ ppb

2 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để xác định dư lượng của một số kháng sinh quinolon có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược trong nước

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH NHÓM QUINOLON

1.1.1 Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon [6], [11]

* Nguồn gốc

Không giống như một số thuốc kháng sinh đầu tiên được phát hiện trong thế kỷ trước, các kháng sinh quinolon không phân lập từ các sinh vật sống, mà được tổng hợp bởi các nhà hóa học

* Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

Công thức cấu tạo chung

Phân loại và phổ tác dụng: có nhiều cách phân loại quinolon như phân loại dựa trên phổ tác dụng và công dụng, dựa vào phân tử có hoặc không có fluor Ngày nay, các quinolon được phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:

Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon

T1/2ngắn, bài tiết qua nước tiểu

Nhiễm khuẩn tiết niệu chưa biến chứng

T1/2dài hơn

Nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn bểthận, sinh dục, tiền liệt tuyến, da và mô mềm

khuẩn đã kháng penicillin

Một số có thời gian bán thải dài hơn

Đợt cấp của viêm phếquản mạn tính, viêm phổi mắc phải ở cộng đồng, nhiễm khuẩn

mô mềm, xươngThế hệ IV

Grepafloxacin

Trovafloxacin

Alatrovafloxacin

Như thế hệ III Phổ mở rộng với các

vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không điển hình

Một số có thời gian bán thải dài hơn

Như thế hệ I, II, III (trừ nhiễm khuẩn niệu phức tạp), nhiễm khuẩn đường hô hấp,

ổ bụng, vùng chậu

* Cơ chế tác dụng

Các quinolon đều ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn Ngoài ra còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn Các quinolon đều là thuốc diệt khuẩn

1.1.2 Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu [8], [21]

HIện nay, các kháng sinh quinolon thế hệ I ít sản xuất, kháng sinh thế

hệ IV ít hoặc hầu như chưa sản xuất ở Việt Nam Các kháng sinh thế hệ II và III được sản xuất khá phổ biến Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một sốkháng sinh quinolon nhóm II và III, các chất này có công thức hóa học và tính chất lý hóa như sau:

Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu

pKa1= 5,69; pKa2= 9,42Ciprofloxacin

C17H18FN3O3, MW: 367.80

Bột kết tinh màu hơi vàng Tan trong nước, khó tan trong MeOH, EtOH

pKa1= 5,76; pKa2= 8,68Norfloxacin

C16H18FN3O3; 319.34

Bột kết tinh màu trắng ngà đến ánh vàng

pKa1= 5,45; pKa2= 6,2

1.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi hiện nay để nghiên cứu các chất với khảnăng xác định hàm lượng vết chất phân tích và ứng dụng trong quá trình nhận biết, phân tích cấu trúc phân tử của các chất hữu cơ

Về cơ bản, đây là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ

Hình 1.1 : Sơ đồ hệ thống LC- MS

1.2.1 Sắc ký lỏng [1], [12]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn được nhồi trên cột và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích,

do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

a Pha tĩnh

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ lưu giữ chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ từ 3-7 μm.Trong phần tổng quan này, chúng tôi trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật phổ biến nhất và cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu Tùy theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân bốđược chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

* Sắc ký lỏng pha đảo: Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn

các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol như cột C8, C18, cột Phenyl

* Sắc ký lỏng pha thuận: Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn các nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino ví dụ như cột Silica, Cyano, Amino,

b Pha động

Trong HPLC, pha động là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm được hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

Yêu cầu:

- Độ tinh khiết cao

- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh

- Không có bọt khí, không có tiểu phân (siêu âm, lọc)

Có 2 cách dùng pha động để rửa giải:

- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký

- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc

ký Chế độ gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ phân giải

Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất màcòn góp phần vào khả năng ion hóa của chất Chúng có những yêu cầu cao hơn về độ tinh khiết, hàm lượng các tạp chất Có những dung môi được sản xuất riêng cho LC-MS/MS

1.2.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) [1], [12], [22]

Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký Việc phân tích khối phổ(phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá

các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tíchhoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion ).

1.2.2.1 Nguyên tắc

Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng ion hóa áp suất khí quyển (API- Atmospheric Pressure Ionization) với kiểu ion hóa tia điện (ESI- Electrospray Ionizaton), ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization- APCI), hoặc ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization-APPI) Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion Từ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng máy phân tích với bộ phận ion hóa bằng kỹ thuật ESI để ion hoá các phân tử trung hoà thành các ion phân tử, các mảnh ion hoặc các gốc mang điện tích Đây là kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn và được xem là kỹ thuật ion hóa “êm dịu” hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol

Với kỹ thuật ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích tại bề mặt Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng

làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương Đến một giới hạn, các hạt sương bịphân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bềmặt Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ Sau đó, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.

Trong ESI, các ion được hình thành như sau:

Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

b Bộ phận phân tích khối (Mass analyzer)

Các ion hình thành ở nguồn ion hoá sẽ đi vào bộ phận phân tích khối

Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu

Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích

tứ cực, bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight- TOF) Bộ phân tích khối tứ cực chập ba được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây cũng là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua, được đóng vai trò như bộ lọc khối Khi một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào

tỉ số m/z và trường RF Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này.

Bộ phân tích khối tứ cực chập ba gồm ba tứ cực được ghép nối với nhau Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion

mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2 Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp suất cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ

có mặt như khí N2, Ar, He Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 có nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận phát hiện

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba

c Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier) Bộ phận phát hiện nhân electron

là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Các ion đập vào

bề mặt dinod làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinod tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của phương

pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.

1.2.3 Một số kỹ thuật ghi phổ

Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :

* Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác với chế độ scan, detector sẽ nhận được tất cả các mảnh ion

để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn

để khảo sát ion mẹ

* Chế độ chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring: SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

* SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với khối phổ ba tứ cực, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ

cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

1.2.4 Ứng dụng của LC-MS/MS

- Nghiên cứu hợp chất mới, đặc biệt là nghiên cứu phát triển thuốc

- Nghiên cứu, xác định hợp chất sinh học phức tạp, định dạng protein

- Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng trưởng

- Phân tích, định lượng thuốc trong dịch sinh học: theo dõi thông số dược động học, sinh khả dụng, theo dõi điều trị

- Phân tích, định lượng thuốc trong các mẫu nước thải bệnh viện, nước thải của các nhà máy sản xuất dược phẩm, các mẫu nước tự nhiên

1.2.5 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction– SPE) nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:

- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc

- Cô đặc mẫu

- Lượng mẫu không cần nhiều

- Lượng dung môi tiêu thụ ít

- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu

- Đơn giản, nhanh

Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu mà chúng tôi chọn phương pháp SPE để xử lý mẫu

Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:

Bước 1 Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được

với chất hấp phụ Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khicho vào cột SPE để tránh làm tắc cột.

Bước 2 Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp

Bước 3 Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tươngđương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi

có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu

Bước 4 Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 0,5 – 1 ml/phút

Bước 5 Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích

Bước 6 Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút

1.3 Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải ở Việt Nam và trên thế giới

Các kháng sinh quinolon có phổ tác dụng rộng, hoạt lực mạnh, được sử dụng trong nhiều trường hợp, nên đây là những kháng sinh được quan tâm nghiên cứu nhiều với nền mẫu phong phú như: trong chế phẩm, dịch sinh học, các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh viện, công ty dược Phương pháp định tính, định lượng cũng đa dạng từ phương pháp vi sinh, quang học, HPLC detector huỳnh quang với độ nhạy và tính chọn lọc cao, nhưng lại khó có thể phân tích các nhóm kháng sinh có trong nước thải với mức giới hạn cho phép thấp (ppb) Các nghiên cứu sử dụng trên thống HPLC-

MS/MS trên nền mẫu nước thải cũng được thế giới nghiên cứu, nhưng chưa được áp dụng với nước thải công nghiệp dược ở Việt Nam Một số nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon như sau:

- Dương Hồng Anh và cộng sự (2007) đã phân tích lượng vết một số kháng sinh họ Floquinolon trong nước thải bệnh viện dựa trên hai giai đoan chiết tách và làm giàu bằng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết cation hỗn hợp, định tính, định lượng bằng HPLC với detectơ huỳnh quang Quy trình có hiệu suất thu hồi cao (trung bình 84 - 101%), giới hạn định lượng 0,5 - 1 μg/L[2]

- Jay E.Renew và Ching Hua Huang (2004) đã định lượng đồng thời các kháng sinh fluoroquinolon trong nước thải bằng phương pháp LC- MS sử dụng cột C18, tốc độ 0,25 ml/phút, chương trình gradient: pha động A (1mM

CH3COONH4; 0,007 % acid acetic băng; 10% ACN), pha động B (100% ACN) Phương pháp có độ thu hồi trên 90% với 1 µg/L với các chất phân tích, giới hạn phát hiện trong khoảng 20 – 50 ng/L [24]

- Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và đánh giá dư lượng của 7 kháng sinh, trong đó có ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp LC-MS/MS với LOD của phương pháp từ 0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh [31]

- N Dorival – Garcia và cộng sự (2013) đã xây dựng phương pháp phát hiện

13 kháng sinh quinolon trong nước thải sử dụng chiết pha rắn và hệ thống HPLC- MS/MS sử dụng cột UPLC Giới hạn phát hiện của phương pháp trong khoảng 0,02 – 0,04 ng/ml, giới hạn định lượng trong khoảng 0,07 – 0,15 ng/ml, độ thu hồi từ 98,5% - 103,9% tùy thuộc vào mỗi kháng sinh [29]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, kiểm tra bằng LC-MS/MS không phát hiện có các kháng sinh này

Mẫu tự tạo: pha loãng dung dịch chuẩn gốc với mẫu trắng, lắc đều thu được dung dịch mẫu tự tạo

Mẫu thử: nước thải của các công ty sản xuất dược phẩm

Các chất nghiên cứu: Moxifloxacin, Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin, Ciprofloxacin 13C3

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn

Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Chất chuẩn Moxifloxacin Chuẩn

nguyên liệu

96,38 %

Ofloxacin Viện KNTW SKS 0310887.02 99,99%Norfloxacin Viện KNTW SKS 0208148 99,14%Ciprofloxacin

hydroclorid

Viện KNTW SKS 0212029.02 93,47%

Ciprofloxacin13C3 (IS)

Aldrich Sigma (Mỹ)

- Máy lắc siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn quốc)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 (chính xác đến 0,1mg) (Thụy Sỹ)

- Cân Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg) (Thụy Sỹ)

- Máy lọc hút chân không

- Màng lọc 0,45 μm và 0,2 μm Cellulose acetat, Sartorius (Đức)

- Máy lọc nước siêu tinh khiết

- Tủ lạnh

- Dụng cụ thủy tinh các loại: bình định mức 10 ml, pipet chính xác, các dụng cụ thủy tinh, micro pipet, vial

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử

Thời gian lấy mẫu: 1/8 – 17/08

Vị trí lấy mẫu: lấy mẫu tại bể nước thải trước khi đổ ra môi trường của các công ty sản xuất dược phẩm

Lọc, điều chỉnh đến pH = 2

Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2- 80C nếu phân tích ngay trong 24 giờ hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu – 300C trong vòng 1 tháng

2.3.2 Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn của từng kháng sinh, IS và hỗn hợp các kháng sinh với IS pha trong dung môi pha động

* Khảo sát điều kiện khối phổ: Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa,

điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn mảnh ion con có cường độlớn nhất dùng để định lượng

* Khảo sát các thông số sắc ký

- Cột: Để lựa chọn cột phân tích, sử dụng cột Agilent SB C18 (1,8µm; 2,1x50mm) và cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5µm; 3,0 x 150mm) phân tích dung dịch chuẩn của các kháng sinh ở nồng độ 100ppb và tiến hành kiểm tra khả năng tách và thời gian lưu Lựa chọn cột có khả năng tách, pic chấtphân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách

rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài

- Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng của chuẩn nội tốt Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là Ciprofloxacin 13C3 Đây là đồng vị carbon C13 của Ciprofloxacin, không có sẵn trong tự nhiên

- Chương trình pha động: Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát pha động ACN (0,1% HCOOH) : H2O (0,1% HCOOH) với tỷ lệ thể tích / thểtích khác nhau và chạy chế độ gradient khác nhau Pha động được chọn phải đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài

- Tốc độ dòng: Khảo sát lần lượt các tốc độ 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút để xác định tốc độ phù hợp Chọn tốc độ cho pic cân đối, ít doãng và thời gian lưu ngắn

- Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi thể tích tiêm 1, 5, 10, 20μl để xác định thể tích tiêm phù hợp cho sắc ký đồ đẹp, diện tích pic và độ đáp ứng cao

2.3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

- Mục đích: tìm được loại dung môi, thể tích mẫu chiết để xử lý mẫu có

độ thu hồi cao, loại được nhiều tạp chất

- Tiến hành xử lý mẫu thử bằng các cách khác nhau Định lượng hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn Đánh giá và tìm ra cách xử lý phù hợp

2.3.4 Thẩm định phương pháp

Xử lý các mẫu nghiên cứu theo phương pháp đã xây dựng, tiến hành sắc

ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu:

* Tính thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời

gian lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp các kháng sinh và IS

Yêu cầu: RSD về thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn nội và kháng sinh < 5%

* Độ đặc hiệu: độ đặc hiệu được đánh giá thông qua phân tích các dung dịch

chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo Tiến hành như sau:

- Dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết

- Mẫu trắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo quy trình đã xây dựng

- Mẫu tự tạo là mẫu trắng thêm một lượng chính xác các kháng sinh và chất chuẩn nội đã biết nồng độ

Tiến hành xử lý và phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng, mẫu tựtạo theo các điều kiện đã chọn

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu

tương ứng với thời gian lưu của các mảnh khối phổ tương ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn và mẫu chuẩn nội Mỗi chất được xác định bởi 3 ion với số điểm IP = 4 bao gồm: 1 ion mẹ (1 điểm) và 2 ion con (mỗi ion con là 1,5 điểm)

* Khoảng tuyến tính:

Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện sắc ký dãy chuẩn với 7 mức nồng độ của mỗi chất từ 0,5 ppb đến 50 ppb và nồng độchuẩn nội cố định là 20 ppb Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn

Xây dựng đồ thị và phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan

hệ giữa tỷ lệ diện tích pic của kháng sinh và diện tích pic của chuẩn nội vớinồng độ kháng sinh

Tính hệ số tương quan r giữa nồng độ và tỷ lệ giữa diện tích píc của chất phân tích và diện tích píc của chuẩn nội

Yêu cầu: r ≥ 0,99

* Độ đúng, độ lặp lại

Độ đúng là sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trịđối chiếu được chấp nhận Độ lặp lại là độ chụm của các kết quả đo được trong cùng điều kiện thí nghiệm

Tiến hành thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu trắng trên 3 mức nồng độ: nồng độ thấp LQC (bằng khoảng 2 - 3 lần LLOQ), nồng độtrung bình MQC (khoảng 40 - 60% ULOQ) và nồng độ cao HQC (khoảng 80

- 90% ULOQ) Tính RSD để xác định độ lặp lại của phương pháp Tính tỉ lệchuẩn thu hồi lại được và lượng chuẩn thêm vào để có được độ đúng của phương pháp

Yêu cầu: Độ thu hồi từ 60 – 115 %, RSD ≤ 21%.

* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích có trong mẫu thử mà

ta có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải gấp ít nhất 10 lần đáp ứng của mẫu trắng

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong

mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N = 3)

LOD được tính theo công thức

LOQLOD = -

3,3Cách xác định: tiến hành xử lý mẫu chuẩn của các kháng sinh có nồng

độ thấp dần và tiến hành phân tích đến khi thu được S/N = 10 (thu được LOQ) hoặc S/N = 3 (thu được LOD)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo khối phổ

Qua tham khảo một số tài liệu, tiến hành khảo sát xác định các kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin bằng kỹ thuật phun điện tử ESI với:

- Nguồn ion hóa: ESI (+)

- Nhiệt độ khí phun: 3000C

- Tốc độ khí phun: 11 l/min

- Áp suất đầu phun: 25 psi

- Thế nguồn ion hóa: 4000 V

Để xác định điều kiện khối phổ, tiến hành pha riêng rẽ từng chất chuẩn Moxifloxacin, Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin trong hỗn hợp dung môi MeOH : H2O (1:1) có nồng độ 1 mg/ml và Ciprofloxacin 13C3 (IS) trong MeOH có nồng độ 0,5 μg/ml Tiêm lần lượt các dung dịch trên vào hệ thống khối phổ không qua cột sắc ký với tốc độ 0,3 ml/min Tiến hành khảo sát bắn phá ion mẹ và lựa chọn ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu là hệ khối phổ 2 lần, vì vậy, việc lựa chọn ion con cũng như các điều kiện phân mảnh rất quan trọng Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá phù hợp Mảnh ion con có m/z có cường độ lớn nhất được dùng để định lượng, mảnh ion con thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để định tính Đối với chất chuẩn nội, lựa chọn một ion con đặc trưng

Sau khi tiến hành tối ưu hóa điều kiện phân mảnh của các dung dịch kháng sinh và IS, tiến hành khảo sát lại các điều kiện, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS

phân tích

Ion mẹ(m/z)

Ion con(m/z)

Colission Energy(V)

Thế đầu vào(V)

2 ion con, trong đó, mảnh ion con có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để định tính Kết quả ở hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy, đã lựa chọn được các thông số và mảnh ion cụ thể của từng chất

3.1.2 Khảo sát các điều kiện của sắc ký

* Cột

Trong nghiên cứu này, qua tham khảo tài liệu và điều kiện thực tế, lựa chọn Cột Agilent SB- C18 (1,8µm; 2,1x50mm) và cột Agilent Eclipse XDB-C18 (3,5µm; 3,0 x 150mm) để phân tích kháng sinh Tiến hành sắc ký bằng 2 cột này ở các thể tích tiêm 1, 5, 10, 20 μl Kết quả thu được như sau:

Nhận xét:

Khi dùng cột SB- C18 và Eclipse XDB- C18, với thể tích tiêm mẫu nhỏ, đáp ứng của chất phân tích kém, với thể tích tiêm mẫu lớn hơn, đáp ứng cũng trở nên tốt hơn; tuy nhiên, thể tích tiêm lớn có thể ảnh hưởng đến hiệu lực cột khi phân tích trong thời gian dài

Thời gian lưu của các kháng sinh khi sử dụng cột SB- C18 gần bằng nhau và ngắn hơn không đáng kể so với khi dùng cột Eclipse XDB- C18 Như vậy, có thể sử dụng 2 cột này để phân tích Nhưng khi thể tích tiêm mẫu càng lớn, sử dụng cột SB- C18 làm các pic chất phân tích bị doãng, không cân xứng, đáp ứng kém hơn khi dùng cột Eclipse XDB- C18 Nguyên nhân có thể

do cột SB- C18 ngắn hơn nên dung lượng của cột kém hơn so với cột Eclipse