Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic.
Dung môi loại dùng cho HPLC: acetonitril, methanol (Merck – Đức).
Nƣớc cất hai lần dùng cho HPLC.
Các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà đã đƣợc tinh chế và nhận
dạng cấu trúc bằng phƣơng pháp phổ NMR là: +) PM3 (Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid), +) PM9 (Kaempferol 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid), +) PM12 (3,4-dihydroxybenzandehyd), +) PM15 (Kaempferol – 3 – O – α – L - rhamnopyranosid – 7 – O – β – D - glucopyranosid), +) PM18 (Kaempferol – 3 – O – α – L – rhamnopyranosid – 7 – O - [α – D - apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid]). 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu SPD – 10AVP (Nhật).
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT – PACKARD 1100
(Detector DAD) (Mỹ).
Cột sắc ký Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm 4,6 mm, 5 µm).
20
Cột sắc ký Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm 4,6 mm, 5 µm).
Cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4 30 mm ID).
Bể siêu âm ELMA S 180/H (Đức).
Tủ sấy UNB 400 Memmert (Đức).
Tủ sấy chân không Shellab1430 D-2E (Đức).
Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm.
Cân phân tích AB-265S Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d = 0,00001 g).
Cân phân tích XS-204 Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d = 0,0001g).
Bể cách thủy ổn nhiệt WNB14 – Memmert (Đức).
Máy đo pH Seven compact S220 (Mettler Toledo – Thụy Sỹ).
Micropipet 10-100L, 100-1000L.
Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong...
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế đƣợc
bằng phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích để kiểm tra khả năng sử dụng chúng nhƣ các chất đối chiếu.
Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các
hợp chất trong hỗn hợp các chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong dịch chiết cây Cỏ Seo gà.
Định tính các chất dựa vào thời gian lƣu trên sắc ký đồ, kết hợp với chồng phổ UV của chất đối chiếu và thử bằng HPLC detector DAD.
Thẩm định các điều kiện định lƣợng một số hợp chất trên với chất đối
chiếu là các chất phân lập đƣợc đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lƣợng các hợp chất trên có trong các
phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất và mẫu cây Cỏ Seo gà đã thu hái đƣợc.
21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử
2.3.1.1. Xác định độ ẩm của bột dược liệu
Toàn cây Cỏ Seo gà sau khi đƣợc làm khô tự nhiên, nghiền thành bột thô rồi xác định độ ẩm của dƣợc liệu theo phƣơng pháp mất khối lƣợng do làm khô (Phụ lục 9.6, Dƣợc điển Việt Nam IV).
Dùng chén thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC dƣới áp suất thƣờng trong 30 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân để xác định khối lƣợng bì. Cân ngay mẫu thử vào bì này một lƣợng chính xác khoảng 2 g, dàn mỏng thành lớp
có độ dày khoảng 5 mm, sấy ở 105o
C đến khối lƣợng không đổi. Từ đó xác định độ ẩm của bột mẫu nghiên cứu [4].
2.3.1.2. Chiết xuất
Tiến hành khảo sát các phƣơng pháp chiết xuất nhƣ: ngâm ở nhiệt độ phòng, chiết soxhlet và chiết siêu âm với các dung môi khác nhau. Phƣơng pháp chiết siêu âm với dung môi là methanol đƣợc lựa chọn để chiết xuất thu đƣợc dịch chiết toàn phần.
Tiến hành cân khoảng 50 g bột dƣợc liệu toàn cây Cỏ Seo gà (đã xác định độ ẩm), chiết siêu âm với methanol nhiều lần, gộp dịch lọc, bay hơi dung
môi dƣới áp suất giảm đến cắn, cắn đƣợc sấy khô và bảo quản ở 4o
C.
2.3.1.3. Tính hiệu suất chiết
Hàm lƣợng % của cắn toàn phần so với khối lƣợng bột dƣợc liệu đƣợc tính theo công thức sau:
100 (%) 100 (100 ) a X M x trong đó: X: Hàm lƣợng (%)
M: Khối lƣợng dƣợc liệu đem chiết (g) x: Độ ẩm dƣợc liệu (%)
22
2.3.1.4. Pha dung dịch thử
Tiến hành cân chính xác khoảng 0,3 g cắn, hòa tan hoàn toàn bằng methanol trong bình định mức 50 mL, thêm methanol vừa đủ lắc đều, lọc qua
màng lọc 0,45 m trƣớc khi định tính và định lƣợng bằng HPLC.
2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu
2.3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được
Các chất nghiên cứu đƣợc cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu đƣợc đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi đƣợc phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các hợp chất đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Nếu chất phân lập không bị lẫn các tạp chất khác, tạm bỏ qua hàm ẩm (vì khối lƣợng chất phân lập đƣợc rất ít) để coi hàm lƣợng của các chất phân lập là 100% trong xây dựng phƣơng pháp định lƣợng.
2.3.2.2. Pha các dung dịch đối chiếu gốc
Cân chính xác một lƣợng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chế đƣợc, hòa tan và định mức bằng methanol để thu đƣợc các dung dịch đối chiếu gốc có nồng độ chính xác lần lƣợt: PM3 khoảng 100 g/mL, PM12
khoảng 100 g/mL, PM18 khoảng 200 g/mL, PM15 khoảng 200 g/mL,
PM9 khoảng 250 g/mL. Các dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và đƣợc pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn.
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
2.3.3.1. Chọn cột sắc ký
Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với nhiều tính ƣu việt. Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phƣơng pháp
23
tách chiết, định lƣợng một số thành phần trong cây Cỏ Seo gà, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này.
Tiến hành khảo sát trên các cột C18 có kích thƣớc hạt nhồi là 5 µm, với chiều dài cột là 10 cm, 15 cm và 25 cm.
2.3.3.2. Chọn pha động
Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lƣu giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của các chất nghiên cứu và tham khảo một số tài liệu. Tiến hành khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau có thành phần là acetonitril, methanol, nƣớc sao cho các pic của các hợp chất nghiên cứu tách riêng rẽ với thời gian phân tích hợp lý.
2.3.3.3. Chọn tốc độ dòng
Tiến hành khảo sát tốc độ dòng trong khoảng 0,8 - 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lƣu tối ƣu.
2.3.3.4. Chọn bước sóng phát hiện
Quét phổ UV – Vis của các hợp chất nghiên cứu để xác định cực đại hấp thụ của chúng, từ đó chọn bƣớc sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích đều có độ hấp thụ đủ lớn.
2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích
Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà bằng phƣơng pháp HPLC đƣợc thẩm định thông qua các chỉ tiêu:
Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Độ lặp lại của phƣơng pháp
Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ đúng
24
2.3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý xong.
Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD 2,0%.
Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc. Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác).
Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp.
Tiến hành: tiêm lần lƣợt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký; so sánh các sắc ký đồ thu đƣợc.
Yêu cầu: tại thời gian lƣu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền.
2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của một phƣơng pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm đƣợc áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, đƣợc xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhƣng các lần lặp lại phải đƣợc thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.
Tiến hành: pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp
25
lại đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD 2,0%.
2.3.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Nó đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan r.
Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã đƣợc khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 40% đến 140% nồng độ dự kiến phân tích của mẫu.
Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
Yêu cầu: R2 0,99 (r 0,995).
2.3.4.4. Độ đúng
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực.
Cách xác định: pha dung dịch thử và dung dịch đối chiếu theo quy trình chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Thêm vào mẫu thử những lƣợng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lƣợng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lƣợng để xác định hàm lƣợng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phƣơng trình đƣờng chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ đƣợc tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lƣợng chất đối chiếu tìm đƣợc so với lƣợng chất đối chiếu thêm vào.
26
2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
LOD là lƣợng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện đƣợc về mặt định tính.
LOQ là lƣợng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
Cách xác định: xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đƣờng nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S). Thiết lập tỷ số S/N.
LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3
lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 3/1).
LOQ: là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần
nhiễu đƣờng nền (S/N = 10/1).
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả sắc ký đƣợc xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC.
Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lƣợng đặc trƣng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel.
27
CHƢƠNG III
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN
3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu
Lấy ngẫu nhiên bột dƣợc liệu ở các vị trí khác nhau rồi xác định độ ẩm của dƣợc liệu theo phƣơng pháp mất khối lƣợng do làm khô. Kết quả thu đƣợc tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu
STT Khối lượng dược liệu trước sấy (g)
Khối lượng dược
liệu sau sấy (g) Độ ẩm (%)
1 2,0134 1,6860 16,26
2 2,0188 1,6996 15,81
3 2,0063 1,6911 15,71
Trung bình 15,93
3.1.2. Chiết xuất
Khối lượng cắn toàn phần:
Cân 50,2785 g dƣợc liệu toàn cây Cỏ Seo gà (độ ẩm 15,93%) đã đƣợc làm nhỏ, chiết siêu âm 5 lần, mỗi lần chiết siêu âm với 200 ml methanol trong thời gian 10 phút, thu dịch chiết, lọc, bốc hơi cách thủy dung môi trên tới cắn. Cắn đƣợc sấy áp suất giảm ở 60oC đến khối lƣợng không đổi, thu đƣợc 2,1410 g cắn toàn phần, bảo quản ở 4oC.
Khối lượng cắn ở các phân đoạn chiết lỏng – lỏng:
Tiến hành song song nhƣ trên cân 50,2550 g dƣợc liệu toàn cây Cỏ Seo gà (độ ẩm 15,93%) đã đƣợc làm nhỏ, chiết siêu âm 5 lần, mỗi lần chiết siêu âm với 200 ml methanol trong thời gian 10 phút. Thu dịch chiết và bốc hơi đƣợc 2,140 g cắn toàn phần. Cắn này đƣợc hòa tan vào một thể tích tối thiểu nƣớc cất nóng 60°C. Dịch chiết nƣớc đƣợc tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, cloroform, ethyl
28
acetat. Thu đƣợc 3 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi đến cắn có khối lƣợng không đổi.
Nhận xét: Để định lƣợng các hợp chất trong Cỏ Seo gà đạt kết quả tốt,
trƣớc hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Chúng tôi chọn phƣơng pháp chiết siêu âm với methanol, phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, cloroform, ethyl acetat). Đây là phƣơng pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, thời gian chuẩn bị mẫu ngắn đồng thời cho hiệu suất tƣơng đối cao.
Hiệu suất chiết cắn toàn phần:
100 (%) 100 (100 ) a X M x
Với khối lƣợng dƣợc liệu đem chiết (M) là 50,2785g có độ ẩm (x) là 15,93% và khối lƣợng cắn toàn phần thu đƣợc (a) là 2,1410g, hiệu suất thu đƣợc cắn toàn phần là 5,07%.
Hiệu suất chiết cắn ở các phân đoạn:
Hiệu suất cắn của 3 phân đoạn so với cắn toàn phần của cây Cỏ Seo gà đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu suất chiết cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây Cỏ Seo gà.
STT Phân đoạn Khối lƣợng cắn (g)
Hiệu suất chiết (%) so với cắn toàn phần
1 n-hexan 0,8250 38,55
2 Cloroform 0,2180 10,19
3 Ethyl acetat 0,1150 5,37
29
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký
Vì mẫu phân tích là dƣợc liệu có nhiều thành phần nên cần có sự tách tốt và thời gian phân tích phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên loại cột C18 với kích thƣớc hạt nhồi là 5µm và chiều dài cột là 10 cm, 15cm và 25 cm.
Với cột Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm 4,6 mm, 5 µm)
hoặc cột Chromolith RP18e 130A (100 mm x 4,6 mm) có kích thƣớc hạt 5µm
kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4 30 mm ID), bằng nhiều hệ
dung môi khác nhau thu đƣợc các sắc ký đồ trong đó các pic không tách riêng đƣợc (hình 3.1). Trong số các cột khảo sát, chỉ có cột Zobax Eclipse XBD –
C18 (250 mm 4,6 mm, 5 µm) là phù hợp, cho các pic tách tốt, thời gian lƣu
hợp lý (hình 3.4, 3.5).
Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các hệ dung môi khác nhau.
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 1 P M 3 5.042 2 P M 12 9.217 3 P M 18 11.325 4 P M 15 11.600 5 P M 9 15.233 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30