Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà bằng phƣơng pháp HPLC đƣợc thẩm định thông qua các chỉ tiêu:
Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Độ lặp lại của phƣơng pháp
Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ đúng
24
2.3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký
Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý xong.
Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD 2,0%.
Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc. Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác).
Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp.
Tiến hành: tiêm lần lƣợt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký; so sánh các sắc ký đồ thu đƣợc.
Yêu cầu: tại thời gian lƣu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền.
2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của một phƣơng pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm đƣợc áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, đƣợc xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhƣng các lần lặp lại phải đƣợc thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.
Tiến hành: pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp
25
lại đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD 2,0%.
2.3.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Nó đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan r.
Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã đƣợc khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 40% đến 140% nồng độ dự kiến phân tích của mẫu.
Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
Yêu cầu: R2 0,99 (r 0,995).
2.3.4.4. Độ đúng
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực.
Cách xác định: pha dung dịch thử và dung dịch đối chiếu theo quy trình chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Thêm vào mẫu thử những lƣợng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lƣợng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lƣợng để xác định hàm lƣợng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phƣơng trình đƣờng chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ đƣợc tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lƣợng chất đối chiếu tìm đƣợc so với lƣợng chất đối chiếu thêm vào.
26
2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
LOD là lƣợng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện đƣợc về mặt định tính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
LOQ là lƣợng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
Cách xác định: xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đƣờng nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S). Thiết lập tỷ số S/N.
LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3
lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 3/1).
LOQ: là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần
nhiễu đƣờng nền (S/N = 10/1).