Sau khi xây dựng quy trình phân tích đã đƣợc thẩm định theo quy định chung. Kết quả thẩm định cho thấy phƣơng pháp đã đáp ứng đƣợc các yêu cầu của một phƣơng pháp phân tích.
- Độ chọn lọc: Kết quả thu đƣợc từ sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn
và mẫu thử cho thấy tại thời gian lƣu của các pic phân tích không xuất hiện các pic phụ của tạp chất trong mẫu thử cũng nhƣ không có pic tại các vị trí đó trong sắc ký đồ của mẫu trắng. Khi tiến hành trên máy HPLC với detector DAD cho thấy, bên cạnh giá trị thời gian lƣu còn phân tích thấy độ tinh khiết của các pic đối với hỗn hợp các chất phân lập đƣợc là tƣơng đối cao. Chứng tỏ phƣơng pháp có độ chọn lọc cao và các chất phân lập đƣợc là tinh khiết.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Với các khoảng nồng độ khảo sát của các
chất đều cho thấy đƣờng hồi quy trong khoảng nồng độ đã chọn có hệ số tƣơng quan đều đạt trên 0,995 chứng tỏ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ của chất và diện tích pic là khá chặt chẽ.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: giới hạn phát hiện và giới
hạn định lƣợng của phƣơng pháp chúng tôi xây dựng đƣợc khá thấp cho phép có thể dùng để đánh giá sự có mặt của các hợp chất trên trong mẫu cây Cỏ Seo gà nhƣ là “dấu vân tay” để so sánh thành phần các phân đoạn thu đƣợc trong chiết xuất và đánh giá hàm lƣợng các chất trong dƣợc liệu.
- Độ đúng: Độ đúng đã đƣợc kiểm tra với tất cả các hợp chất với tỷ lệ
tìm lại ở các nồng độ khác nhau trong khoảng nồng độ tuyến tính. Điều này khẳng định phƣơng pháp có độ chính xác và độ lặp lại theo yêu cầu.
Nhƣ vậy, với chƣơng trình định lƣợng các chất trong cây Cỏ Seo gà bằng phƣơng pháp HPLC mà chúng tôi xây dựng đƣợc là đủ tin cậy. Phƣơng pháp có ƣu điểm là đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí kiểm nghiệm.
57
4.5. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH
THÀNH PHẦN CÁC PHÂN ĐOẠN
Do các chất phân lập đƣợc tạm dùng làm chất đối chiếu chƣa biết hàm lƣợng và hàm ẩm cụ thể nên nồng độ các chất đối chiếu chỉ là tƣơng đối. Tuy nhiên với độ tinh khiết đã đƣợc kiểm tra và mẫu đã đƣợc làm khô kỹ trƣớc khi đo phổ để xác định cấu trúc nên hàm lƣợng cũng xấp xỉ 100% nên sai số nồng độ sẽ không quá xa nồng độ biểu kiến dùng tính toán.
Kết quả phân tích các chất nghiên cứu trong thành phần các phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất phân lập cho thấy:
Trong cắn cloroform chỉ thấy có mặt của PM12, PM18 và PM9, không thấy có mặt các chất PM3 và PM15. Tuy nhiên so sánh tỷ lệ diện tích pic của các chất nghiên cứu cho thấy chỉ một phần PM18 và PM9 trong cắn toàn phần đƣợc chuyển sang dung môi chiết cloroform. Trong khi đó hợp chất PM12 lại đƣợc tập trung trong cắn này.
Trong cắn ethyl acetat chứa đầy đủ cả 5 chất nghiên cứu. Tuy nhiên lƣợng PM12 còn lại trong cắn ethyl acetat rất thấp. Trong khi đó PM3 và PM15 bắt đầu đƣợc chuyển sang dung môi ethyl acetat. PM18 và PM9 vẫn đƣợc tiếp tục chuyển sang dung môi này nhƣng mức độ tăng hàm lƣợng của PM9 tốt hơn PM18.
Thực tế trong quá trình phân lập các chất PM9, PM15 và PM18 đƣợc tách ra từ cắn ethyl acetat hoàn toàn phù hợp với hàm lƣợng của chúng trong cắn ethyl acetat cao hơn hẳn so với PM12 và PM3.
Hàm lƣợng các chất nghiên cứu trong mẫu dƣợc liệu thu hái tại khu vực Ba Vì, Hà Nội đƣợc xác định qua một số lần chiết xuất. Tuy các kết quả thu đƣợc chƣa thể đại diện cho hàm lƣợng các chất trong dƣợc liệu thu hái ở các khu vực khác nhau, nhƣng vẫn có giá trị để dùng ƣớc lƣợng hàm lƣợng các chất trong cây Cỏ Seo gà. Cụ thể nhƣ sau:
58
Từ dịch chiết methanol mẫu cây Cỏ Seo gà dùng trong nghiên cứu chúng tôi đã sơ bộ xác định hàm lƣợng có trong 100g dƣợc liệu của 5 chất nghiên cứu nhƣ sau: maltol-3-O-β-D-glucopyranosid là 7,37 mg; 3,4- dihydroxybenzandehyd là 4,43 mg; kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7- O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid] là 18,87 mg; kaempferol- 3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid là 7,60 mg; kaempferol- 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid là 8,98 mg.
Cần làm thêm trên số lƣợng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lƣợng các chất trên có trong câyCỏ Seo gà theo hƣớng:
- Địa điểm thu hái mẫu khác nhau
- Thời gian thu hái mẫu khác nhau
- Kiểm tra quy trình chiết xuất đã chiết kiệt hoạt chất trong dƣợc liệu hay
59
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Qua thời gian triển khai thực nghiệm luận văn đã đạt đƣợc các mục tiêu đề ra và thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
1. Đã chọn đƣợc phƣơng pháp xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt là chiết siêu âm với methanol.
2. Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 5 hợp chất phân
lập đƣợc từ Cỏ Seo gà bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sắc ký cụ thể nhƣ sau:
Cột: Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ 25oC.
Pha động: acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid formic) với chế độ gradient
dung môi trong thời gian phân tích là 30 phút.
Detector SPD-10AVP ở bƣớc sóng 265 nm.
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
Thể tích tiêm: 20 L.
Phƣơng pháp xây dựng đã đƣợc thẩm định, kết quả cho thấy các chỉ tiêu đều đạt yêu cầu, đảm bảo phƣơng pháp có thể áp dụng vào định lƣợng các chất nghiên cứu trong các phân đoạn chiết xuất cũng nhƣ trong cây Cỏ Seo gà.
3. Đã áp dụng phƣơng pháp để so sánh thành phần của các phân đoạn thu
đƣợc trong quá trình chiết xuất và sơ bộ xác định hàm lƣợng của 5 hợp chất nghiên cứu có trong một mẫu Cỏ Seo gà thu hái đƣợc. Kết quả cụ thể nhƣ sau:
- Cắn ethyl acetat chứa tất cả các chất nghiên cứu đặc biệt PM9, PM15
60
chứa PM12, không có mặt PM3 và PM15, hai chất nghiên cứu còn lại có hàm lƣợng thấp hơn.
- Trong 100 g mẫu dƣợc liệu khô Cỏ Seo gà sơ bộ xác định có 7,37 mg
maltol-3-O-β-D-glucopyranosid; 4,43 mg 3,4-dihydroxybenzandehyd;
18,87mg kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1- 2)-β-D-glucopyranosid]; 7,60 mg kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O -β-D-glucopyranosid và 8,98mg kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid. ĐỀ XUẤT
- Tiếp tục phân lập và tinh chế thêm các hợp chất có trong Cỏ Seo gà để
có thể tiến hành thiết lập chất chuẩn. Đây là công việc rất quan trọng để có thể cho kết quả xác định hàm lƣợng các chất trong cây Cỏ Seo gà đƣợc chính xác và ổn định hơn.
Do thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ tiến hành phân tích trên mẫu cây
Cỏ Seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội nên chƣa có tính đại diện cao. Vì vậy, cần mở rộng nghiên cứu, phân tích những mẫu cây Cỏ Seo gà tại các khu vực và các mùa thu hái khác nhau ở Việt Nam để có số liệu chính xác về hàm lƣợng các hợp chất trong cây Cỏ Seo gà.
Hoàn thiện phƣơng pháp hơn nữa, để có thể góp phần tiêu chuẩn hóa
61
Công trình nghiên cứu đã công bố liên quan đến đề tài
1. Nguyễn Duy Chí, Nguyễn Hải Đƣờng, Nguyễn Thái An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2014), “Xây dựng phƣơng pháp xác định hàm lƣợng một số hợp chất trong cỏ seo gà ( Pteris multifida Poir.) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”,
62
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, tập 2, NXB Y học, Hà Nội.
2. Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội.
3. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, tập 2, NXB Khoa học và kỹ thuật, 729 – 730.
4. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội.
5. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,
207 – 208.
Tiếng Anh
6. Ahmad Sazali Hamzah, Lajis N. H. and Sargent M. V. (1994),
“Kaempferitrin from the leaves of Hedyotis verticillata and its biological activity”, Planta medica, 60(4), 388 – 389.
7. Buniyamin A. Ayinde, Doris N. Onwukaeme and Eric K. Omogbal
(2007), “Isolation and characterization of two phenolic compounds from
the stem bark of Musanga cecropioides R. Brown (Moraceae), Acta
Poloniae Pharmaceutica - Drug Research, 64(2), 183 – 185.
8. De Sousa E, Zanatta L, Seifriz I, Creczynski-Pasa TB, Pizzolatti
MG, Szpoganicz B, Silva FR (2004), “Hypoglycemic effect and antioxidant potential of kaempferol-3,7-O-(alpha)-dirhamnoside from
Bauhinia forficata leaves”. J Nat Prod., 67(5), 829 – 832.
9. Djimtombaye BJ, Alankuş-Çalışkan Ö, Gülcemal D, Khan IA, Anıl
H, Bedir E. (2013), “Unusual secondary metabolites from Astragalus
halicacabus LAM.”, Chem Biodivers., 10(7), 1328 – 1334.
10.El-Sayeda, N. H., Awaadb, A. S., Hifnawyb, M. S., & Mabryc, T. J.
(1999), “A favonol triglycoside from Chenopodium murale”,
63
11.Guo Hongzhu, Koike Kazuo, Li Wei, Guo Dean & Nikaido Tamotsu
(2004), “Maltol glucosides from the tuber of Smilax bockii”,
Phytochemistry, 65, 481 – 484.
12.Haizhou Li, Tatsuya Nakashima, Takashi Tanaka, Ying-Jun Zhang,
Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2008), “Two New Maltol Glycosides and
Cyanogenic Glycosides from Elsholtzia rugulosa Hemsl.”, Journal of
Natural Medicines, 62(1), 75 – 78.
13.Hanan M. El-Youssef, Brian T. Murphy, Masouda E. Amer, Maged S.
Abdel-Kader and David J. I. Kingston (2008), “Phytochemical and biological study of the aerial parts of Lotus lalambensis growing in Saudi
Arabia”, Saudi Pharmaceutical Journal, 16(2), 122 – 134.
14.Hao-Bin Hu, Xu-Dong Zheng and Hong Cao (2006), “Xanthone O-
glycosides from the Roots of Pteris multifida”, Journal of the Chinese
Chemical Society, 53, 459 – 464.
15.Harinantenaina L, Matsunami K, Otsuka H. (2009), “Evaluation of In
Vitro Antioxidant and Anti-Lipid Peroxidation activities of Ching-Pien- Tsao (Pteris multifida Poiret)”, J. Taiwan Agric. Res., 58(1), 55 – 60.
16.Jeong JB, Hong SC, Jeong HJ (2009), “3,4-
dihydroxybenzaldehyde purified from the barley seeds (Hordeum vulgare)
inhibits oxidative DNA damage and apoptosis via its
antioxidant activity.”, Phytomedicine, 16(1), 85 – 94.
17.Jiaju Zhou, Guirong Xie, Xinjian Yan (2011), Encyclopedia of
Traditional Chinese Medicines – Molecular Structures, Pharmacological Activities, Natural Sources and Applications: Vol. 2: Isolated Compounds D-G, Springer, 87.
18.Jiaju Zhou, Guirong Xie, Xinjian Yan (2011), Encyclopedia of
64
Activities, Natural Sources and Applications: Vol. 3: Isolated Compounds H-M, Springer, 311.
19.Jiangsu New Medical College (1985), Dictionary of Traditional Chinese
Drug, Vol. 1, Shanghai Science and Technology Press, Shanghai, 487.
20.Jicheng Shu, Jianqun Liu, Youquan Zhong, Jinghang Pan, Lifang Liu, Rui
Zhang (2012), “Two new pterosin sesquiterpenes from Pteris multifida
Poir.”, Phytochemistry Letters, 5(2), 276 – 279.
21.Jorge AP, Horst H, de Sousa E, Pizzolatti MG, Silva FR. (2004),
“Insulinomimetic effects of kaempferitrin on glycaemia and on 14C- glucose uptake in rat soleus muscle”, Chem Biol Interact., 149(2 – 3), 89 – 96.
22.Kuang-Ping Lan, Ying-Pei Shen, Shui-Huei Lee, Tzu-Ching Wang, Tzu-
Ling Wang-Mccall, Chung-Ching Lin and Chi-Ching Yang (2011), “Antinoxidant and free radical-scavenging activity of Pteris multifida
Poiret aqueous extract”, Journal of Food Quality, 34(4), 252 – 258.
23.Lee BH, Yoon SH, Kim YS, Kim SK, Moon BJ, Bae YS (2008),
“Apoptotic cell death through inhibition of protein kinase CKII activity by
3,4-dihydroxybenzaldehyde purified from Xanthium strumarium”, Nat
Prod Res., 22(16), 1441 – 1450.
24.Lee H, Lin JY. (1988), “Antimutagenic activity of extracts from
anticancer drugs in Chinense medicine”, Mutat Res, 204, 229 – 234.
25.Liang Yong-hong, Ye Min, Han Jian, Wang Bao-rong, Guo De-an (2011),
“Lignans and flavonoids from rhizome of Drynaria fortunei”, Chinese
Traditional and Herbal Drugs, 42, 25 – 30.
26.Liu Jian-qun, Ren Xiao-jing, Shu Ji-cheng (2013), “Simultaneous
Determination of Five Flavonoids in Pteris multifida Poir. by HPLC[J]”,
65
27.Liva Harinantenaina, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka (2008),
“Chemical and biologically active constituents of Pteris multifida”,
Journal of Natural Medicines, 62(4), 452 – 455.
28.Mohamed Sharaf, Mohamed A. El-Ansari and Nabiel A. M. Saleh (1997),
“Flavonoids of four Cleome and three Capparis species”, Biochemical
Systematics and Ecology, 25(2), 161 – 166.
29.Nova Syafni, Deddi Prima Putra, and Dayar Arbain (2012), “3,4-
dihydroxybenzoic acid and 3,4-dihydroxybenzandehyde from the fern
Trichomanes chinense L.; isolation, antimicrobial and antioxidant
properties”, Indo. J. Chem., 12 (3), 273 – 278.
30.Nurettin Yayli, Hasan Seymen, Cemalettin Baltaci (2001), “Flavone C- glycosides from Scleranthus uncinatus”, Phytochemistry, 58(4), 607 – 610.
31.Sa Wang Baek, E Ray Kim, Jinwoong Kim and Young Choong Kim
(2011), “Chemical Constituents of Abies koreana Leaves with Inhibitory Activity against Nitric Oxide Production in BV2 Microglia Cells”,
Natural Product Sciences, 17(3), 175 – 180.
32.Shih-Hua Fang, Yerra Koteswara Rao, Yew-Min Tzeng (2005),
“Inhibitory effects of flavonol glycosides from Cinnamomum
osmophloeum on inflammatory mediators in LPS/IFN-γ-activated murine
macrophages” , Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13(7), 2381 – 2388.
33.Ting-Yu Lin, Jiunn-Wang Liao, Shang-Tzen Chang and Sheng-Yang
Wang (2011), “Antidyslipidemic Activity of Hot-water Extracts from
Leaves of Cinnamomum osmophloeum Kaneh”, Phytotherapy Research,
25(9), 1317 – 1322.
34.Thomas S.C. Li, Ph.D (2006), Taiwanese Native Medicinal Plants –
66
35.Wang TC, Lin CC, Lee HI, Yang C, Yang CC (2010), “Anti-
hyperlipidemic activity of spider brake (Pteris multifida) with rats fed a high cholesterol diet”, Pharm Biol., 48(2), 221 – 226.
36.Wang TC, Ti MC, Lo SC, Yang CC (2007), “Free radical-scavenging
activity of aqueous extract of Pteris multifida Poiret”, Fitoterapia, 78, 248 – 249.
37.Wang WS, Wang ZQ, Zhou YW. (2008), “Studies on chemical
constituents from Pteris multifida”, Zhong Yao Cai., 31(8), 1165 – 1167.
38.Woerdenbag HJ, Lutke LR, Bos R, Stevens JF, Hulst R, Kruizinga
WH, Zhu YP, Elema ET, Hendriks H, van Uden W, Pras N. (1996), “Isolation of two cytotoxic diterpenes from the fern Pteris multifida”,
Zeitschrift fuer Naturforschung C., 51(9-10), 635 – 638.
39.Xin Ge, Guan Ye, Ping Li, Wen-Jie Tang, Jin-Li Gao and Wei-Min Zhao
(2008), “Cytotoxic Diterpenoids and Sesquiterpenoids from Pteris
multifida”, J. Nat. Prod., 71(2), 227 – 231.
40.Xu-dong Zheng, Hao-bin Hu and Huai-sheng Hu (2008), “A New
Neolignan Glycoside from Pteris multifida Poir.”, Bull. Korean Chem. Soc., 29(6), 1250 – 1252.
41.Yerra Koteswara Raoa, Madamanchi Geethangilia, Hsiao-Sung Chana,
Wen-Shi Wub and Yew-Min Tzenga (2009), “High-performance liquid
chromatographic determination of kaempferol glycosides in Cinnamomum
osmophloeum leaves”, International Journal of Applied Science and
Engineering, 7(1), 1 – 9.
42.Yew-Min Tzeng, Keru Chen, Yerra Koteswara Rao, Meng-Jen Lee
(2009), “Kaempferitrin activates the insulin signaling pathway and
stimulates secretion of adiponectin in 3T3-L1 adipocytes”, European
67
43.Yu C, Chen J, Huang L. (2013), “A study on the antitumour effect of total
flavonoids from Pteris multifida Poir in H22 tumour-bearing mice”, Afr J
Tradit Complement Altern Med., 10(6), 459 – 463.
44.Yung-Husan Chen, Fang-Rong Chang, Yih-Jer Lin, Lisu Wang, Jinn-Fen
Chen, Yang-Chang Wu, Ming-Jiuan Wu (2007), “Identification of
phenolic antioxidants from Sword Brake fern (Pteris ensiformis Burm.)”,
68
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ DAD của các chất đối chiếu. Phổ DAD của pic ứng với chất đối chiếu PM3
69
70
71
72
73
Phụ lục 2: Sắc ký đồ của hỗn hợp chất đối chiếu, mẫu thử cây Cỏ Seo gà và 5 hợp chất nghiên cứu.
Sắc ký đồ hỗn hợp chất đối chiếu
Co seo ga
4/14/2014 2:30:32 PM D:\Methods\pm9.met
D:\HPLC\Co seo ga\140414\PM9 don chat\PMHH PM91404001 Vial: 1 Vol Inj 20