Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý xong.
Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD 2,0%.
Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc. Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác).
Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp.
Tiến hành: tiêm lần lƣợt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký; so sánh các sắc ký đồ thu đƣợc.
Yêu cầu: tại thời gian lƣu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền.
2.3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của một phƣơng pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm đƣợc áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, đƣợc xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhƣng các lần lặp lại phải đƣợc thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.
Tiến hành: pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp
25
lại đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD 2,0%.
2.3.4.3. Độ tuyến tính và khoảng xác định
Độ tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Nó đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan r.
Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã đƣợc khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 40% đến 140% nồng độ dự kiến phân tích của mẫu.
Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
Yêu cầu: R2 0,99 (r 0,995).
2.3.4.4. Độ đúng
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực.
Cách xác định: pha dung dịch thử và dung dịch đối chiếu theo quy trình chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Thêm vào mẫu thử những lƣợng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lƣợng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lƣợng để xác định hàm lƣợng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phƣơng trình đƣờng chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Độ đúng sẽ đƣợc tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lƣợng chất đối chiếu tìm đƣợc so với lƣợng chất đối chiếu thêm vào.
26
2.3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
LOD là lƣợng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện đƣợc về mặt định tính.
LOQ là lƣợng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
Cách xác định: xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đƣờng nền (S/N). Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S). Thiết lập tỷ số S/N.
LOD: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3
lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 3/1).
LOQ: là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần
nhiễu đƣờng nền (S/N = 10/1).
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các kết quả sắc ký đƣợc xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC.
Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lƣợng đặc trƣng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel.
27
CHƢƠNG III
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN
3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu
Lấy ngẫu nhiên bột dƣợc liệu ở các vị trí khác nhau rồi xác định độ ẩm của dƣợc liệu theo phƣơng pháp mất khối lƣợng do làm khô. Kết quả thu đƣợc tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu
STT Khối lượng dược liệu trước sấy (g)
Khối lượng dược
liệu sau sấy (g) Độ ẩm (%)
1 2,0134 1,6860 16,26
2 2,0188 1,6996 15,81
3 2,0063 1,6911 15,71
Trung bình 15,93
3.1.2. Chiết xuất
Khối lượng cắn toàn phần:
Cân 50,2785 g dƣợc liệu toàn cây Cỏ Seo gà (độ ẩm 15,93%) đã đƣợc làm nhỏ, chiết siêu âm 5 lần, mỗi lần chiết siêu âm với 200 ml methanol trong thời gian 10 phút, thu dịch chiết, lọc, bốc hơi cách thủy dung môi trên tới cắn. Cắn đƣợc sấy áp suất giảm ở 60oC đến khối lƣợng không đổi, thu đƣợc 2,1410 g cắn toàn phần, bảo quản ở 4oC.
Khối lượng cắn ở các phân đoạn chiết lỏng – lỏng:
Tiến hành song song nhƣ trên cân 50,2550 g dƣợc liệu toàn cây Cỏ Seo gà (độ ẩm 15,93%) đã đƣợc làm nhỏ, chiết siêu âm 5 lần, mỗi lần chiết siêu âm với 200 ml methanol trong thời gian 10 phút. Thu dịch chiết và bốc hơi đƣợc 2,140 g cắn toàn phần. Cắn này đƣợc hòa tan vào một thể tích tối thiểu nƣớc cất nóng 60°C. Dịch chiết nƣớc đƣợc tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, cloroform, ethyl
28
acetat. Thu đƣợc 3 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi đến cắn có khối lƣợng không đổi.
Nhận xét: Để định lƣợng các hợp chất trong Cỏ Seo gà đạt kết quả tốt,
trƣớc hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Chúng tôi chọn phƣơng pháp chiết siêu âm với methanol, phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, cloroform, ethyl acetat). Đây là phƣơng pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, thời gian chuẩn bị mẫu ngắn đồng thời cho hiệu suất tƣơng đối cao.
Hiệu suất chiết cắn toàn phần:
100 (%) 100 (100 ) a X M x
Với khối lƣợng dƣợc liệu đem chiết (M) là 50,2785g có độ ẩm (x) là 15,93% và khối lƣợng cắn toàn phần thu đƣợc (a) là 2,1410g, hiệu suất thu đƣợc cắn toàn phần là 5,07%.
Hiệu suất chiết cắn ở các phân đoạn:
Hiệu suất cắn của 3 phân đoạn so với cắn toàn phần của cây Cỏ Seo gà đƣợc trình bày trong bảng 3.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.2. Hiệu suất chiết cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây Cỏ Seo gà.
STT Phân đoạn Khối lƣợng cắn (g)
Hiệu suất chiết (%) so với cắn toàn phần
1 n-hexan 0,8250 38,55
2 Cloroform 0,2180 10,19
3 Ethyl acetat 0,1150 5,37
29
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký
Vì mẫu phân tích là dƣợc liệu có nhiều thành phần nên cần có sự tách tốt và thời gian phân tích phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên loại cột C18 với kích thƣớc hạt nhồi là 5µm và chiều dài cột là 10 cm, 15cm và 25 cm.
Với cột Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm 4,6 mm, 5 µm)
hoặc cột Chromolith RP18e 130A (100 mm x 4,6 mm) có kích thƣớc hạt 5µm
kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4 30 mm ID), bằng nhiều hệ
dung môi khác nhau thu đƣợc các sắc ký đồ trong đó các pic không tách riêng đƣợc (hình 3.1). Trong số các cột khảo sát, chỉ có cột Zobax Eclipse XBD –
C18 (250 mm 4,6 mm, 5 µm) là phù hợp, cho các pic tách tốt, thời gian lƣu
hợp lý (hình 3.4, 3.5).
Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các hệ dung môi khác nhau.
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 1 P M 3 5.042 2 P M 12 9.217 3 P M 18 11.325 4 P M 15 11.600 5 P M 9 15.233 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 AU 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 1 P M 3 4.908 P 2 M 12 9.258 3 P M 18 10.950 4 P M 15 11.117 5 P M 9 14.983
30
3.2.2. Lựa chọn pha động
Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột Zobax Eclipse XBD – C18
(250 mm 4,6 mm, 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4
30 mm ID). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25o
C.
Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động với các hệ dung môi: methanol – nƣớc (có 0,1% acid formic), acetonitril – methanol (có 0,1% acid formic), acetonitril – nƣớc (có 0,1% acid formic) với tỷ lệ thành phần khác nhau.
Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) và nƣớc có 0,1% acid formic (kênh B) với chế độ gradient dung môi cho kết quả tốt nhất. Với chƣơng trình dung môi tỷ lệ A:B sử dụng ban đầu là (5:95), thay đổi tuyến tính đến (9:91) ở phút thứ 4, rồi thay đổi tuyến tính đạt tới (16:84) ở phút thứ 5, duy trì đến phút thứ 12, sau đó tiếp tục thay đổi tuyến tính tới (28:72) ở phút thứ 22, thay đổi tuyến tính trở về tỷ lệ ban đầu (5:95) ở phút 29, duy trì đến phút 30 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt cả 5 hợp chất cần phân tích, cho pic nhọn, cân đối và thời gian lƣu hợp lý, thời gian phân tích không quá dài. Vì vậy, hệ dung môi trên đƣợc chọn làm pha động trong nghiên cứu này.
3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Tiến hành khảo sát ở các tốc độ dòng khác nhau 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút; 1,1 mL/phút và 1,2 mL/phút. Kết quả cho thấy tốc độ dòng 1,0 mL/phút là phù hợp vì kết quả tách tốt, pic cân đối, thời gian lƣu hợp lý.
3.2.4. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện
Lấy phổ UV – Vis từ máy HPLC với detector DAD của các pic tƣơng ứng với chất nghiên cứu. Hình ảnh phổ UV - Vis của các chất nghiên cứu đƣợc thể hiện trong hình 3.2, độ hấp thụ quang tại một số bƣớc sóng đƣợc ghi trong bảng 3.3.
31 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PM3 PM12
PM18 PM15
PM9
Hình 3.2. Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu
32
Bảng 3.3. Một số thông số trên phổ UV-Vis của các chất nghiên cứu.
PM3 PM12 PM18 PM15 PM9 (nm) A (mAU) (nm) A (mAU) (nm) A (mAU) (nm) A (mAU) (nm) A (mAU) 190 15,9 190 15,3 198 105,5 200 38,6 198 80,1 198 12,8 206 34,6 218 46,7 238 16,3 226 37,0 210 20,7 230 31,0 226 47,4 264 25,3 264 51,1 228 9,1 250 5,1 264 67,3 286 10,6 286 22,3 258 24,0 264 14,8 286 28,1 344 17,4 342 34,7 264 20,9 280 25,3 342 45,2 298 19,2 312 21,1
Các số liệu cho thấy cả 3 chất PM18, PM15 và PM9 đều hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng = 264 nm, 2 chất còn lại là PM3 có cực đại ở 258 nm và
PM12 có cực đại ở 280 nm và chúng đều có độ hấp thụ tại = 264 nm tƣơng
đối lớn. Detector DAD này chỉ đƣa ra các kết quả ở các bƣớc sóng chẵn, mặt khác khi quét phổ UV – Vis bằng máy quang phổ UV – Vis, cả 3 chất PM18,
PM15 và PM9 đều hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng = 265 nm (hình 3.3). Do
vậy, chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng 265 nm cho các nghiên cứu tiếp theo để tất cả các chất đều có thể cho pic có diện tích đủ lớn.
Nhƣ vậy, qua quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký nhƣ sau:
Cột: Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm 4,6 mm, 5 µm) kết hợp cột
bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4 30 mm ID), nhiệt độ 25oC.
Pha động: sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) và nƣớc có 0,1% acid formic (kênh B) với chế độ gradient dung môi. Tỷ lệ A:B sử dụng ban đầu là (5:95), thay đổi tuyến tính đến (9:91) ở phút thứ 4, rồi thay đổi
33
tuyến tính đạt (16:84) ở phút thứ 5, duy trì đến phút thứ 12, sau đó tiếp tục thay đổi tuyến tính tới (28:72) ở phút thứ 22, thay đổi tuyến tính trở về tỷ lệ ban đầu (5:95) ở phút 29, duy trì đến phút 30.
Detector SPD-10AVP với = 265 nm.
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.
Thể tích tiêm: 20 L.
Với điều kiện sắc ký nhƣ trên, các chất trong hỗn hợp chuẩn và trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết toàn phần Cỏ Seo gà đều đƣợc tách tƣơng đối tốt, pic cân đối, thời gian lƣu hợp lý. Các SKĐ thu đƣợc nhƣ ở hình 3.4 và hình 3.5.
Hình 3.4. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu.
Hình 3.5. SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ Seo gà.
Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.00 0.05 0.10 1 PM3 2 P M 1 2 3 P M 1 8 4 P M 1 5 5 PM9 Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.00 0.05 0.10 1 PM3 2 P M 1 2 3 P M 1 8 4 P M 1 5 5 PM9
34
Tiến hành sắc ký với từng hợp chất nghiên cứu (hình 3.6 đến hình 3.10) và so sánh với SKĐ thu đƣợc của hỗn hợp 5 chất (hình 3.4) xác định đƣợc thời gian lƣu của các chất PM3, PM12, PM18, PM15 và PM9 lần lƣợt là khoảng 6,1; 10,0; 10,5; 10,9 và 19,2 phút.
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ
Thực hiện chƣơng trình sắc ký đã chọn ở mục 3.2 với 5 hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà thu đƣợc các SKĐ nhƣ ở các hình 3.6 – 3.10.
Các SKĐ ở các hình cho thấy cả 5 hợp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên do lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc còn ít và chƣa đủ thời gian cho phép để thiết lập chất chuẩn, do vậy chúng tôi tạm dùng chúng nhƣ chất đối chiếu để khảo sát phƣơng pháp định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. SKĐ của hợp chất PM3 phân lập được từ Cỏ Seo gà.
Hình 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập được từ Cỏ Seo gà.
Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 1 PM3 Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 1 PM1 2
35
Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ Seo gà.
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ Seo gà.
Hình 3.10. SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ Seo gà.
Tiến hành so sánh phổ UV-Vis trên máy HPLC với detector DAD của các pic có cùng thời gian lƣu trên sắc ký đồ với hỗn hợp chất đối chiếu và mẫu thử là dịch chiết Cỏ Seo gà. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.11 và hình 3.12.
Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 1 P M1 8 Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 1 P M1 5 Minutes 0 5 10 15 20 25 30 AU 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 1 PM9
36
PM 3 chuẩn PM 3 thử
Hình 3.11. Phổ UV – Vis với detector DAD của pic tương ứng cùng thời gian lưu giữa phổ chuẩn và thử PM3.
PM 12 PM 18
PM 15 PM 9
Hình 3.12. Chồng phổ UV – Vis với detector DAD của pic tương ứng cùng thời gian lưu giữa phổ mẫu thử và chất đối chiếu.
37
Kết quả thu đƣợc khi tiến hành chồng phổ UV – Vis với detector DAD của phổ chất đối chiếu và phổ mẫu thử với cùng thời gian lƣu cho hệ số Match của các chất lần lƣợt nhƣ sau: PM3 là 988,20; PM12 là 999,11; PM18