1.3.4.1. Định tính [1]
Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:
So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời
gian lƣu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã
thêm chuẩn đối chiếu.
So sánh phổ UV-Vis (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối chiếu
bằng detector DAD thông qua hệ số match.
Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm
chức (IR) hoặc số khối (MS).
1.3.4.2. Định lượng [2]
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký:
Phƣơng pháp chuẩn ngoại
Phƣơng pháp chuẩn nội
Phƣơng pháp thêm chuẩn
16
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng pháp chuẩn ngoại.
Đây là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.
Chuẩn hóa 1 điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
X X S S S C C S trong đó: CX: nồng độ chất thử CS: nồng độ chất chuẩn
SX (HX): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử SS (HS): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn
Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu đƣợc là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:
Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đƣờng chuẩn
sẽ suy ra đƣợc nồng độ của nó.
Xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc
chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định.
17 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
S a C b S: Diện tích pic
a: Độ dốc của đƣờng chuẩn
b: Giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung C: Nồng độ của chất thử
Dựa vào phƣơng trình hồi quy này ta tính đƣợc nồng độ chất thử:
S b C
a
Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong
khoảng nồng độ tuyến tính của đƣờng chuẩn.