bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong nấm linh chi bằng phương pháp uv – vis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ BÙI THỊ NGỌC HÂN BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Ngành CỬ NHÂN HÓA HỌC Mã ngành: 52440112 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ BÙI THỊ NGỌC HÂN BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Ngành CỬ NHÂN HÓA HỌC Mã ngành: 52440112 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG 2013 Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự – Hạnh phúc Bộ môn: Hóa học ------ NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán hướng dẫn: Ths. Nguyễn Thị Ánh Hồng Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng nấm Linh chi phương pháp UV – Vis. Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244 Lớp Hóa học – Khóa 36 Nội dung nhận xét: Nhận xét hình thức luận văn tốt nghiệp: Nhận xét nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực đề tài: . Những vấn đề hạn chế: Nhận xét sinh viên thực đề tài: Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày . tháng . năm 2013 Cán hướng dẫn Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự – Hạnh phúc Bộ môn: Hóa học ------ NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện: Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng nấm Linh chi phương pháp UV – Vis. Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244 Lớp Hóa học – Khóa 36 Nội dung nhận xét: Nhận xét hình thức luận văn tốt nghiệp: Nhận xét nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực đề tài: . Những vấn đề hạn chế: Nhận xét sinh viên thực đề tài: Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày . tháng . năm 2013 Cán phản biện Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự – Hạnh phúc Bộ môn: Hóa học ------ NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện: Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng nấm Linh chi phương pháp UV – Vis. Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244 Lớp Hóa học – Khóa 36 Nội dung nhận xét: Nhận xét hình thức luận văn tốt nghiệp: Nhận xét nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực đề tài: . Những vấn đề hạn chế: Nhận xét sinh viên thực đề tài: Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày . tháng . năm 2013 Cán phản biện Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự – Hạnh phúc Bộ môn: Hóa học ------ NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện: Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng nấm Linh chi phương pháp UV – Vis. Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244 Lớp Hóa học – Khóa 36 Nội dung nhận xét: Nhận xét hình thức luận văn tốt nghiệp: Nhận xét nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực đề tài: . Những vấn đề hạn chế: Nhận xét sinh viên thực đề tài: Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày . tháng . năm 2013 Cán phản biện Luận văn Đại học – Hóa học LỜI CAM ĐOAN Tất liệu số liệu sử dụng nội dung luận văn tham khảo từ nhiều nguồn tài liệu khác ghi nhận từ kết mà tiến hành khảo sát suốt trình làm luận văn. Tôi xin cam đoan số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình luận văn trước đây. Bùi Thị Ngọc Hân Bùi Thị Ngọc Hân i 2102244 Luận văn Đại học – Hóa học LỜI CÁM ƠN -----Để đạt kết hôm nay, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô môn Hóa–Khoa Khoa Học Tự Nhiên. Các Thầy Cô nhiệt tình truyền đạt kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm thực tế, hành trang vô quý báu không để hoàn thành đề tài tốt nghiệp mà hỗ trợ nhiều đường nghiệp sau này. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Ánh Hồng, cô hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình làm đề tài chỉnh sửa viết cẩn thận. Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Diệp Chi nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn Công ty cổ phần Dược Hậu Giang cung cấp mẫu để thực đề tài này. Cảm ơn thành viên lớp Hóa học Khóa 36 chia sẻ đồng hành chặng đường vừa qua. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình chỗ dựa vững vật chất lẫn tinh thần. Chân thành cảm ơn BÙI THỊ NGỌC HÂN Bùi Thị Ngọc Hân ii 2102244 Luận văn Đại học – Hóa học TÓM TẮT Đề tài nhằm mục đích khảo sát hàm lượng triterpenoid tổng có số mẫu nấm Linh chi cung cấp Công ty cổ phần Dược Hậu Giang phương pháp UV–Vis với chất chuẩn Oleanolic acid nồng độ 100 ppm. Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích cách xây dựng thí nghiệm xác định khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát giới hạn định lượng. Trên sở xác định hàm lượng triterpenoid tổng số 10 mẫu nấm Linh chi đem phân tích. Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp đề áp dụng vào định lượng triterpenoid tổng với đường chuẩn Oleanolic acid có hệ số tương quan R = 0,9999, độ phương pháp đạt 99,36%, độ lặp lại có RSD nhỏ 2%, LOD LOQ vào khoảng 0,3 0,9 ppm. Trong số 10 mẫu nấm Linh chi đem phân tích mẫu số chứa hàm lượng triterpenoid nhiều (12361 mg/kg chiếm 1,236% số thành phần có nấm Linh chi) mẫu số chứa hàm lượng triterpenoid thấp (6649 mg/kg chiếm 0,665%). Kết đề tài làm sở cho việc đánh giá chất lượng loại nấm Linh chi bán trôi thị trường nay, đồng thời giúp ích cho việc lựa chọn giống Linh chi tốt để nuôi trồng qui mô công nghiệp nước ta nay. Từ khóa: triterpenoid tổng, nấm Linh chi. Bùi Thị Ngọc Hân iii 2102244 Luận văn Đại học – Hóa học ABSTRACT The theme aims to servey the total triterpenoid content in some Lingzhi samples that provided by Hau Giang Pharmaceutical Corporation and some other samples are bought floating at the Can Tho city by the method UV–Vis with standard substance is working Oleanolic acid concentration 100 ppm. Proceed evaluation of analytical methods by constructing experiments is to determine the linear range, accuracy, repeatibility, limit of detection and limit of quantification. Base on that, were determined the total triterpenoid content in ten Lingzhi samples. The research result show that the proposed method can be applied to quantify the total triterpenoid content base on standard curve of Oleanolic acid with correlation coefficient R = 0,9999, the accuracy of method achieve 99,36%, the repeatibility has RSD less than 2%, LOD and LOQ are about 0,3 and 0,9 ppm, respectively. Among the ten samples taken Lingzhi analyzed, the no.2 contained most triterpenoid content (12361 mg/kg occupies 1.236% in the number of component in Lingzhi) and no.4 contained the lowest concentration of triterpenoid (6649 mg/kg accounts for 0.665%). The result of the study as a basis for evaluating the quality of Lingzhi are free to sold in the current market, and help the cultivation of the best varieties Lingzhi at industrical scale in our country today. Keyword: the total triterpenoid, Lingzhi. Bùi Thị Ngọc Hân iv 2102244 Luận văn Đại học – Hóa học 3.2.1.3 Xác định độ lặp lại phương pháp Để xác định độ lặp lại phương pháp, chuẩn bị song song 10 dung dịch chuẩn Oleanolic acid ppm theo qui trình xây dựng 3.1.6, kết trình bày Bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết kiểm tra độ lặp lại phương pháp Mẫu Nồng độ (ppm) 1,882 1,869 1,878 1,888 1,856 1,886 1,891 1,875 1,863 10 1,883   X SD 1,8771 0,0114 Tính toán độ lệch chuẩn tương đối RSD (%): RSD  SD 0,0114 100  100  0,607%  2% X 1,8771 Với kết RSD tính toán 0,607% nhỏ 2%, mức lệch phù hợp với lý thuyết đưa để thẩm định phương pháp trước phương pháp áp dụng để định lượng hoạt chất. 3.2.1.4 Giới hạn phát (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ) Để xác định giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, tiến hành thêm dung dịch chuẩn Oleanolic acid ppm vào 10 mẫu thử tiến hành xử lý theo qui trình xây dựng mục 3.1.6. Kết trình bày Bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết kiểm tra (LOD) (LOQ) Mẫu Nồng độ (ppm) Bùi Thị Ngọc Hân 39 1,876 1,745 1,827 1,6367 1,7755 1,867 1,945 2102244 Luận văn Đại học – Hóa học 10 1,765 1,6959 1,816 1,7949  0,091 X  SD LOD = 3,3*SD 0,3003 X LOD 6,575 LOQ = 10*SD 0,91 R Qua kết tính toán, giới hạn phát (LOD) phương pháp mức 0,3003 ppm. Với R = 6,575 (4 < R [...]... thí nghiệm Trong đó phương pháp UV Vis là phương pháp được ứng dụng rộng rãi và đáp ứng được các yêu cầu nêu trên Do vậy mà chúng tôi thực hiện đề tài Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV Vis nhằm đưa ra phương pháp đơn giản, hiệu quả và với độ chính xác cao để xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấm Linh chi được cung... triterpenoid trong nấm Linh chi bằng ethanol 96%  Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV Vis với Oleanolic acid (nồng độ 100 ppm) làm chất chuẩn  Áp dụng phương pháp đã được thẩm định vào phân tích hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấm Linh chi được cung cấp bởi Công ty Dược Hậu Giang Bùi Thị Ngọc Hân 2 2102244 Luận văn Đại học – Hóa học... quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu:  Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)  Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)  Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)  Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)  Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)  Tử chi (Linh chi tím) Cho đến nay nấm Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà mang tính toàn cầu Hiện... chống khối u, làm giảm lượng cholesterol trong máu cũng như là ngăn chặn sự kết dính các tiểu cầu,… Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid thay đổi theo từng giống nấm Linh chi, môi trường nuôi trồng và giai đoạn bào tử của nấm Linh chi Do đó, cần phải có phương pháp tách chi t cũng như phương pháp định lượng triterpnoid tổng trong nấm Linh chi một cách có hiệu quả, đơn giản, với độ chính xác cao và phù hợp... PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG 25 2.1 Phương pháp chi t triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của sóng siêu âm 25 2.2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV - Vis 26 2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 27 2.3.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định 27 2.3.2 Nội dung thẩm định 27 2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity)... khác, có thể bảo quản nấm Linh chi khô trong thời hạn từ 6 tháng trở lên trong điều kiện khô ráo ở nơi thoáng mát Có 2 phương pháp để làm khô nấm Linh chi đó là phương pháp “phơi nắng” và phương pháp “sấy khô” (dùng hơi nóng) để bảo quản Phương pháp phơi nắng Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng nguồn năng lượng từ tự nhiên là năng lượng mặt trời  Ưu điểm:  Tiết kiệm chi phí và công sức ... 31 Hình ảnh 10 mẫu nấm Linh chi 32 Qui trình chi t triterpenoid tổng bằng sóng siêu âm 34 Qui trình định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi 34 Đồ thị khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn OA 35 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ OA 36 Đồ thị đường chuẩn Oleanolic acid 38 Đồ thị so sánh hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu 41 Bùi Thị... Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Nấm Linh chi 1.1.1 Khái quát chung Nấm Linh chi, viết theo kiểu phiên âm Trung Hoa là Lingzhi, tên Nhật là Reishi, ở Hàn Quốc gọi là Youngzhi, tên khoa học là Ganoderma Lucidum, ở Việt Nam nấm Linh chi còn có tên gọi là nấm Lim Nấm Linh chi còn có những tên khác như Tiên Thảo, nấm Trường Thọ, Vạn Niên Nhung Gọi là nấm nhưng khác với một số nấm ăn thông thường, nấm Linh chi có nhiều... Đại học – Hóa học làm cho nấm bị ẩm mốc, sẽ làm cho nấm trở nên độc hại hoặc làm giảm tính năng và tuổi thọ sử dụng của nấm Phương pháp sấy khô bằng máy Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng hơi nóng từ máy sấy nấm Để cho khỏi mục nát, cần phải sấy khô nhưng phương pháp sấy, tàng trữ và bảo quản phải được thi hành đúng cách Phương pháp mới nhất là sấy nấm Linh chi bằng lò sấy Để sấy nấm người... hoạt chất thuộc nhóm triterpenoid trên thế giới đã được thực hiện bằng nhiều phương pháp bởi nhiều nhà khoa học khác nhau Trong đó, để xác định hàm lượng triterpenoid tổng thì phương pháp được sử dụng phổ biến nhất đó là phương pháp so màu, trong nhiều công trình của nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này thì có một số điểm khác biệt giữa các qui trình như là: khác nhau về bước sóng hấp thụ, . định phương pháp phân tích 27 2. 3.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định 27 2. 3 .2 Nội dung thẩm định 27 2. 3 .2. 1 Độ tuyến tính (Linearity) 27 2. 3 .2. 2 Độ đúng (Accuracy) 28 Luận văn Đại học – Hóa. Luận văn Đại học – Hóa học Bùi Thị Ngọc Hân vi 21 022 44 2. 3 .2. 3 Độ lặp lại 29 2. 3 .2. 4 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection) 29 2. 3 .2. 5 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification). TRITERPENOID TỔNG 25 2. 1 Phương pháp chiết triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của sóng siêu âm 25 2. 2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV - Vis 26 2. 3 Thẩm