Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau bằng phương pháp uplc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Huỳnh Thị Hồng Ngọc Luận văn Thạc sĩ Dược học – Khóa: 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS Huỳnh Thị Hồng Ngọc Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân, PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Từ khóa: abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos- ethyl, chlorpyriphosmethyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, thuốc BVTV, LC-MS/MS, rau Mở đầu: Rau ăn nhóm nơng sản xếp vào nhóm nguy bị nhiễm thuốc bảo vệ thực vật nhiều Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc BVTV không hợp lý gây nên tượng dư lượng thuốc BVTV rau vượt mức quy định gây ảnh hưởng sức khỏe người tiêu dùng Hiện nay, nồng độ 0,01 mg/kg xem mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) chung thuốc chưa có quy định Đây mức giới hạn thấp đòi hỏi phương pháp phân tích đủ nhạy Trong nước, nghiên cứu dư lượng thuốc BVTV rau bằng LC-MS/MS chủ yếu phân tích nhóm, chưa có cơng bố định lượng đồng thời 10 thuốc BVTV trên, đặc biệt mẫu rau Đối tượng phương pháp nghiên cứu Quy trình định lượng đồng thời abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon mẫu rau ăn thực hệ thống ACQUITY UPLC H-CLASS SYSTEM (Waters) ghép đầu dò khối phổ Xevo TQ- Smicro (Waters) với phận ion hóa phun điện tử Phương pháp xử lý mẫu bằng phương pháp QuEChERS tối ưu Quy trình định lượng thẩm định theo hướng dẫn AOAC EC-657/2002 Kết quả: abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphosmethyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon nội chuẩn TPP CPR d10 ion hóa kiểu ESI với kỹ thuật ghi phổ MRM cho mảnh mẹ mảnh dùng cho định lượng Điều kiện sc ký bao gm ct Acquity UPLCđ BEH C18 (1,7àm, 2,1x 50 mm), pha động gồm: 5mm amonium acetat/ methanol 5mm amonium acetat/ 0,1% acid formic / nước theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,25 ml/phút Miền giá trị thuốc BVTV nằm khoảng 5-200 ng/ml, r2 > 0,99 Giới hạn phát từ 0,03 đến ng/ml, giới hạn định lượng từ 0,1 đến ng/ml, tất thấp giá trị MRL (0,01mg/kg hoặc 10 ng/ml) Độ thu hồi khoảng 74,47- 116,93% RSD nhỏ 16% Các tiêu tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác cho kết nằm giới hạn cho phép Kết luận: Đề tài xây dựng thẩm định thành công quy trình xác định dư lượng 10 thuốc BVTV thường phun rau bằng phương pháp LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu độ xác cao Do phương pháp ứng dụng để xác định mẫu rau nhiễm dư lượng thuốc BVTV thị trường Master’s Thesis – Academic course: 2016 - 2018 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DETERMINATION OF POPULAR PESTICIDE RESIDUES IN VEGETABLES BY LC-MS/MS Huynh Thi Hong Ngoc Supervisor: Assoc Prof Nguyen Thi Ngoc Van, Assoc Prof Vo Thi Bach Hue Keywords: : abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, pesticides, LC-MS/MS, vegetables Introduction: Leafy vegetables contained the highest amounts of pesticide residues However, the use of pesticides unreasonable cause pesticide residues in vegetables above the maximum residue limits (MRLs) can negatively affect human health A general default MRL of 0.01 mg/kg applies where a pesticide is not specifically mentioned At this level, analytical methods must be sensitive enough to quantitate low levels In Viet Nam, there are some studies analyzing pesticides residues by LC-MS/MS methods but mainly on one or two group There is no published quantitative information on these 10 pesticides, especially in vegetables Materials and methods: A method for quantification of abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon in leafy vegetables was been developed using Acquity UPLC H–Class system and Xevo TQ- Smicro mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source The modified QuEChERS procedure was used for sample preparation The assay was validated in compliance with AOAC and EC guideline Results: The detection of target compounds was done in multiple-reaction-monitoring (MRM) mode using a tandem mass spectrometry equipped with positive and negative ionswitching ESI source LC conditions: column Acquity UPLCđ BEH C18 (1.7àm, 2.1x 50 mm), mobile phase gradient mode including 5mm amonium acetat/ methanol 5mm amonium acetat/ 0,1% acid formic/ water, flow rate of 0,25 ml/min This method was validated base on AOAC and EC guideline, which met the requirements of widely linearity range of 5-200 ng/ml and high correlation coefficient (r2 > 0.99), very good accuracy (recovery rate 74,47- 116,93%) and intra-day precision (RSD < 16%), typical LOD, LOQ values of 0.03-1 ng/ml and 0.1- ng/ml for 10 pesticides Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid LC-MS/MS method for simultaneous determination of 10 pesticides in leafy vegetables was successfully developed and validated This method can be useful for monitoring level of these pesticides in vegetables MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU .vi DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 1.1.1 Một số khái niệm .3 1.1.2 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật 1.1.3 Sơ lược thuốc bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu 1.1.4 Sơ lược thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamat 1.1.5 Sơ lược thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid 10 1.1.6 Sơ lược thuốc bảo vệ thực vật nhóm neonicotinoid 12 1.1.7 Sơ lược thuốc bảo vệ thực vật nhóm macrocyclic lacton 14 1.1.8 Một số thuốc thuốc BVTV nghiên cứu thuộc nhóm khác .16 1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV 18 1.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU QUECHERS 20 1.3.1 Giới thiệu phương pháp QuEChERS 20 1.3.2 Quy trình chung phương pháp QuEChERS .20 1.3.3 Ứng dụng phương pháp QuEChERS 21 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG .23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 i 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Chuẩn đối chiếu sử dụng nghiên cứu 25 2.1.2 Mẫu thử nghiệm 26 2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 26 2.3 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .26 2.3.1 Hóa chất, thuốc thử 26 2.3.2 Thiết bị, dụng cụ 27 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.4.1 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV thường phun rau số huyện ở tỉnh Vĩnh Long .27 2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc BVTV thường phun rau 28 2.4.3 Thẩm định quy trình phân tích 32 2.5 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC MẪU RAU ĂN LÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .37 3.1 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN RAU .37 3.1.1 Kết chủng loại thuốc trừ sâu sử dụng 37 3.1.2 Kết phối trộn thuốc BVTV nông dân 38 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC THUỐC BVTV THƯỜNG PHUN TRÊN RAU 39 3.2.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký lỏng khối phổ .39 3.2.2 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu 46 3.2.3 Thẩm định quy trình phân tích 48 i 3.3 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ PHÂN TÍCH MẪU RAU THU THẬP TẠI TỈNH VĨNH LONG .59 CHƯƠNG BÀN LUẬN 61 4.1 THỰC TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN RAU MÀU .61 4.1.1 Về địa điểm khảo sát .61 4.1.2 Thuốc BVTV thường nông dân sử dụng 61 4.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV THƯỜNG PHUN TRÊN RAU .62 4.2.1 Phương pháp phân tích bằng LC- MS/MS 62 4.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 65 4.3 Kết thẩm định quy trình phân tích .68 4.3.1 Tính tương thích hệ thống .68 4.3.2 Tính đặc hiệu, chọn lọc 69 4.3.3 Tính tuyến tính 69 4.3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng .70 4.3.5 Độ độ thu hồi .70 4.4 Dư lượng thuốc BVTV rau ăn 70 KẾT LUẬN .72 KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Chữ nguyên Ý nghĩa ACN Acetonitrile Dung môi acetonitril AOAC Association of Official Hiệp hội nhà hóa Analytical Chemists học phân tích thức Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học ở áp suất ionization khí APCI BVTV Bảo vệ thực vật CCD Colony collapse disorder Rối loạn sụt giảm bầy đàn ChE Cholinesterase CPR- d10 Chlorpyrifos- d10 CV Coefficient of variation Hệ số biến thiên d-SPE Dispersive - Solid phase Chiết phân tán pha rắn extraction 10 ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử 11 FAO Food and Agriculture Tổ chức nông lương Organization giới Gas Chromatography - Mass Sắc ký khí ghép đầu dò Spectrometry/Mass Spectrometry kết hợp lần khối phổ 12 GC- MS/MS 13 GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính 14 HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao Identification Point Điểm xác nhận 15 IP 16 IS Internal standard Chất chuẩn nội 17 LD50 Lethal dose 50 Liều chết 50 18 LOD Limit of detection Giới hạn phát 19 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng 20 MRL Maximum residue limit Giới hạn dư lượng tối đa 21 PSA Primary secondary amine Amin thứ cấp 22 QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Nhanh, dễ dàng, rẻ, hiệu Rugged, Safe quả, ổn định, an toàn 23 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 24 SD Standard deviation Độ lệch chuẩn 25 SKĐ Sắc ký đồ 26 TGCL Thời gian cách ly 27 TPP Triphenylphosphate 28 UPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid Triphenyl phosphat Sắc ký lỏng siêu hiệu Chromatography - Mass ghép đầu dò kết Spectrometry/Mass hợp lần khối phổ Spectrometry 29 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-28 Sắc ký đồ thẩm định tính thương thích hệ thống của CPR d10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-29 PHỤ LỤC DỮ LIỆU TÍNH ĐẶC HIỆU, CHỌN LỌC Tỉ lệ ion 10 thuốc BVTV mẫu chuẩn Tỉ lệ ion 10 thuốc BVTV mẫu trắng thêm chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-30 PHỤ LỤC DỮ LIỆU TÍNH TUYẾN TÍNH, ĐƯỜNG CHUẨN Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-31 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-32 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-33 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-34 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-35 PHỤ LỤC DỮ LIỆU ĐỘ ĐÚNG, ĐỘ CHÍNH XÁC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-36 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-37 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-38 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-39 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-41 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... UPLC- MS/ MS ” thực với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình xử lý mẫu để phân tích thuốc bảo vệ thực vật thường phun rau Thẩm định quy trình xác định dư lượng loại thuốc bảo vệ thực vật thường phun rau. .. ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC- MS/ MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc –... bằng phương pháp UPLC- MS/ MS Ứng dụng quy trình thẩm định để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật rau thị trường 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 1.1.1