Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và acid clavulanic trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI- 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ KHÁNH HUYỀN 1301194 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Phương Nhung ThS Vũ Ngân Bình Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lòng biết ơn vô sâu sắc tới ThS Vũ Ngân Bình ThS Nguyễn Phương Nhung dành nhiều thời gian tâm huyết, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, định hướng đặc biệt cho ý kiến quý báu suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất tạo điều kiện giúp đỡ hồn thành đề tài Tơi xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè người ln sát cánh bên tơi, động viên khích lệ tơi giúp tơi hồn thành tốt đề tài Hà Nội, ngày 16 tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Khánh Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan amoxicilin acid clavulanic 1.1.1 Đặc điểm amoxicilin acid clavulanic 1.1.2 Các dạng bào chế 1.1.3 Đặc điểm dược động học 1.2 Một số phương pháp phân tích amoxicilin acid clavulanic huyết tương 1.3 Kỹ thuật HPLC 1.4 Tổng quan xử lý mẫu dịch sinh học CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.2.1 Nguyên vật liệu 2.2.2 Thiết bị 2.3 Nội dung nghiên cứu 10 2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký xử lý mẫu 10 2.3.2 Thẩm định phương pháp 10 2.4 Phương pháp nghiên cứu 10 2.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký xử lý mẫu 10 2.4.2 Thẩm định phương pháp 11 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .14 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký xử lý mẫu 14 3.1.1 Lựa chọn cột sắc ký 14 3.1.2 Lựa chọn chất chuẩn nội 15 3.1.3 Lựa chọn pha động 16 3.1.4 Lựa chọn bước sóng phát 20 3.1.5 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương 21 3.1.6 Điều kiện sắc ký xây dựng 24 3.2 Thẩm định phương pháp 24 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 24 3.2.2 Độ chọn lọc 25 3.2.3 Đường chuẩn .25 3.2.4 Độ xác, độ ngày .28 3.2.5 Độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 29 BÀN LUẬN 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN Acetonitril AMX Amoxicilin CEF Cefadroxil CLA Acid clavulanic HQC High quality control Mẫu chuẩn nồng độ cao HTT Huyết tương trắng HT Huyết tương KS Kháng sinh IS Internal standard Chuẩn nội LC – MS Sắc ký lỏng khối phổ LQC Low quality control Mẫu chuẩn nồng độ thấp MeOH Methanol MQC Medium quality control Mẫu chuẩn nồng độ trung bình Ppm Part per million Phần triệu RSD Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn TB Giá trị trung bình CV Hệ số biến thiên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm amoxicilin acid clavulanic Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng AMX CLA dịch sinh học .5 Bảng 2.1 Bảng pha dung dịch chuẩn Bảng 3.1 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống 24 Bảng Kết khảo sát đường chuẩn CLA 26 Bảng 3 Kết khảo sát đường chuẩn AMX 27 Bảng 3.4 Kết độ đúng, độ xác ngày acid clavulanic 28 Bảng 3.5 Kết độ đúng, độ xác ngày amoxicilin 29 Bảng 3.6 Độ ổn định dài ngày CLA mẫu huyết tương 30 Bảng 3.7 Độ ổn định dài ngày AMX mẫu huyết tương 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1 Sắc ký đồ AMX cột C8 14 Hình 3.2 Sắc ký đồ AMX cột C18 14 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo cefadroxil 15 Hình 3.4 Sắc ký đồ huyết tương trắng với đệm phosphat 50 mM pH 3,5 16 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu AMX, CLA, CEF HT với đệm phosphat 50 mM pH 3,5 .17 Hình 3.6 Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 50 mM, pH 2,5, tỷ lệ thể tích 93:7 18 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu HT AMX, CLA, CEF với pha động đệm phosphat 50 mM, pH 2,5, tỷ lệ thể tích 93:7 18 Hình 3.8 Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 50 mM pH 2,5 18 Hình 3.9 Sắc ký đồ AMX, CLA, CEF HT với pha động đệm phosphat 50 mM pH 2,5 19 Hình 3.10 Sắc ký đồ HTT với pha động đệm phosphat 100 mM pH 2,5 19 Hình 3.11 Sắc ký đồ AMX, CLA, CEF HT với pha động đệm phosphat 100 mM pH 2,5 19 Hình 3.12 Phổ hấp thụ tử ngoại AMOX 20 Hình 3.13 Phổ hấp thụ tử ngoại CLA 20 Hình 3.14 Phổ hấp thụ tử ngoại CEF .20 Hình 15 Chồng phổ CLA dung dịch chuẩn CLA mẫu huyết tương 22 Hình 16 Hệ số chồng phổ CLA 22 Hình 3.17 Quy trình xử lý mẫu amoxicilin acid claculanic huyết tương 23 Hình 3.18 Sắc ký đồ huyết tương trắng .25 Hình 3.19 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn huyết tương .25 Hình 3.20 Đường chuẩn acid clavulanic theo chuẩn nội 26 Hình 3.21 Đường chuẩn amoxicilin theo chuẩn nội 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Amoxicilin kháng sinh nhóm β-lactam có phổ diệt khuẩn rộng nhiều vi khuẩn Gram âm Gram dương Amoxicilin bền với β-lactamase, thường phối hợp với acid clavulanic chất ức chế β-lactamase để tăng khả kháng khuẩn Amoxicilin acid clavulanic có danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam, danh mục thuốc chủ yếu sử dụng sở khám chữa bệnh quỹ bảo hiểm y tế toán sử dụng rộng rãi điều trị…[3] Mơ hình dược động học thuốc cá thể bệnh nhân đặc biệt bệnh nhân nặng bệnh nhân suy giảm chức gan, thận có dao động lớn Đặc biệt sử dụng thuốc với liều cao có tượng kết tủa cặn tinh thể nước tiểu [6] Vì việc theo dõi nồng độ thuốc máu bệnh nhân sử dụng thuốc amoxicilin acid clavulanic nồng độ cao quan trọng việc giám sát hiệu điều trị, hạn chế tác dụng không mong muốn trình sử dụng thuốc Amoxicilin kháng sinh sản xuất phổ biến Việt Nam Tính từ năm 2010 đến năm 2015 có 182 số đăng ký nước cấp phép để sản xuất amoxicilin Để nâng cao chất lượng khả cạnh tranh chế phẩm, số nhà sản xuất hướng tới đánh giá tương đương sinh học thuốc sản xuất nước thuốc generic Như vậy, sản xuất lâm sàng cần phương pháp xác định nồng độ amoxicilin acid clavulanic huyết tương Hiện có nhiều nghiên cứu định lượng amoxicilin acid clavulanic huyết tương công bố, phần lớn sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao kết nối detector tử ngoại khả kiến sau tạo dẫn xuất với imidazol [5] phân tích trực tiếp sắc ký lỏng khối phổ sau chiết pha rắn [14] Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ đắt tiền chưa phổ biến, việc dẫn xuất hóa làm cho trình xử lý mẫu phức tạp Do tiến hành thực đề tài: “Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng amoxicilin acid clavulanic huyết tương” với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định lượng trực tiếp amoxiclin acid clavulanic huyết tương người sắc ký lỏng hiệu cao Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học FDA CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan amoxicilin acid clavulanic 1.1.1 Đặc điểm amoxicilin acid clavulanic • Cơng thức cấu tạo số đặc điểm amoxicillin (AMX) (dưới dạng trihydrat) acid clavulanic (CLA) tổng hợp bảng 1.1 Bảng 1.1 Đặc điểm amoxicilin acid clavulanic Amoxicilin trihydrat Acid clavulanic C16H19N3O5S 3H2O C8H8NO5 Acid(2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2 amino- (2R,3Z,5R)-3-(2- 2-(4-hydroxyphenyl) acetyl] hydroxyethyliden)-7-oxo-4- amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia- oxa-1-azabicyclo[3.2.0] heptan- 1-azabicyclo [3.2.0 ]heptan-2- 2-carboxylic [17] Công thức cấu tạo Công thức phân tử Danh pháp carboxylic trihydrat [15] Tính chất lý • Bột kết tinh trắng gần • Bột kết tinh màu trắng hóa trắng Khó tan nước ethanol gần trắng, dễ hút ẩm Dễ tan 96%, thực tế khơng tan trong nước, khó tan cloroform Tan dung dịch ethanol 96%, khó tan Độ ổn định acid kiềm loãng [2] aceton [4] • pka1=3,2 pka2= 11,7 [15] • pka= 3,2 [16] • lgP =0,87 [15] • lgP= -1,5 [17] • Bị phân hủy nhanh độ ẩm cao • Dễ bị phân hủy nhiệt độ nhiệt độ 37oC [2] độ ẩm [10] • Ổn định mơi trường pH • Acid clavulanic ổn định 5,8- 6,5 Kém bền môi trường khoảng pH trung tính [9] Kém đệm phosphat citrat [19][20] bền dung dịch đệm phosphat, acetat borat [11] Do đề tài chúng tơi chọn hệ dung môi pha động gồm hỗn hợp dung dịch đệm phosphat 100 mM, pH 2,5 ACN tỷ lệ thể tích 97:3 làm pha động 3.1.4 Lựa chọn bước sóng phát Quét phổ hấp thụ AMX, CLA CEF ta kết hình 3.12, 3.13, 3.14: Hình 3.12 Phổ hấp thụ tử ngoại AMOX Hình 3.13 Phổ hấp thụ tử ngoại CLA Hình 3.14 Phổ hấp thụ tử ngoại CEF 20 AMX CEF có bước sóng hấp thụ cực đại khoảng 230 nm, CLA có bước sóng hấp thụ cực đại 200 nm Tuy nhiên sử dụng bước sóng 200 nm nhiễu gần với bước sóng tới hạn dung mơi pha động (ACN - 190 nm, H2O - 190 nm) [1] Tại bước sóng 230 nm, nhiễu tín hiệu đáp ứng CLA (chất phân tích có nồng độ thấp hơn) so với bước sóng 220 nm Do tơi lựa chọn bước sóng 220 nm cho khảo sát bước sóng lựa chọn sử dụng nhiều nghiên cứu trước [18] 3.1.5 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu huyết tương Tham khảo tài liệu [14][7], tơi sử dụng 500 µL MeOH để tủa protein 250 µL huyết tương trắng (HTT) thêm 50 µL hỗn hợp chuẩn AMX CLA Loại tủa ly tâm Phân tích dịch ly tâm không ghi nhận pic CLA, có pic AMX Điều giải thích CLA bị biến đổi methanol tạo thành methyl 8-hydroxy-6-oxo-4-aza-2-octenoat [11] Để giải vấn đề này, tơi lấy 500 µL dịch sau ly tâm loại protein huyết tương cô đến cắn dòng khí nitơ để đuổi dung mơi MeOH, sau hồ tan lại 200 µL nước Khi phân tích có thấy xuất pic CLA Việc mẫu tới cắn dòng khí nitơ hồ tan lại nước giúp thu lại acid clavulanic Điều chứng minh phổ pic CLA sau q trình xử lý mẫu có hình dáng giống phổ thu pic CLA dung môi nước (Hình 3.15; 3.16) hệ số chồng phổ 99,88% Tuy nhiên mẫu bị đục Tôi xử lý mẫu dịch thu sau kết tủa protein huyết tương MeOH cách chiết ngược với cloroform, lắc để yên cho phân lớp, ly tâm Sau hút 500 µL dịch phía (là pha nước chứa chất phân tích, cloroform nặng nước phía dưới) nitơ tương tự hồ tan lại 200 µL nước Kết cho thấy mẫu thu trong, khơng vẩn đục Như bước chiết ngược cloroform giúp loại bỏ thêm protein huyết tương làm mẫu Sau khảo sát trên, tơi đưa quy trình xử lý mẫu AMX CLA huyết tương gồm bước sơ đồ hố hình 3.17: Bước 1: Hút 250 µL HTT, thêm 50 µL dung dịch hỗn hợp AMX CLA pha, thêm 100 µL dung dịch chuẩn nội, lắc xốy 30 giây máy lắc xốy với tốc độ 1000 vòng/ phút 21 Bước 2: Thêm 500 µL MeOH vào hỗn hợp trộn trên, lắc xoáy 30 giây để hỗn hợp trộn với MeOH, để yên phút để tủa hoàn toàn protein huyết tương Bước 3: Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 14000 vòng/ phút 20 phút để lắng tủa Hút toàn dịch ly tâm cho vào ống eppendorf Bước 4: Thêm 500 µL chloroform vào dịch ly tâm trên, lắc xoáy 30 giây để dịch ly tâm trộn với chloroform Bước 5: Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 9000 vòng/ phút để lắng tủa phân lớp Hút 500 µL dịch chiết phía cho vào vial Bước 6: Cô cạn dung môi máy cô nitơ Bước 7: Hòa tan lại cắn 200 µL nước, lắc xốy để hòa tan hồn tồn tiến hành chạy sắc ký Hình 15 Chồng phổ CLA dung dịch chuẩn CLA mẫu huyết tương Hình 16 Hệ số chồng phổ CLA 22 250 µL HTT Thêm 50 µL dd hh AMX CLA Thêm 100 µL IS 400 µL HTT+AMX+ CLA Lắc xốy 30 giây (tốc độ 1000 vòng/ phút) Để yên phút 400 µL HTT+ KS trộn Thêm 500 µL MeOH Lắc xoáy 30 giây, để yên phút Ly tâm 14000 vòng/ phút 20 phút Dịch ly tâm+ tủa protein Hút toàn dịch ly tâm cho vào ống eppendorf Dịch ly tâm Thêm 500 µL cloroform Lắc xoáy 30 giây, để yên phút Ly tâm 9000 vòng/ phút 10 phút Dịch chiết cloroform Hút 500 µL dịch lớp vào vial 500 µL dịch chiết Bay dung mơi khí nitơ Nhiệt độ 37oC Cắn Hòa tan cắn 200 µL nước 200 µL dung dịch chạy HPLC Hình 3.17 Quy trình xử lý mẫu amoxicilin acid claculanic huyết tương 23 3.1.6 Điều kiện sắc ký xây dựng Từ kết khảo sát trên, điều kiện triển khai sắc ký lựa chọn sau: • Cột sắc ký: Cột Inertsil ® C18 ODS-3 (250 x 4,6 mm; àm,) Chun ni: Cefadroxil Pha ng: hỗn hợp dung môi gồm dung dịch đệm phosphat 100 mM; pH 2,5 ACN theo tỷ lệ 97:3, tốc độ dòng mL/ phút • Thể tích tiêm mẫu: 50 àL Detector UV: 220 nm Nhit phân tích: Nhiệt độ phòng 3.2 Thẩm định phương pháp 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống Chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa amoxicilin nồng độ khoảng 13 ppm, acid clavulanic có nồng độ khoảng 5,7 ppm, cefadroxil có nồng độ khoảng ppm tiến hành chạy sắc ký điều kiện xây dựng lần Theo hướng dẫn FDA, tính RSD giá trị thời gian lưu (tR), tỷ lệ diện tích pic Sx/SIS chất chuẩn AMX, CLA với chuẩn nội CEF để đánh giá kết bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống Lần chạy CLA tR SCLA AMX CEF tR SAMX tR SCEF SCLA/SCEF SAMX/SCEF 7,066 244,5 13,96 512,0 20,33 345,8 0,7114 1,491 7,099 244,8 13,93 506,8 20,33 350,2 0,7326 1,524 7,053 243,2 13,61 508,3 19,70 345,2 0,6993 1,486 7,044 239,7 13,75 509,5 19,95 360,2 0,6993 1,486 7,062 243,8 13,74 515,7 19,99 360,35 0,6993 1,486 7,043 246,8 13,88 507,7 20,11 359,6 0,6993 1,486 TB 7,061 243,8 13,81 510,0 20,07 353,6 0,7068 1,493 0,27 0,86 0,59 1,10 1,89 1,74 0,93 RSD 0,88 Kết khảo sát cho thấy thời gian lưu, diện tích pic AMX, CLA tỷ lệ diện tích AMX, CLA với chuẩn nội CEF nhỏ 2%, đảm bảo độ phù hợp hệ thống phương pháp định lượng chuẩn 24 3.2.2 Độ chọn lọc Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng, mẫu chuẩn đơn AMX, mẫu chuẩn đơn CLA, mẫu chuẩn đơn CEF, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn AMX, CLA CEF Xử lý mẫu tiến hành phân tích theo quy trình Kết thể hình 3.18; 3.19 Hình 3.18 Sắc ký đồ huyết tương trắng Hình 3.19 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn huyết tương Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng không xuất pic vị trí pic AMX, CLA IS Trên sắc ký đồ huyết tương trắng thêm hỗn hợp AMX, CLA, CEF xuất pic AMX, CLA, CEF thời gian lưu 7,151; 15,054; 22,21 phút Vậy phương pháp xây dựng đạt tiêu chí độ chọn lọc 3.2.3 Đường chuẩn Chuẩn bị dãy chuẩn gồm nồng độ hỗn hợp AMX CLA huyết tương trắng nồng độ CLA từ 0,818- 16,36 ppm AMX từ 1,8- 60 ppm với chuẩn nội CEF 25 có nồng độ 30 ppm Xử lý mẫu tiến hành chạy sắc ký, tính tỷ lệ diện tích AMX CLA theo chuẩn nội, xây dựng phương trình hồi quy hệ số tương quan r Đường chuẩn thể mối tương quan diện tích pic CLA nồng độ thể bảng 3.2 hình 3.20 Bảng Kết khảo sát đường chuẩn CLA Nồng độ Đường chuẩn SCLA/SIS (ppm) Nồng độ tính lại Độ thu hồi từ từ đường chuẩn đường chuẩn (ppm) (%) 0,818 0,007 y= 0,0199x- 0,926 113,2 1,636 0,021 0,0113 1,629 99,56 3,272 0,053 r= 0,9999 3,212 98,18 9,816 0,182 9,730 99,12 16,36 0,316 16,44 100,5 ĐƯỜNG CHUẨN ACID CLAVULANIC 0.35 y = 0.0199x - 0.0113 R² = 0.9998 0.3 SCLA/SIS 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 12 14 16 Nồng độ CLA (ppm) Hình 3.20 Đường chuẩn acid clavulanic theo chuẩn nội 26 18 Đường chuẩn thể mối tương quan diện tích pic AMX nồng độ thể bảng 3.3 hình 3.21 Bảng 3 Kết khảo sát đường chuẩn AMX Nồng độ SAMX/SIS Đường chuẩn (ppm) Nồng độ tính lại từ Độ thu hồi từ đường chuẩn đường chuẩn (ppm) (%) 1,8 0,09496 y = 0,07x – 2,037 113,1 0,1791 0,0476 3,329 108,0 0,3140 r= 0,9980 5,165 86,09 12 0,7250 11,04 91,98 36 2,660 38,68 107,5 60 4,059 58,66 97,77 ĐƯỜNG CHUẨN AMOXICILIN 4.5 y = 0.07x - 0.0476 R² = 0.9961 4.0 SAMX/SIS 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ AMX (ppm) Hình 3.21 Đường chuẩn amoxicilin theo chuẩn nội Từ kết cho thấy, khoảng nồng độ từ 1,8- 60 ppm có tương quan tuyến tính nồng độ AMX tỷ lệ diện tích pic AMX/ IS với hệ số tương quan r xấp xỉ Nồng độ AMX xác định từ đường chuẩn so với nồng độ thực nằm giới hạn cho phép (chênh lệch 20% LLOQ 15% điểm lại), sử dụng đường chuẩn để xác định nồng dộ AMX Trong khoảng nồng độ từ 0,81816,4 ppm có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ CLA tỷ lệ diện tích pic CLA/ IS với hệ số tương quan r xấp xỉ Nồng độ CLA từ nồng độ 0,818 ppm 27 xác định từ đường chuẩn so với nồng độ thực nằm giới hạn cho phép, đáp ứng yêu cầu đường chuẩn phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 3.2.4 Độ xác, độ ngày Tiến hành: Độ độ xác xác định sử dụng kết phân tích mẫu AMX/CLA có nồng độ xác biết (mẫu QC) khoảng nồng độ: thấp (LQC): 3/0,818 ppm, trung bình (MQC): 12/3,272 ppm, cao (HQC): 36/9,816 ppm Chuẩn bị mẫu hỗn hợp AMX CLA huyết tương trắng nồng độ: LQC, MQC, HQC, nồng độ làm song song mẫu và xử lý theo quy trình xử lý mẫu Kết đánh giá theo % nồng độ tính lại theo đường chuẩn độ lệch chuẩn bảng 3.4, 3.5 Kết tính toán từ đường chuẩn xác định ngày nghiên cứu Bảng 3.4 Kết độ đúng, độ xác ngày acid clavulanic Acid clavulanic LQC (0,818 ppm) Nồng độ Độ (%) (ppm) HQC (9,816 ppm) Nồng độ Độ (%) (ppm) 0,8894 108,7 7,721 78,66 0,8389 102,6 8,251 84,06 0,9121 111,5 7,509 76,49 0,9099 111,2 8,862 90,29 0,7851 95,98 7,112 72,45 TB 0,8671 106,0 7,891 80,39 RSD 5,618 5,618 7,721 7,721 28 Bảng 3.5 Kết độ đúng, độ xác ngày amoxicilin Amoxicilin LQC (3 ppm) MQC (12 ppm) HQC (36 ppm) Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độ Độ (ppm) (%) (ppm) (%) (ppm) (%) 2,798 93,27 13,39 111,6 34,61 96,13 2,571 85,71 13,75 114,5 35,02 97,28 3,012 100,4 13,67 114,0 37,88 105,2 2,814 93,81 13,24 110,3 41,01 113,9 2,754 91,80 13,29 110,8 38,75 107,6 TB 2,790 93,00 13,67 112,2 37,45 104,0 CV (%) 5,047 5,047 1,508 1,508 6,379 6,379 Từ kết thẩm định cho thấy, khoảng nồng độ thấp, trung bình cao mẫu QC, AMX có độ xác ngày nằm giới hạn cho phép CV ≤ 15%, LLOQ CV ≤ 20% (LQC= 5,047%, MQC= 1,508%, HQC= 6,379%) CLA có độ xác ngày nằm giới hạn cho phép nồng độ thấp nồng độ cao (LQC= 5,618%, HQC= 5,407%) đáp ứng yêu cầu độ xác theo hướng dẫn FDA phân tích dịch sinh học Tại nồng độ trung bình, CLA bị phân hủy nên tơi khơng đánh giá độ xác ngày mẫu nồng độ AMX đáp ứng yêu cầu độ theo hướng dẫn FDA nằm giới hạn cho phép 85- 115% CLA chưa đáp ứng yêu cầu độ mức nồng độ HQC q trình phân tích CLA bị phân hủy q trình phân tích bảo quản mẫu Thời gian chạy mẫu dài, hiệu lực cột giảm CLA ổn định 3.2.5 Độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương Tiến hành xử lý phân tích lơ mẫu LQC, MQC HQC huyết tương, lô mẫu gồm mẫu độc lập Đánh giá độ ổn định AMX, CLA mẫu huyết tương bảo quản tủ lạnh âm sâu (khoảng - 80ºC) sau ngày Kết độ ổn định dài ngày AMX CLA mẫu huyết tương thể bảng 3.6 3.7 29 Bảng 3.6 Độ ổn định dài ngày CLA mẫu huyết tương Nồng độ (ppm) STT Mẫu LQC Mẫu MQC Mẫu HQC T0 T7 T0 T7 T0 T7 0,7442 0,4457 3,343 2,525 7,231 6,243 0,6926 0,3359 3,545 1,378 9,648 6,956 0,7442 0,3157 3,433 1,382 9,388 8,258 TB 0,7270 0,3658 3,451 1,762 8,755 7,153 CV (%) 3,343 15,61 2,399 30,63 12,37 11,66 Bảng 3.7 Độ ổn định dài ngày AMX mẫu huyết tương Nồng độ (ppm) STT Mẫu LQC Mẫu MQC Mẫu HQC T0 T7 T0 T7 T0 T7 2,972 2,886 12,17 9,905 36,39 32,71 2,775 2,705 11,43 11,38 35,41 34,38 2,880 2,687 11,84 10,30 34,35 37,49 TB 2,875 2,759 11,81 10,53 35,38 34,86 CV (%) 2,793 3,262 2,559 5,914 2,031 5,679 Từ kết thẩm định cho thấy, vòng ngày bảo quản tủ lạnh âm sâu - 80oC nồng độ AMX mẫu pha so với nồng độ AMX vòng ngày khác không 15% (≤ 6,0%), đạt độ ổn định điều kiện bảo quản mẫu dài ngày; nồng độ CLA ngày so với mẫu pha khác có ý nghĩa CLA bị phân hủy q trình xử lý mẫu (CLA dễ bị phân hủy nhiệt độ độ ẩm Dó cần tiến hành phân tích thêm độ ổn định dài ngày mẫu để xác định dược thời gian CLA ổn định mẫu huyết tương điều kiện bảo quản - 80oC 30 BÀN LUẬN Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật HPLC – UV để định lượng AMX CLA mẫu huyết tương cột Inertsil C18 (250 x 4,6 mm, µm) Phương pháp phân tích đơn giản, khơng tốn kém, thiết bị sử dụng phổ biến, có độ nhạy, độ xác độ chọn lọc cao Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS cho kết phân tích tốt hơn, mẫu xử lý dễ dàng nhiên thiết bị ít, đắt tiền chưa sử dụng rộng rãi So với nghiên cứu nước [5], phương pháp tơi phân tích trực tiếp, không cần tạo dẫn xuất với imidazol Đường chuẩn xây dựng phương pháp có khoảng tuyến tính rộng (AMX từ 1,8 – 60 ppm, CLA từ 0,818- 16,36 ppm) so với nghiên cứu trước [5] (AMX từ 0,5 – 16 ppm CLA từ 0,125 – ppm), [7] (AMX từ 0,625 – 10 ppm CLA từ 0,3125- ppm) Với Cmax AMX= 11,64 ppm CLA= 2,18 ppm đường chuẩn nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học thuốc thuốc viên nén, chưa đánh giá bệnh nhân sử dụng liều cao bệnh nhân sử dụng thuốc tiêm Tuy nhiên phương pháp tơi có nhược điểm thời gian phân tích dài, mẫu huyết tương chưa đạt độ ổn định cao Điều kiện xử lý mẫu xây dựng không cần dẫn xuất imidazol để tiến hành phân tích, bước chiết ngược với cloroform làm mẫu phân tích hơn, hạn chế protein huyết tương mẫu nhiên thời gian phân tích mẫu dài, cần nhiều bước tiến hành Độ nhạy, độ ổn định phương pháp xây dựng không tăng lên so với nghiên cứu trước [5][7] cần nghiên cứu tối ưu hóa thêm phương pháp Lựa chọn phương pháp chuẩn nội giúp giảm sai số mẫu trình xử lý mẫu Việc lựa chọn chuẩn nội kháng sinh β-lactam nhóm cephalosporin hệ 1, có cấu trúc hóa học tượng tự AMX cho đáp ứng tỷ lệ diện tích SCLA/SCEF lặp lại giúp cho q trình phân tích xác Xử lý mẫu dung môi dễ kiếm, dễ sử dụng methanol cloroform, việc nitơ thu hồi CLA để tiến hành phân tích sắc ký Tuy nhiên q trình xử lý mẫu nhiều thời gian 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ • Nghiên cứu đạt mục tiêu đề xây dựng phương pháp định lượng trực tiếp amoxicilin acid clavulanic huyết tương người sắc ký lỏng hiệu cao sơ thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học FDA Đã xây dựng phương pháp phân tích định hượng AMX CLA mẫu huyết tương tự tạo kỹ thuật HPLC- UV với chuẩn nội cefadroxil điều kiện sắc ký sau: - Cột Inertsil® C18 ODS-3 (250 x 4,6 mm, µm) - Pha động: đệm phosphat 100 mM pH 2,5 acettonitril với tỷ lệ thể tích 97:3 - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Detector UV, bước sóng 220 nm - Thể tích tiêm 50 µL - Thời gian chạy sắc ký: 30 phút Phương pháp xây dựng thẩm định tiêu chí FDA với độ chọn lọc cao với AMX CLA, khoảng tuyến tính rộng ( AMX từ 1,8- 60 ppm, CLA từ 0,818 – 16,36 ppm), độ xác ngày AMX, CLA nằm giới hạn quy định, độ ngày AMX nằm giới hạn quy định, AMX đạt yêu cầu độ ổn định điều kiện bảo quản - 80oC ngày CLA chưa đạt yêu cầu độ ổn định điều kiện bảo quản - 80oC ngày độ ngày tiêu chí thẩm định • Sau thực đề tài có số đề xuất sau: - Vì điều kiện trang thiết bị thời gian không cho phép nên tơi chưa hồn thành tiêu chí hướng dẫn FDA phân tích dịch sinh học huyết tương Khi có điều kiện, chúng tơi tiến hành bổ sung tiêu chí giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ xác khác ngày, làm thêm độ ngày CLA, chu kỳ đơng rã AMX CLA để có kết đầy đủ - Tiếp tục nghiên cứu tiếp phương pháp để tối ưu hóa điều kiện sắc ký, ứng dụng vào thử tương đương sinh học thuốc 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích-Tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr 123-200 Bộ mơn Hóa dược (2007), Hóa dược, Nhà xuất Y học, tr 115-116, Bộ Y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam II, tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 86-92 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr 51 Trần Nguyên Hà et al (3/2006), "Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời amoxicilin acid clavulanic huyết tương HPLC", Tạp chí dược học Số: 359, tr 31-35 Dương Khánh Linh (05/03/2018), ANSM: Nhắc lại việc sử dụng hợp lý amoxicilin đường tiêm giảm thiểu nguy lắng cặn tinh thể nước tiểu, Cảnh giác dược Lê Quan Nghiệm et al (2005), "Nghiên cứu định lượng amoxicilin acid clavulanic huyết người phương pháp HPLC ", Tạp chí dược học Số 353 (9), tr 23-26 Tiếng Anh Anil Dubala et al (2014), "Simultaneous Liquid Chromatography–Mass Spectrometry Quantification of Cefixime and Clavulanic Acid in Human Plasma", Journal of chromatographic science 53 (5), pp 694-701 Ákos Jerzsele et al (2009), "The stability of amoxicillin trihydrate and potassium clavulanate combination in aqueous solutions", Acta Veterinaria Hungarica 57 (4), pp 485-493 10 Judyta Cielecka-Piontek et al (2015), "Solid-state stability and compatibility studies of clavulanate potassium", Pharmaceutical development and technology 20 (2), pp 146-152 11 Jun Haginaka et al (1983), "Alkaline degradation of clavulanic acid and high performance liquid chromatographic determination by post-column alkaline degradation," Chemical and pharmaceutical bulletin, 31 (12), pp 4436-4447 12 Mark Foulstone et al (1982), "Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the components of Augmentin, in biological fluids with high-performance liquid chromatography", Antimicrobial agents and chemotherapy 22 (5), pp 753-762 33 13 Shantaram Bonde et al (2013), "An LC-MS-MS method for the simultaneous quantification of amoxicillin and clavulanic acid in human plasma and its pharmacokinetic application", Journal of pharmacy research, pp 804-812 14 Yaxin Fan et al (2016), "Rapid and Simultaneous Quantitation of Amoxicillin and Clavulanic Acid in Human Plasma and Urine by Ultra-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry and Its Application to a Pharmacokinetic Study.", Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University 32 (12), pp 12691276 15 Amoxicilin, , https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/62883#section=Top, ngày truy cập 15/05/2018 16 Clavulanate, https://www.drugbank.ca/drugs/DB00766#pharmacology, ngày truy cập 15/05/2018 17 Clavulanic acid, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Clavulanate#section=3D-Conformer, ngày truy cập 15/05/2018 18 Guillaum Hoizey et al (2002), "Simultaneous determination of amoxicillin and clavulanic acid in human plasma by HPLC with UV detection", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 30 (3), pp pp 3661-3666 19 A Doadrio et al (1988), Hydrolysis kinetic determination of Amoxycillin by liquid chromatography, Anales Real Academia de Farmacia 20 David Mayron et al (1996), "Stability and compatibility of granisetron hydrochloride in iv solutions and oral liquids and during simulated Y-site injection with selected drugs", American journal of health-system pharmacy 53 (3), pp 294-304 34 ... đề tài: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng amoxicilin acid clavulanic huyết tương với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định lượng trực tiếp amoxiclin acid clavulanic huyết tương người... THỊ KHÁNH HUYỀN 1301194 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMOXICILIN VÀ ACID CLAVULANIC TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Phương Nhung ThS Vũ Ngân... thải huyết tương amoxicilin 0,9 acid clavulanic 0,9 [9] 1.2 Một số phương pháp phân tích amoxicilin acid clavulanic huyết tương Ở Việt Nam giới có nhiều cơng bố phương pháp phân tích amoxicilin acid