Xây dựng phương pháp định lượng một số acid amin trong viên nang doragon bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

các tỷ lệ khác 1:1,1: , 1:4 Kết cho với tỷ lệ curcumin : phospholipid = 1:1 có hàm lượng curcumin phức hợp cao Phức hợp phytosomé curcumin làm cải thiện đáng kể độ hòa tan nước curcumin, tăng gấp khoảng 10 iần, làm tăng khả hấp thu curcumin đường tiêu hóa, có íiềm mang iại hiệu cao điều trị !âm sàng [3 ,4Ị KẾT LUẬN Đã chiết xuất kết tinh curcumỉn có độ tinh khiết cao Phytosome curcumỉn tồng hợp từ curcumin phospholipid với tỷ lệ 1:1 có hàm lượng curcumin cao (6 %) đánh giá tạo thành phức hợp phytosome curcumin dựa theo kết cua phổ IR phổ DSC TÀI LIẾU THAM KHẢO Chattopadhyay, ( Biswas, K Bandyopadhyay, u & Banerjee, R K 2004 Turmeric and curcumìn: biological actions and medicinal applications Curr Sci; 87,44-53 Moorthi c , Kiran K, Manavalan R, Kathiresan K Preparation and characterization of curcumin-piperine dual drug loaded nanoparticles Asian Pac J Trop Biomed 2012;2:841-8 Chutima Jantarat , Bioavailabiiity enhancement techniques of herbal medicine: a' case example of curcumin, International Journal o f Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2012 Kunỉai Maiti, Kakali Mukherjee, Arunava Ganiait, Bishnu Pada Saha, Puiok K Mukherjee Curcuminphospholipid complex: Preparation, therapeuticevaluation and pharmacokinetic study in rats International Journal o f Pharmaceutics 330 (2007) 155-163 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ACID AM IN TRONG VIÊN NANG DÓRAGON BẢNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Ths Trần Diễm Phúc, DS.CKỈ Nguyễn Thị Kim Ngọc (Trường Cao đẳng Y tế Đồng Tháp) TS Nguyễn Thị Ngọc Vân (Đại học Y Dược Can Thơ) PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ (Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh) TĨM TẤT Đặt vấn đề: Trên thị trường có nhiều dược phẩm có thành phần dịch chiết Địa long (như viên nang Doragon) dùng để cung cấp acid amin cần thiết cho thể Tuy nhiên, công tác kiềm nghiệm chế phẩm dừng lại mức định tính acid amin định lượng nitơ toàn phản nen cần xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid amin Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng thẩm định quy trình ớịnh lượng đồng thời sổ acid amin có viên nang Doragon phương pháp HPLC-PDA Đối tượng phương phâp nghiên cứu: Đối tượng: acid amin, nguyên liệu Địa long, viên Doragon, 03 chế phầm chứa Địa long Phương phấp nghiên cứu: khảo sát điều kiện chiết tách acid amin, điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời acid amin có Địa long Kết quà: nghiên cứu xác định phương pháp chiết tách điều kiện sắc ký HPLC, xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid amin alanin, prolin, valin, leucin, lysin, tyrosin Kết luận: nghiên cứu xây dựng thầm định quy trình định lượng ổ acid amir) có viên Doragon ứng dụng quy trình 03 mẫu nguyên liệu 03 mẫu thành phẩm khâc Từ khoa: Địa long SUMMARY METHOD DEVELOPMENT OF SIMUTANEOUS ESTIMATION OF SOME AMINO ACIDS IN DORAGON CAPSULES BY REVERSE PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Tran Diem Phuc, Nguyen Thi Kim Ngoc (Dong Thap medical college) Nguyen Thi Ngoc Van (Can Tho University of Medicine and Pharmacy) Vo Thỉ Bach Hue (Ho Chi Minh City Medicine and Pharmacy University) Introduction: The quality control o f pharmaceutical products which have Pheretima aspergillum extract in their ingredients (such as Doragon capsules) is ju st the work o f amino acids qualitation or total nitrogen quantitation As a results, there is a need to develop a method for simultaneous estimation o f some amino acids, main pharmaceutical ingredient in Doragon capsules by PDA-HPLC method Objectives: To develop and validate a HPLC method for simultaneous evaluation some amino acids in Doragon capsules Materials and methods: Object: Pheretima aspergillum material, semi-finished products Ragon, Doragon capsules and some other products containing Pheretima aspergillum - 701 - Method: Extraction conditions and sample processing conditions were optimized to identify amino acids by HPLC; simultaneous evaluation o f amino acids in Doragon capsules and other samples was developed and validated Results: Extraction method and chromatographic conditions to identify six amino acids in a single run were studied They are alanine, proline, valine, leucine, lysine, tyrosine Conclusion: Six amino acids in Doragon capsules were also simultaneous evaluation by validated HPLC method and this procedure was applied in quantitation o f these amino acids in raw materials and nroducts samples Từ khóa: Phereỉima aspergillum ĐẬT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU Đặt vấn đề: Từ lâũ, Địa long xem vị thuốc bổ, quý sư dụng nhiều y học cổ truyền nước phương Đông để cung cấp acid amin cần thiết cho the Ngồi ra, Địa long cịn sử dụng để chữa bệnh huyết áp, tim mạch, thần kinh, hen suyễn Các công tỵ dược phầm nghiên cứu phát triển nhiều chế phầm có thành phần dịch chiết cao Địa long để cung cẩp acid amin cần thiểt cho thể Tuy nhiên, cơng íác kỉểm nghiệm chế phẩm dừng lại mức định tính acid amin định lượng niỉơ tồn phần Do đó, nghiên cứu tiến hành để xây dựng quy trình định ỉượng đồng thời số acid amin viên nang Doragon có íhành phần dịch chiết cao Địa long phương pháp HPLC-PDA Mục tiêu nghiên cứu: đề tài thực với mục tiêu cụ thể sau: - Khảo sát phương pháp chiết tách acid amin - Định danh so acid amin có viên nang Doragon - Khảo sát điều kiện sắc ký HPLC - PDA - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời so acid amin - ứng dụng quy trình định lượng để định iượng số acid amin 03 mẫu nguyên liệu Địa long 03 mẫu thành phầm khác có chứa Địa long lưu hành írên thị trường ĐĨI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN u Đối tượng: acid amin chuẩn (alanin, arginin, glỵcin, leucin, lysin, methionin, prolin, serin, tryptophan, tyrosin, valin) Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ứơng Nguyên vật liệu: - Nguyen íiệú ĐỈa long: cơng ty TNHH dược liệu Tấn Hai (Tiền Giang); nhà thuốc dứợc liệu Tân Há ký (thành phố Hồ Chí Minh); nhà thuốc bệnh viện YHCT Đồng Tháp - Viên nang Doragon: công ty cổ phần xuất nhập y tế Domesco san xuẳí - Chế phẩm khác có chứa Địa long: viên Bồ khí thơng huyềt (cơng ty cổ phần BV pharma); viên Hạ áp ích nhân viên Hoạt huyết (cơng ty trách nhiệm hữu hạn Nam Dược) Trang ỉh iế t bỉ - Dung môi: 3.1 Trang thiết bị - Hệ thống HPLC - PDA Alliance 2695 - 2996 e2695 - 2998 (Waters, Mỹ) - Hệ thống HPLC - PDA Hitachi D-7000 (Nhật Bản) - Cân phân tích Saríorius CP225D; độ nhạy 0,01 mg (Đức) - Cột sắc ký: cột Eclipse AAA (150 X 4,6 mm; ụm) 3.2 Dung môi - Thuốc thử dansyl (5-dimethylamino-napthalen-1sulfonyl chlorid) (Merck) - Acetonitril, methanol, nước cất dùng cho HPLC Phương pháp nghiên cứu: 4.1 Khảo sát phương pháp chiết tách acid amin Nghiên cứu tiến hành khảo sát phương pháp là: - Phương pháp không tạo dẫn xuất sư dụng cột Zic-HiLIC _ - Phương pháp tạo dẫn xuất với thuốc thử dansyl sử dụng cột Eclipse AAA 4.2 Định danh số acid amin có viên nang Doragon Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩp phương pháp HPLC theo quy trình sắc ký lựa chọn 4.3 Khảo s t điểu kiến x Ịý mẫu điều kiện triền khai sắc ký HPLC - Tiến hành khảo sát thông số quy trinh xừ lý mẫu khối lượng cân, nồng độ íhế tích thuốc thử dansyl sử dụng cho phản ứng; thời gian nhiệt độ phản ứng - Tiến hành khảo sát điều kiện triển khai sắc ký HPLC khảo sát tỷ lệ pha động, chương trình dung môi, pH pha động nhiệt độ cột sắc ký 4.4 Xây dựng thầm định quy trình định lượng đồng thời số acid amin - Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử theo quy trình sắc ký khảo sốt đầy đủ điều kiện, đánh giá kết dựa thông số sắc ký pic đạt yêu cầu định íượng - Thẩm định quy trình định iượng theo hướng dẫn gồm chĩ tiêu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ xác phương pháp 4.5 ứng dụng quy trình Sau đạt chl tiêu thẩm định, quy trình định lượng ứng dụng để định iượng acỉd amin có 03 mẫu nguyên liệu Địa long, 03 ịô thành phầm viên nang Doragon 03 mẫu thành phẩm khác có chứa Địa long lưu hành thị trường -702- KẾT QUẢ Phương pháp chiết tách acid amỉn Phương pháp khơng tạo dẫn xuất Hình SKĐ mẫu thử khơng tạo dẫn chất phân tích cột Zic - HILIC Nhận x é t phương pháp khơng tạo dẫn xuất có quy trình xử iý mẫu đơn giản, kết phân tích acid amin có mâu thử arginin, histidin lysin Tuy nhiên, pic chưa đạt yêu cầu sắc ký mẫu phức tạp Q 1-4D ^3r 10- 0.0» O.Q€r0.0-1 0.05?- a.oo- JL ,-vaÌu -a o àãcó -10.00 ỈCỊ 60.00 Hình SKĐ mẫu thử tạo dẫn chất với dansyl phân tích cột Eclipse AAA Nhận x é t phượng pháp tạo dẫn xuấỉ cho kết phân tích tốt phương pháp không tạo dẫn chấỉ Trong phương pháp tạo dẫn xuất, cột Eclipse AAA cho kết phân tích tốt nhat Quy trình định lượng đơng thời acid amín viên nang Doragon 2.1 Quy trình xử lý mau Ph® rr âu hịa tan 400’° m9 ch® phẩm Doragon nước pha lỗng đến 10,0 m! với dung môi Siêu âm phút, lọc qua giấy lọc thông thường, thu dung dịch ihử Lấy 1,0 ml dung dịch ỉh ìí cho vào binh định mức 10 mỉ, thêm vào ml thuốc thử dansyl, điền đầy thể tích dung dịch NaHCÒ3 0,1 M, thu dung dịch thử Chuyển dung dịch thử sang ống nghiệm, cách thủy dung dịch 60 °c 30 phút, ỉhu dung dịch thử 3, để nguội, lọc qua màng lọc 0,45 |jm Dịch lọc ià mẫu thử quy trinh sắc ký Phạ mâu chuẩn: hôn hợp acid amin alanin, prolin, valin, leucin, íysin, tyrosin Hịa tan 5,0 mg ioại acid amin chuẩn nước pha loãng đến 50,0 mi với dung moi, thu dung dịch chuẩn Lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 10 mi, thêm ml thuốc thử dansyl, điền đầy tích dung dịch NaHC0 0,1 M, thu dung dịch chuẩn Chuyển dung dịch chuẩn sang ống nghiệm tiến hành cách thủy điều kiện 60 ° c 30 phút thu đung dịch chuẩn 3, đề nguội, lọc qua màng lọc 0,45 |jm Dịch lọc mẫu chuẩn quy írỉnh sắc ký 2.2 Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: cột Eclipse AAA (150 X 4,6 mm; ụm) Nhiệt độ cột: 40 °c Pha động: A: acetonitri! B: dung dịch đệm kaii dihydrophosphat 0,01 M - acetonitriị (86:14, v/v) Pha động sử dụng theo chương trình dung mơi sau: Thời gian (phút) %A %B 10,00 10 20 100 30,00 35,00 40,00 50,00 CA AA ou,uu 90 80 65 55 40 A n n iUU 35 45 60 Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút; Bước sóng phát hiện: 254 nm; Thể tích tiêm mẫu: 10 ụi o.i:sO -T O - a Q 2-~ j Ul a 0-0010.0o tc.oo 20.00 Hỉnh Sắc kỷ đồ mẫu chuẩn o.oa* 0,995 - Độ đúng: nồng độ chất phân tích khoảng 10 ppm nên tỷ lệ phục hồi trung bình đạt khoảng 80 - 1 % - Tính thỉch hợp cùa hệ thống: giá trị RSD cua thời gian lưu diện tích pic phải < 2,0% Các thơng số khác pic đạt yêu cầu chung phương pháp sắc ký quy định ! -G h c *3£ s M,Ầ i ấ í S' « 0£K > 0 lo io o , l j Ẫ I , , , ầ h Ji -£ẽ i ex _ J -S ầ , „ c= M S -sc a D- 16,O D , a f , _ & M Â , 2cũoo %, —5*m Trong đó: n kích cở mẫu; m ỉà số biến độc lập mơ hình Do cỡ mẫu tối thiểu n = 5*21 = 160 [5] Mặt khác nghiên cứu tiến hành lấy mẫu trực tiếp toàn sinh viên cao đẳng khoá năm cuổi sổ sinh viên cao đẳng khoá năm cuối 287 sinh viên Số sinh viên sau bị loại theo tiêu trí loại trừ 240 sinh viên, số phiếu hợp lệ đưa vào nghiên cứu ià 228 phiếu Cỡ mẫu nghiên cưu ià 228 sinh viên đảm bảo đủ yêu cầu mẫu thiết kế nghiên cứu - Bộ công cụ vấn ổược xây dựng hoàn thiện sau làm Pretest - Cách thu íhập: vấn trực tiếp thu lại sau tiến hành phong van - Phương pháp phân tích: phân tích nhân tố khám phá (EFA), test X2, phân tích ANOVA ỉrợ giúp cùa phần mềm SPSS 22.0 [1], KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xác định số nhân tố ảnh hiPỞng tớí mức độ hài lịng sinh viên Bảng Đặc điểm cá nhân đối tượng nghiên cứu Thông tin chung SL TL (%) Giới: Nam 20 8.8 Nữ 208 91,2 Tuối 21 -22 195 85,52 >22 33 14,48 Mâu nghiên cứu gom 228 sinh viên, nữ chiếm tỷ lẹ 91,2%, nam chiếm tỷ lệ 8,8% Độ tuổi đối tượng nghiên cứu trung bình 21 tuồi 85,52% Kết phân tích thu hệ số Cronbach Alpha lớn 0,6 biến có hệ sồ tương quan biền ỉổng iởn 0,3 nên phù hợp đạt độ tin cậy Đồng thời giá trị KMO 0,913 cho thấy 21 biến có tương quan với đủ điều kiện để tiến hành phân tích nhân tố khám phá -706- ... tách acid amin - Định danh so acid amin có viên nang Doragon - Khảo sát điều kiện sắc ký HPLC - PDA - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời so acid amin - ứng dụng quy trình định lượng. .. triển khai sắc ký HPLC khảo sát tỷ lệ pha động, chương trình dung mơi, pH pha động nhiệt độ cột sắc ký 4.4 Xây dựng thầm định quy trình định lượng đồng thời số acid amin - Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn... sử dụng cột Eclipse AAA 4.2 Định danh số acid amin có viên nang Doragon Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩp phương pháp HPLC theo quy trình sắc ký lựa chọn 4.3 Khảo s t điểu