ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- LÊ THỊ XUÂN XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PARABENS TRONG THỰC PHẨM VÀ MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Chuyên ngành: Hóa
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-
LÊ THỊ XUÂN
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PARABENS TRONG THỰC PHẨM VÀ MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI
Hà Nội – 2016
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai
đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài và viết luận văn
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm
An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia và các anh chị, các bạn công tác tại Khoa
Chất lượng Phụ gia và các chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện An toàn Vệ sinh
Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu
trong môi trường hiện đại
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại Khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong Bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá
K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm Hoá Phân tích K24 đã giúp đỡ, chia
sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi
Trang 31.1.3.2. Hiện tượng lão hóa da 7
1.1.3.3 Mối liên hệ với giữa parabens và bệnh ung thư vú 7
1.2 Tình hình sử dụng parabens trên thế giới và ở Việt Nam 8
1.3.1 Phương pháp điện di mao quản (CE) 9
1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng 10
1.3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV-VIS 10
1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 11
1.3.3 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 13
1.3.4 Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng 14
1.3.4.1 Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng 14
1.3.4.2 Một số đại lượng đặc trưng của sắc ký lỏng 15
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined.
2.4.1 Hóa chất Error! Bookmark not defined.
2.4.2 Dụng cụ Error! Bookmark not defined.
2.4.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined.
2.5.1 Xác định các điều kiện phân tích Error! Bookmark not defined.
2.5.1.1 Xác định các thông số cho detector khối phổ Error! Bookmark not defined.
2.5.1.2 Khảo sát điều kiện đo sắc ký Error! Bookmark not defined.
2.5.1.3 Khảo sát các điều kiện chiết mẫu Error! Bookmark not defined.
2.5.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Error! Bookmark not defined.
2.5.2.1. Xây dựng đường chuẩn Error! Bookmark not defined.
2.5.2.2. Độ lặp lại (độ chụm) Error! Bookmark not defined.
2.5.2.3 Độ thu hồi (độ đúng) Error! Bookmark not defined.
2.5.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.
3.1.1 Xác định các thông số của detector khối phổ Error! Bookmark not defined.
3.1.2 Khảo sát điều kiện đo trên máy sắc ký lỏng Error! Bookmark not defined.
Trang 43.1.2.1 Khảo sát chương trình rửa giải Error! Bookmark not defined.
3.1.2.2 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm Error! Bookmark not defined.
3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Error! Bookmark not defined.
3.1.3.1 Khảo sát loại dung môi chiết Error! Bookmark not defined.
3.1.3.2 Khảo sát thành phần dung môi chiết MeOH:H2O Error! Bookmark not defined.
3.1.3.3 Khảo sát thời gian rung siêu âm Error! Bookmark not defined.
3.1.3.4 Khảo sát nhiệt độ rung siêu âm Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Xây dựng đường chuẩn Error! Bookmark not defined.
3.2.3. Độ thu hồi (độ đúng) của phương pháp Error! Bookmark not defined.
3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Error! Bookmark not defined.
3.3 Phân tích parabens trong các mẫu mỹ phẩm và thực phẩm chức năngError! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 16
DANH SÁCH BẢNG BIỀU
Chương 2
Bảng 2 1 Bảng nồng độ dung dịch chuẩn gốc của 7 parabens Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3 3 Ảnh hưởng của gradient đến độ phân giải của Iso-PrP và PrP
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3 4 Ảnh hưởng của gradient đến cường độ tín hiệu mảnh định
lượng của 7 parabens Error! Bookmark not defined.
Bảng 3 5 Khảo sát loại dung môi chiết Error! Bookmark not defined.
Bảng 3 6 Sự phụ thuộc thành phần dung môi chiết và hàm lượng MeP,
PrP Error! Bookmark not defined.
Bảng 3 7 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiếtError! Bookmark
not defined.
Bảng 3 8 Sự phụ thuộc giữa thời gian rung siêu âm và hàm lượng MeP,
PrP Error! Bookmark not defined.
Bảng 3 9 Khảo sát thời gian rung siêu âmError! Bookmark not
defined.
Trang 5Bảng 3 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ rung siêu âm tới hiệu quả chiết
MeP, PrP Error! Bookmark not defined Bảng 3 11 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ rung siêu âm Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3 12.Độ chệch của các điểm chuẩnError! Bookmark not defined.
Bảng 3 13 Hàm lượng các parabens trong mẫu khảo sát Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3 14 Nồng độ chuẩn thêm vào từng nền mẫu trong khảo sát độ lặp
lại Error! Bookmark not defined Bảng 3 15 Độ lặp lại của phương pháp phân tíchError! Bookmark not
defined.
Bảng 3 16 Độ thu hồi của phương pháp phân tíchError! Bookmark not defined.
Bảng 3 17 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Error! Bookmark not defined Bảng 3 18 Hàm lượng các parabens trong các mẫu TPCN Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3 19 Hàm lượng parabens trong các mẫu mỹ phẩm Error!
Bookmark not defined.
Trang 6DANH SÁCH HÌNH
Chương 1
Hình 1 1 Công thức phân tử của methylparaben 3
Hình 1 2 Công thức phân tử của propylparaben 4
Hình 1 3 Công thức phân tử của isopropylparaben 4
Hình 1 4 Công thức phân tử của isobutylparaben 5
Hình 1 5 Công thức phân tử của phenylparaben 5
Hình 1 6 Công thức phân tử của benzylparaben 5
Hình 1 7 Công thức phân tử của pentylparaben 6
Hình 1 8 Cơ chế gây hại ADN trên da của hợp chất parabens 7
Hình 1 9 Mô hình phân mảnh của các parabens trong phân tích LC-MS/MS 12
Hình 1 10 Sơ đồ cấu tạo hệ thống UPLC-MS/MS 15
Chương 2
Hình 2 1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu theo dự kiến Error!
Bookmark not defined.
Chương 3
Hình 3 1 Sắc đồ khảo sát chương trình rửa giảiError! Bookmark not
defined.
Hình 3 2 Sắc đồ khảo sát thành phần dung dịch đệmError! Bookmark
not defined.
Hình 3 3 Biều đồ khảo sát loại dung môi chiếtError! Bookmark not
defined.
Hình 3 4 Sắc đồ khảo sát loại dung môi chiếtError! Bookmark not
defined.
Hình 3 5 Biểu đồ sự phụ thuộc của độ thu hồi và thành phần dung môi
chiết Error! Bookmark not defined.
Hình 3 6 Biều đồ sự phụ thuộc của hàm lượng MeP, PrP và thời gian
rung siêu âm Error! Bookmark not defined.
Hình 3 7 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của độ thu hồi thời gian rung siêu
âm Error! Bookmark not defined Hình 3 8 Quy trình xử lý mẫu phân tích Error! Bookmark not defined Hình 3 9 Đường chuẩn của các parabens theo diện tích pic Error!
Bookmark not defined.
Hình 3 10 Biểu đồ hàm lượng (%) parbens trong các mẫu TPCN Error!
Bookmark not defined.
Hình 3 11 Biểu đồ hàm lượng parabens có trong mỹ phẩm Error!
Bookmark not defined.
Trang 7DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt
% RSD % Relative standard
deviation
% Độ lệch chuẩn tương đối
GC–MS Gas chromatography -
Mass spectroscopy
Sắc ký khí khối phổ
HPLC High performance liquid
Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC–MS Liquid Chromatography -
Mass Spectroscopy
Sắc ký lỏng khối phổ
LOQ Limit of Quantification Giới hạn định
lượng
UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả
kiến
AOAC Association of Official Hội phân tích hoá
Trang 8Analytical Chemist học
Trang 9Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất bảo quản là những hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào thực phẩm, dược phẩm, các mẫu phẩm sinh học, v.v để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật, haycác thay đổi không mong muốn về mặt hóa học của sản phẩm
Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học, được sử dụng phổ biến và lâu đời Về mặt hóa học, parabens là một loạt các este của axit parahydroxybenzoic hay còn được gọi là acid 4-hydroxybenzoic Parabens có tính chất kháng khuẩn và kháng nấm nên được dùng làm chất bảo quản để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn (do nấm hoặc vi khuẩn) và hạn chế sự phân hủy của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm
Gần đâycó nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất parabens có thể hoạt động tương tự như hormone oestrogen trong các tế bào của cơ thể Các hoạt động này có liên quan nhất định đến bệnh ung thư vú Những thông tin này làm cho nhiều phụ nữ lo lắng, và người tiêu dùng được khuyến cáo hạn chế sử dụng các loại mỹ phẩm xung quanh cánh tay, ngực và những vùng da nhạy cảm Parabens cũng có thể gây dị ứng da đối với những người có cơ địa dị ứng hay quá mẫn cảm Ngoài ra còn
có thông tin về việc parabens làm thúc đẩy quá trình lão hóa da dưới tác động của ánh nắng mặt trời
Trước những bằng chứng về tác hại của parabens đối với sức khỏecon người, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP quy định về việc sử dụng một số chất trong mỹ phẩm Theo đó, có 5 parabens đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam từ ngày 30/7/2015là: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben Cũng theo công văn này, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,4% (tính theo acid), và dạng hỗn hợp các parabens khác với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid).Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày 31/12/2015.Các sản phẩm sản xuất trong nước, nhập khẩu được phép lưu hành trên thị trường đến hết ngày 30/6/2016
Với yêu cầu thực tế hiện nay,việc kiểm soát các chất bảo quản parabens là rất
cần thiết Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Xác định hàm lƣợng prabens trong thực phẩm và mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” chúng tôi tiến
hành khảo sát các điều kiện HPLC thích hợp để định tính, định lượng 7 chất parabens, bao gồm: methylparaben, propylparaben, isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben, pentylparaben
Mục tiêu nghiên cứu:
Trang 10Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Xây dựng và chuẩn hóa phương pháp định lượng 7 chất paraben nêu trên bằngphương pháp sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò khối phổ
Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng parabens trên một số mẫu mỹ phẩm, thực phẩm chức năng
Trang 11Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
CHƯƠNG I TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về các hợp chất parabens
Este alkyl acid p-hydroxybenzoic còn được gọi là parabens được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản trong các dược phẩm từ giữa những năm 1920 và được
sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm một thời gian ngắn sau đó [11]
Một số parabens được tìm thấy trong tự nhiên, tuy nhiên tất cả các parabens được sử dụng thương mại đểu được sản xuất tổng hơp Chúng được sản xuất bằng phản ứng este hóa của para-hydroxybenzoic acid và rượu thích hợp, ví dụmethanol, ethanol, n-propanol, v.v.khi có mặt chất xúc tác thích hợp (ví dụ axit sulfuric đậm đặc hoặc axit p-toluenesulfonic) [11]
1.1.1 Công thức phân tử và tính chất vật lý của các parabens
Ở điều kiện bình thường, 7 parabens nghiên cứu đều là những tinh thể màu trắng Methylparaben (MeP), propylparaben (PrP), isopropylparaben(Iso-PrP) tan tốt trong nước, các parabens còn lại khó tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu
cơ (methanol, ethanol) Nguyên nhân là do theo chiều khối lượng phân tử tăng lên,
độ phân cực của các parabens giảm xuống [24]
Methylparaben
Danh pháp IUPAC: methyl 4-hydroxybenzoate
Tên gọi khác:nipagin, methylparahydroxybenzoate,methyl hydroxybenzoate
p- Công thức phân tử: C8H8O3
Công thức cấu tạo Hình 1.1:
Hình 1 1 Công thức phân tử của methylparaben
Khối lượng mol phân tử: 152,15 g/mol
Ký hiệu trong ngành thực phẩm là: E218
Độ tan trong nước ở 25o
C: 2,00 g/100 mL; pKa: 8,17
Propylparaben
Danh pháp IUPAC: propyl 4-hydroxybenzoate
Trang 12Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Tên gọi khác: nipazol, propyl parahydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate,
p- Công thức phân tử: C10H12O3
Công thức cấu tạo Hình 1.2:
Hình 1 2.Công thức phân tử của propylparaben
Khối lượng mol phân tử: 180,2 g/mol
Ký hiệu trong ngành thực phẩm là: E216
Độ tan trong nước ở 25o
C: 0,30 g/100 mL; pKa: 8,35
Isopropylparaben
Danh pháp IUPAC: propan-2-yl 4-hydroxybenzoate
Tên gọi khác: isopropyl 4-hydroxybenzoate, isopropyl hydroxybenzoate
p- Công thức phân tử: C10H12O3
Khối lượng mol phân tử: 180,2 g/mol
Công thức cấu tạo Hình 1.3:
Hình 1 3 Công thức phân tử của isopropylparaben
Isobutylparaben
Danh pháp IUPAC: 2-methylpropyl 4-hydroxybenzoate
Công thức phân tử: C11H14O3
Trang 13Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Khối lượng mol phân tử: 194,23 g/mol
Công thức cấu tạo Hình 1.4:
Hình 1 4 Công thức phân tử của isobutylparaben
Phenylparaben
Danh pháp IUPAC: phenyl 4-hydroxybenzoate
Công thức phân tử: C13H10O3
Khối lượng mol phân tử: 214,22 g/mol
Công thức cấu tạo Hình 1.5:
Hình 1 5 Công thức phân tử của phenylparaben
Bezylparaben
Danh pháp IUPAC: benzyl 4-hydroxybenzoate
Công thức phân tử: C14H12O3
Khối lượng mol phân tử: 228,24 g/mol
Công thức cấu tạo Hình 1.6:
Hình 1 6 Công thức phân tử của benzylparaben
Độ tan trong nước ở 25oC: 0,05 g/100 mL
Pentylparaben
Trang 14Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Danh pháp IUPAC: pentyl 4-hydroxybenzoate
Công thức phân tử: C12H16O3
Khối lượng mol phân tử: 208,25 g/mol
Công thức cấu tạo Hình 1.7:
Hình 1 7 Công thức phân tử của pentylparaben
1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn của parabens
Các parabens có tác dụng sát khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau)
và diệt nhiều loại vi nấm Parabens có hoạt tính kháng khuẩn là do chúng làm thay đổi đặc tính của màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng tế bào thay đổi cho phép các chất tan trong tế bào bị rò rỉ ra ngoài[24]
Tác giả Steinberg Doron và cộng sự[24] đã nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn
của bốn parabens là: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben đối với các vi khuẩn Streptococcus sobrinus gây bệnh sâu răng Kết quả thu được cho thấy, theo chiều tăng của chuỗi akyl khả năng kháng khuẩn của parabens tăng dần
Tuy nhiên, theo chiều tăng của chuỗi ankyl khả năng tan trong nước giảm dần, trong khi vi khuẩn thường phát triển trong môi trường nước Do vậy các đồng phân có chuỗi alkyl ngắn thường được lựa chọn sử dụng với mục đích bảo quản
Để tăng hiệu quả bảo quản, các parabens được sử dụng kết hợp với nhau Thông thường, người ta phối hợp hai paraben trở lên, thí dụ như phối hợp 0,18% methyl parabens, 0,02% propyl parabens để làm chất bảo quản sát khuẩn trong nhiều loại thuốc tiêm chích hoặc phối hợp parabens với một số hóa chất khác
Trước đây, parabens đã được sử dụng rộng rãi trong thuốc chữa bệnh, thường
là ở hàm lượng cao, khoảng 1% đến 5% [5] Khi những tác hại của parabens đối với sức khỏe con người được phát hiện, việc sử dụng parabens trong các sản phẩm thuốc chữa bệnh đã giảm xuống So với trong dược phẩm, hàm lượng parabens sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm thường ở nồng độ thấp hơn (khoảng 0,1% đến l0,8%), và hiện nay, chúng vẫn là loại chất bảo quản được sử dụng nhiều nhất vì nhiều lí do: giá thành rẻ, hiệu quả bảo quản tốt, không màu, không mùi, không làm thay đổi tính chất của sản phẩm
1.1.3 Tác động của parabens đối với sức khỏe
1.1.3.1 Gây dị ứng da