phương pháp định lượng captopril trong nguyên liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ket-noi.com chia se NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÌNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : ThS Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths TRẦN THỊ LAN HƯƠNG – người thầy tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơixin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên mơn Hóa Dược, Dược lý nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm thực nghiệm việc môn Tôi xin gửi tới thầy cô giáo, cán Trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành dạy bảo, dìu dắt tận tình suốt năm năm tơi học tập Và cuối cùng, cho phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kính u người thân gia đình, bạn bè ln giành cho tơi tình u thương, quan tâm, động viên suốt trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013 Sinh Viên Nguyễn Bình Nguyên MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I : TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Captopril 1.1.1 Công thức, tính chất 1.1.2 Tác dụng, định, chống định 1.2 Một số phương pháp định lượng captopril 1.2.1 Đinh lượng Captopril phép đo Iod 1.2.2 Định lượng Captopril phương pháp đo quang 1.3 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Các thơng số q trình sắc ký 1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 1.3.4 Cơ sở lý thuyết việc lựa chọn sắc ký 1.3.5 Phương pháp định lượng HPLC 11 1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 12 1.4.1 Yêu cầu chung 12 1.4.2 Nội dung thẩm định phương pháp 12 Chương II: ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Dụng cụ, hóa chất 14 14 2.2.1 Dụng cụ thiết bị 14 2.2.2 Hóa chất 14 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3.3 Phương pháp xử lý đánh giá kết 16 Chương III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ,BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 17 17 3.1.1 Khảo sát chọn bước sóng thích hợp 17 3.1.2 Chọn pha tĩnh 18 3.1.3 Khảo sát chọn thành phần pha động tốc độ dòng 19 3.1.4 Khảo sát chọn dung mơi hòa tan Captopril 24 3.1.5 Điều kiện sắc ký chọn 25 3.2 Xây dựng đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong nguyên liệu phương pháp HPLC 25 3.2.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 25 3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng 27 3.3 Đánh giá phương pháp định lượng 28 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định lượng 28 3.3.2 Đánh giá tính xác phương pháp 30 3.3.3 Đánh giá tính đặc hiệu phương pháp 33 3.4 Bàn luận 35 3.5 Áp dụng phương pháp xây dựng 36 Chương IV: KẾT LUẬN, ĐÁNH GIÁ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcCN : Acetonitril AF : Hệ số bất đối xứng(Asymmetric) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) MeOH: Methanol RSD : Độ lệch chuẩn tương đối(Relative Standard Deviation) Rs : Hệ số phân giải (Resolution) TB : Trung bình DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc cột LC-DB 1.2 Cấu trúc cột có gốc Isopropyl 3.1 3.2 Phổ hấp thụ UV Captopril MeOH:Đệm phosphat 0,01M pH=2,40 (65:35) Sắc ký đồ Captopril chạy hệ đệm khác pha động khác 17 19 3.3 Thông số phân tích sắc ký đồ Captopril chạy pH =2,50 20 3.4 Thơng số phân tích sắc ký đồ Captopril chạy pH =2,40 20 3.5 Thơng số phân tích sắc ký đồ Captopril chạy pH =2,30 21 3.6 3.7 3.8 3.9 Thơng số phân tích sắc ký đồ Captopril chạy hệ MeOH:Đệm pH 2,4 (60/40) Thông số phân tích sắc ký đồ Captopril chạy hệ MeOH:Đệm pH 2,4 (65/35) Thơng số phân tích sắc ký đồ Captopril chạy hệ MeOH:Đệm pH 2,4 (70/30) Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic Captopil 22 22 23 29 3.10 Sự tương quan lượng Captopril ban đầu lượng tìm lại 32 3.11 Sắc ký đồ mẫu trắng 33 3.12 Sắc ký đồ Captpril chuẩn đối chiếu (100µg/ml) 34 3.13 Sắc ký đồ Captopril thử (100µg/ml) 34 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 3.1 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC 26 3.2 Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính 28 3.3 Kết khảo sát khoảng tuyến tính Captopril 29 3.4 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 30 3.5 Kết đánh giá tính phương pháp 31 3.6 Kết định lượng Captopril Captopril nguyên liệu công ty dược phẩm Traphaco 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tăng huyết áp bệnh mang tính chất phổ biến Điều đáng ngại có tới 50% người bị tăng huyết áp khơng biết bị tăng huyết áp, khoảng 30% người biết tăng huyết áp khơng có biện pháp điều trị nào.Tăng huyết áp không điều trị đầy đủ dẫn đến nhiều biến chứng nặng nề suy thận, suy tim, tai biến mạch não… chí gây tử vong để lại di chứng nặng nề ảnh hưởng đến sức khỏe, sức lao động người bệnh Một thuốc đầu tay bác sỹ hay dùng để điều trị tăng huyết áp bệnh nhân nhóm ức chế men chuyển Captopril thuốc kinh điển Muốn kiểm sốttốt chế phẩm chứa Captopril từ việc nhỏ đánh giá nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc Captopril Hiện nay, Việt Nam, phương pháp để định lượng Captopril nguyên liệu phương pháp oxy hóa khử phép đo Iod Trên thực tế nguyên liệu có chất khử chất oxy hóa áp dụng phương pháp dễ dẫn đến sai số HPLC phương pháp phân tích có tính ổn định,có độ xác độ chọn lọc cao, sử dụng rộng rãi phân tích dược phẩm Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Captopril nguyên liệu sắc ký lỏng hiệu cao” Với mục tiêu sau:  Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng captopril nguyên liệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao  Thẩm định phương pháp xây dựng theo tiêu chí phương pháp định lượng, từ đề quy trình định lượng thường quy để định lượng Captopril nguyên liệu  liệu Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng Captopril nguyên CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL 1.1.1 Cơng thức, tính chất  Cơng thức hóa học :  Tên khoa học : Acid 1-(3-mercapto-2-methylpropanoyl)pyrolidin-2-carboxylic  Cơng thức phân tử :  Tính chất: C9H15NO3S ; M=217,28; Bột kết tinh màu trắng ngà,ở 25oC: tan tốt nước (160 mg/ml), ethanol,methanol,methylclorid, tan glyceryltriacetat (20 mg/ml),trong dung dịch NaOH lỗng, tantrong dầu ngơ, ethyl acetat (< 1mg/ml).Nhiệt độ nóng chảy: 105oC – 108oC.Góc quay cực riêng ethanol tuyệt đối αD25 = 127,8o,hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch +5o Hằng số phân ly nước pKa 3,7 (-COOH) 9,8 (-SH) Hệ số phân bố logP(octhanol/nước) =0,34, logP(CH2Cl2/nước(pH=2))=1,39, logP(octhanol/HCl 0,1M)=1,9.[12] 1.1.2 Tác dụng, định, chống định: 1.1.2.1 Dược động học : Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có Ftuyệt đối 60% - 75%, Cmax huyết tương đạt khoảng sau uống Captopril liên kết với protein khoảng 30% Chủ yếu tiết nước tiểu, khoảng 40%-50% đào thải qua thận dạng nguyên hoạt tính, lại chuyển hóa qua gan thành dạng captopril disulfide captopril-cystein.Captopril có t1/2= 2–3h, Cls=13,33 ml/min/kg.[14] 25  Sử dụng pha động : MeOH đệm phosphat 0,01M pH=2,40 (65 :35)  Sử dụng hỗn hợp MeOH : H2O theo tỉ lệ 65 :35  Sử dụng H2O 100% Bằng kết thực nghiệm, nhận thấy :  Khi sử dụng MeOH 100% làm dung mơi hòa tan Captopril: có thay đổi thành phần pha động lúc tiêm mẫu nên sắc ký đồ đường không ổn định  Khi sử dụng H2O 100% làm dung mơi hòa tan Captopril: mẫu pha khơng ổn định, Captopril dễ bị thủy phân, đồng thời chạy sắc ký có khác biệt giữ thành phần pha động hệ pha mẫu nên đường không ổn định  Khi sử dụng hỗn hợp MeOH : H2O theo tỉ lệ giống pha động (65:35), chạy cho đường ổn định, pic Captopril cân đối, sắc nét , tách pic tạp, để thời gian lâu dễ bị thủy phân tạo tạp chất khác  Khi sử dụng hỗn hợp MeOH : đệm phosphat 0,01M pH=2,40 (65 :35) đường ổn định, pic Captopril pic tạp tách khỏi nhau, cân đối, kết có độ độ xác cao Vì vậy, chúng tơi lựa chọn dung mơi để hòa tan Captopril có ngun liệu hỗn hợp MeOH : Đệm phosphat 0,01M pH =2,4 (65 :35) 3.1.5 Điều kiện sắc ký chọn Như vậy, qua q trình khảo sát chúng tơi đưa chương trình sắc ký để định lượng Captopril Captopril nguyên liệu sau: 3.2  Cột LunaC8 (250mm x 4,6mm, 5µm)  Pha động MeOH/Đệm phosphat 0,01M pH=2,4 (tỷ lệ 65 :35)  Tốc độ dòng 0,6 ml/min  Thể tích tiêm 20µl  Detetor UV 220nm  Nhiệt độ phân tích : nhiệt độ phòng XÂYDỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 3.2.1 Khảo sáttính thích hợp hệ thống sắc ký 26 Cân xác khoảng 50,0mg Captopril chuẩn đối chiếu (nồng độ 95,3%, hàm ẩm 3%) Viện Kiểm nghiệm sản xuất vào bình định mức 50ml, thêm hỗn hợp MeOH : Đệm phosphat 0,01M pH = 2,4 (tỷ lệ 65 :35) đến vạch siêu âm phút Lấy xác 1,00ml dung dịch trên, cho vào bình định mức 10ml, thêm hỗn hợp dung mơi đến Siêu âm phút Lọc qua màng lọc 0,45µm, dung dịch lọc tiêm sắc ký(nồng độ captopril dung dịch khoảng 100µg/ml) Tiêm lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC Tiến hành sắc ký với điều kiện chọn Ghi thời gian lưu, diện tích pic hệ số bất đối xứng pic captopril thu sắc ký đồ Tính thích hợp hệ thống HPLC biểu thị thông qua hệ số bất đối xứng, độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) phép thử song song thời gian lưu diện tích pic Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC STT Thời gian lưu(phút) Diện tích pic(mAU*min) Hệ số bất đối xứng 6,360 35,3301 1,62 6,356 35,3292 1,62 6,392 35,3368 1,63 6,378 35,3347 1,62 6,362 35,3303 1,62 6,365 35,3307 1,62 RSD(%) 0,21 0,01 0,25 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) thời gian lưu diện tích pic, hệ số bất đối Captopril phép thử song song < 2% Điều chứng tỏ hệ thống HPLC mà chúng 27 sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lượng Captopril 3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng 3.2.2.1Chuẩn bị mẫu thử, mẫu đối chiếu pha động  Dung dịch thử Cân xác lượng bột Captopril nguyên liệu tương ứng với 50,0mg captopril cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml hỗn hợp MeOH:Đệm phosphat 0,01M pH = 2,40 (tỉ lệ 65:35) Lắc kỹ siêu âm phút Thêm hỗn hợp dung môi đến vạch, lắc Hút xác 1,00 ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, thêm hỗn hợp dung môi đến vạch, lắc siêu âm phút Lọc qua màng lọc 0,45µm, bỏ khoảng 2ml dịch lọc đầu, sau dịch lọc đem tiêm sắc ký (nồng độCaptopril dung dịch khoảng 100µg/ml)  Dung dịch chuẩn Cân xác khoảng 50,0mg Captopril chuẩn đối chiếu (nồng độ 95,3%) cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml hỗn hợp MeOH:Đệm phosphat 0,01M pH = 2,40 (65:35) Lắc kỹ siêu âm phút Thêm hỗn hợp dung mơi đến vạch, lắc Hút xác 1,00 ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 10ml, thêm hỗn hợp dung môi đến vạch, lắc siêu âm phút Lọc qua màng lọc 0,45µm, sau dịch lọc đem tiêm sắc ký (nồng độCaptopril dung dịch khoảng 100µg/ml)  Pha động + Dung dịch đệm phosphat 0,01M pH = 2,40 Hòa tan 1,36g KH2PO4 lít nước cất lần, điều chỉnh pH 2,40 dung dịch H3PO4 (8,5%) Lọc qua màng lọc 0,45µm, sau siêu âm đuổi khí 30 phút +Methanol : siêu âm đuổi khí 20 phút 3.2.2.2Chương trình sắc ký  Cột Luna C8 (250 mm x 4,6 µm, 5µm)  Pha động MEOH/Đệm phosphat 0,01M pH = 2,40(tỷ lệ 65/35)  Thể tích tiêm 20µl  Tốc dòng 0,6 ml/min 28  Detertor UV 220 nm  Nhiệt độ phân tích nhiệt độ phòng 3.2.2.3Tiến hành sắc ký định lượng Chuẩn bị cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút Tiêm 20µl dung dịch chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký điều kiện chọn Ghi giá trị diện tích pic thu sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn tương ứng 3.2.2.4Tính kết Hàm lượng phần trăm so với nhãn captopril ngun liệu tính theo cơng thức: C(%) = x Cch x (100 - a) (3.1) Trong : a(%) : Hàm ẩm Captopril mẫu chuẩn C(%) : Hàm lượng phần trăm captopril mẫu thử Cch(%) : Hàm lượng phần trăm captopril mẫu chuẩn mth(gam) :Khối lượng bột nguyên liệu cân để pha dung dịch thử mch(gam) : Khối lượng captopril chuẩn cân để pha dung dịch chuẩn Sth Sch : Diện tích pic dung dịch thử dung dịch chuẩn 3.3 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 3.3.1Khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định lượng Pha dãy nồng dung dịch captopril có nồng độ biến thiên từ 80µg/ml đến 120µg/ml Trong bình định mức 50 ml, cân xác lượng bột Captopril chuẩn đối chiếu (nồng độ 95,3%) chứa khoảng 60,0mg Captopril Thêm 40ml hỗn hợp MeOH:Đệm phosphat 0,01M pH 2,40 (65:35), lắc kỹ siêu âm phút Thêm hỗn hợp dung mơi đến vạch, lắc Hút xác 5,00 ml dung dịch vừa pha, cho 29 vào bình định mức 50ml, thêm 40 ml hỗn hợp pha động, lắc đều, thêm tiếp hỗn hợp pha động vạch lắc lắc Dung dịch thu có nồng độ Captopril khoảng 120µg/ml Tiến hành pha lỗng theo bảng 3.2 để thu dung dịch có nồng độ 80µg/ml, 90µg/ml, 100µg/ml, 110µg/ml Lọc qua màng lọc 0,45µm Các dịch lọc thu đem tiêm sắc ký Bảng 3.2 Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch số số ml dung dịch gốc (120µg/ml) 11 Số ml hỗn hợp pha động 1 1 Nồng độ dung dịch (µg/ml) 80 90 100 110 120 Tiêm 20µl dung dịch vào hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút Tiến hành sắc ký Ghi giá trị diện tích pic đo ứng với nồng độ Captopril Kết khảo sát tuyến tính trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát khoảng tuyến tính Captopril Dung dịch Nồng độ (µg/ml) 80 90 100 110 120 28,304 31,752 35,330 38,978 42,438 Diện tích pic (mAU*min) Từ kết thu bảng 3.3, chúng tơi thiết lập mối tương quan diện tích pic thu sắc ký đồ nồng độ dung dịch Phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan là: y = 0,3549 x – 0,1336 với hệ số tương quan r=0,9999, R2= 0,9999 Độ lệch chuẩn y-intercept : Sb = 0,1960 Khoảng tin cậy y-intercept : ∆b = 0,6238 ;-0,7575 ≤ b ≤ 0,4902 chứa gốc tọa độ 30 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic Captopril ghi hình 3.9 Diện tích pic (mAU*min) 45 40 y = 0.354x - 0.133 R² = 0.999 35 30 25 70 80 90 100 110 120 130 Nồng độ (µg/ml) Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic Captopril Từ kết thu hình 3.9 cho ta thấy: tất giá trị đo nằm đường hồi quy 80% đến 120% nồng độ định lượng tương đương với 80µg/ml đến 120 µg/ml Như vậy, khoảng nồng độ từ 80µg/ml đến 120µg/ml có phụ thuộc tuyến tính giữ nồng độ dung dịch diện tích pic Captopril Sự phụ thuộc chặt chẽ Khoảng nồng độ khảo sát rộng nên thuận tiện cho việc phân tích định lượng nguyên liệu 3.3.2 Đánh giá tính xác phương pháp 3.3.2.1Đánh giá độ lặp lại phương pháp Chuẩn bị mẫu thử nguyên liệu Captopril mà công ty dược Traphaco dùng cho sản xuất mẫu chuẩn dùng chất chuẩn đối chiếu Captopril hàm lượng 95,3% Viện kiểm nghiệm Tiêm mẫu thử mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC Tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn, tính tốn hàm lượng hoạt chất mẫu thử theo công thức 3.1 Độ lặp lại phương pháp đánh giá độ lệch chuẩn tương 31 đối (RSD%) phép thử độc lập Phương pháp làlặp lại RSD ≤ 2% Độ lặp lại phương pháp đánh giá sai số tương đối (ɛ %) phép thử song song Khi ɛ nhỏ, độ lặp lại phương pháp cao Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp ghi lại bảng 3.4 Bảng 3.4 : Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp Hàm Hàm lượng lượng STT Khối lượng Diện tích K/l Captopril Diện tích Captopril Captopril pic chuẩn đối pic chuẩn đối cân (gam) (mAU*min) chiếu (gam) (mAU*min) chiếu (%) thử (%) 0,0502 34,980 0,0545 35,330 95,30 99,62 0,0506 35,102 0,0548 35,346 95,30 99,51 0,0508 35,425 0,0540 35,285 95,30 98,50 0,0504 34,989 0,0548 35,342 95,30 99,59 0,0503 35,209 0,0544 35,312 95,30 99,74 95,30 99,41 0,0507 35,248 0,0546 35,324 xtb = 99,40(%) S = 0,4512 Sx = 0,1842 Số liệu thống kê RSD = 0,4539(%) Mẫu thử Mẫu chuẩn ∆x = 0,4735 ɛ = 0,4764(%) Kết đánh giá tính xác phương pháp cho thấy, điều kiện sắc ký chọn,độ lệch chuẩn tương đối kết nhỏ (RSD =0,4539); với độ tin cậy p = 0,95, sai số tương đối phép thử song song (ɛ = 0,4764%) cho thấy phương pháp định lượng nguyên liệu Captopril xây dựng xác có độ xác cao 3.3.2.2Đánh giá tính phương pháp Đánh giá tính phương pháp tiến hành dựa việc khảo sát khả tìm lại hoạt chất mẫu chuẩn nồng độ 80% đến 120% nồng độ định lượng Cân mẫu captopril chuẩn, chia thành nhóm, nhóm mẫu sau :  Nhóm I : cân xác mẫu khoảng 40,0mg Captopril chuẩn đối chiếu (hàm lượng 95,3%) Viện kiểm nghiệm sản xuất  Nhóm II :cân xác mẫu khoảng 50,0mg Captopril chuẩn đối chiếu 32 Nhóm III :cân xác mẫu khoảng 60,0mg Captopril chuẩnđối chiếu Tiến hành định lượng mẫu (theo bước mục 3.2.2) Kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Kết đánh giá tính phương pháp  Nhóm Mẫu I II III Chuẩn K/l Captopril chuẩn đối chiếu cho vào (gam) 0,0440 0,0434 0,0427 0,0552 0,0539 0,0547 0,0657 0,0654 0,0658 0,0544 Khối lượng K/l captopril Diện tích Captopril có chuẩn pic tìm đối chiếu (mAU*min) lại(gam) (gam) 0,0407 28,083 0,0400 0,0401 27,625 0,0393 0,0395 27,328 0,0389 0,0510 35,459 0,0505 0,0499 34,546 0,0491 0,0506 35,285 0,0502 0,0608 42,396 0,0603 0,0605 41,718 0,0593 0,0609 41,959 0,0597 0,0503 35,342 0,0503 Số liệu thống kê Phần trăm Captopril tìm lại (%) 98,28 98,00 98,48 99,02 98,40 99,21 99,18 98,02 98,03 100,00 xtb =98,51(%) S = 0,4988 RSD = 0,5063(%) ∆x = 0,3834 ɛ = 0,3892(%) Từ kết bảng 3.5, ta có : Giá trị trung bình tỷ lệ thu hồi 98,51% ; độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,5063% < 2% ; với độ tin cậy p = 0,95 sai số tường đối phép thử nhỏ (ɛ = 0,3892%) Khoảng tin cậy tỷ lệ thu hồi : 98,31≤ x ≤98,89 Kết cho thấy phương pháp có độ cao Để đánh giá sai số tỷ lệ sai số hệ thống phương pháp, thiết lập mối tương quan lượng hoạt chất ban đầu lượng hoạt chất ban đầu lượng hoạt chất tìm lại Đồ thị biểu diễn tương quan lượng hoạt chất lượng hoạt chất tìm lại hình 3.10 Phương trình hồi quy mối tương quan lượng hoạt chất ban đầu lượng hoạt chất tìm lại : 33 y = 0,9887x – 0,0002 với hệ số tương quan r=0,9999, R2 = 0,9998 Độ lệch chuẩn độ dốc : Sa = 0,0121 Độ lệch chuẩn y-intercept : Sb = 0,0006 Khoảng tin cậy độ dốc : 0,8340≤ a ≤ 1,01434 chứa với độ tin cậy p = 0,95 Khoảng tin cậy y-intercept : -0,0080 ≤ b ≤ 0,0077 chứa gốc tọa độ với Khối lượng captopril tìm lại (gam) độ tin cậy p = 0,95 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 y = 0.988x - 0.000 R² = 0.999 0.0000 0.0200 0.0400 0.0600 0.0800 0.1000 Khối lượng captopril có chuẩn đối chiếu (gam) Hình 3.10 : Sự tương quan lượng Captopril ban đầu lượng tìm lại Như ta thấy, khoảng nồng độ khảo sát, phương pháp xây dựng có độ cao, khơng mắc sai số tỷ lệ (khoảng tin cậy độ dốc chứa 1) sai số hệ thống (khoảng tin cậy y-intercept chứa 0) 3.3.3Đánh giá tính đặc hiệu Trong Captopril nguyên liệu, ngồi hoạt chất Captopril có nhiều chất khác Trước tiên phải kể đến loại tạp chất tạo Captopril bị phân hủy trình sản xuất bảo quản nguyên liệu ban đầu dùng để tổng hợp Captopril Captopril disulfide …Tạp chất ảnh hưởng đến kết định lượng Captopril phương pháp áp dụng Do đề tài này, tiến hành nghiên cứu để xây dựng phương pháp định lượng Captopril nguyên liệu mà có mặt tạp chất khơng ảnh hưởng tới kết định lượng 34 Để khảo sát tính đặc hiệu phương pháp, chúng tơi tiến hành sau: - Trong bình định mức 50 ml, cân xác khoảng 50,0mg Captopril chuẩn đối chiếu Viện kiểm nghiệm (hàm lượng 95,3%), hòa tan thêm dung môi (hệ MeOH/Đệm phosphat 0,01M pH=2,40 65/35) vừa đủ tới vạch lắc Lọc qua màng 0,45 µm - Trong bình định mức 50 ml, cân xác khoảng 50,0 mg Captopril thử, hòa tan thêm dung mơi (hệ MeOH/Đệm phosphat 0,01M pH=2,40 65/35) vừa đủ tới vạch lắc Lọc qua màng 0,45 µm Tiêm 20µl dung dịch chuẩn bị vào hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút Tiến hành sắc ký theo chương trình chọn Song song tiến hành ghi sắc ký đồ mẫu trắng Sắc ký đồ mẫu trắng, dung dịch chuẩn đối chiếu, thửđược ghi lại hình 3.11, 3.12 3.13 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu trắng 35 Hình 3.12: Sắc ký đồ Captpril chuẩn đối chiếu (100µg/ml) Sắc ký đồ Captopril chuẩn đối chiếu (100 µg/ml) cho pic thời gian lưu t = 6,360 phút Hình 3.13: Sắc ký đồ Captopril thử (100µg/ml) Sắc ký đồ Captopril thử (100 µg/ml) cho pic, pic thời gian lưu t = 6,362 phút, pic tạp thời gian lưu t = 8,131 phút, Rs = 2,63 Sắc ký đồ mẫu trắng ko cho pic lạ khoảng thời gian lưu Captopril, điều cho thấy tạp chất không ảnh hưởng đến kết định lượng Captopril 3.4 BÀN LUẬN Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích đại, sử dụng phòng trung tâm kiểm nghiệm Việt Nam Ưu điểm chung phương pháp HPLC có ổn định chọn lọc cao, tiến hành nhanh chóng, áp dụng để định tính định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phải tách riêng biệt 36 Kết thực nghiệm xử lý thống kê cho thấy phương pháp xây dựng đáp ứng đầy đủ tiêu phương pháp định lượng Trên sắc ký đồ, pic Captopril chọn lọc, cân xứng, có độ phân giải rõ ràng với pic khác Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD thời gian lưu, diện tích pic Captopril phép thử song song < 2%và hệ số bất đối Captopril phép thử song song dao động từ 1,62 đến 1,63 Điều chứng tỏ hệ thống HPLC mà sử dụng phù hợp đảm bảo ổn địnhcho phép phân tích định lượng Captopril Kết đánh giá tính xác phương pháp cho thấy, điều kiện sắc ký chọn, độ lệch chuẩn tương đối kết nhỏ (RSD = 0,4539%) ; với độ tin cậy p = 0,95, sai số tương đối phép thử song song ɛ = 0,4764% cho thấy phương pháp định lượng Captopril nguyên liệu xây dựng xác có độ xác cao Trong khoảng nồng độ khảo sát, phương pháp xây dựng đảm bảo tính có độ cao Giá trị trung bình tỷ lệ thu hồi 98,51% ; độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,5063% < 2% ; với độ tin cậy p = 0,95 sai số tương đối phép thử nhỏ (ɛ = 0,3892%), khoảng tin cậy tỷ lệ thu hồi 98,31 ≤ x ≤ 98,89; không mắc sai số tỷ lệ khơng mắc sai số hệ thống Tính tuyến tính khảo sát khoảng nồng độ (từ 80% đến 120% nồng độ định lượng) cho thấy có phụ thuốc tuyến tính chặt chẽ nồng độ dung dịch diện tích pic Captopril (hệ số tương quan r = 0,9999, khoảng tin cậy y-intercept chứa gốc tọa độ) Phương pháp xử lý mẫu đơn giản dễ thực thời gian ngắn, tiết kiệm thời gian dung môi, thuận tiện cho sở bị máy HPLC 3.5 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP XẤY DỰNG TIẾN HÀNH ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL NGUYÊN LIỆU CỦA CÔNG TY DƯỢC PHẨM TRAPHACO Áp dụng phương pháp vừa xây dựng, tiến hành định lượng Captopril Captopril nguyên liệu công ty dược phẩm Traphaco( ngày hết hạn 11/2015) 37 Sử dụng phương pháp xây dựng để định lượng Captopril Captopril nguyên liệu Công ty dược phẩm TRAPHACO, dùng chất chẩn đối chiếu Captopril hàm lượng 95,3% viện kiểm nghiệm sản xuất để pha dung dịch chuẩn đối chiếu Tiến hành định lượng lần Kết định lương Captopril nguyên liệu trình bảy bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết định lượng Captopril Captopril nguyên liệu công ty dược phẩm Traphaco STT Khối lượng cân (gam) 0,0506 Chuẩn 0,0548 Số lần tiêm 3 Diện tích pic Diện tích pic (mAU*min) trung bình 35,310 35,334 35,319 35,452 35,483 35,674 Hàm lượng Captopril nguyên liệu (%) 35,321 99,59 35,536 95,3 Từ kết khảo sát chúng tối thấy : mẫu nguyên liệu đạt tiêu chuẩn hàm lượng qui định (nằm khoảng 98,0% đến 101,5%) Pic captopril sắc ký đồ cao, cân xứng (hệ số bất đối dao động từ 1,61 đến 1,63), tách hoàn toàn với pic tạp (độ phân giải RS Captopril với pic tạp 2,76) CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Từ kết thực nghiệm thu được, đạt mục tiêu đề xây dựng phương pháp định lượng Captopril nguyên liệu Captopril mà không bị ảnh hưởng có mặt tạp chất hay gặp Các kết thu cụ thể sau: 38  Cách chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn đơn giản, nhanh chóng : dung mơi sử dụng có thành phần đơn giản, không phức tạp, không gây tốn kém, chuẩn bị mẫu phương pháp hòa tan trực tiếp nên tiến hành đơn giản, nhanh chóng  Chương trình sắc ký lỏng hiệu cao xây dựng phù hợp ổn định để định lượng Captopril ngun liệu Captopril Chương trình là:  Cột LunaC8 (250mm x 4,6mm, 5µm)  Pha động MeOH/Đệm phosphat 0,01M pH=2,4 (tỷ lệ 65 :35)  Tốc độ dòng 0,6 ml/min  Thể tích tiêm 20µl  Detetor UV 220nm  Nhiệt độ phân tích : nhiệt độ phòng Đánh giá phương pháp HPLC xây dựng tiêu: khảo sát tính tuyến tính, đánh giá tính xác, tính Kết cho thấy khoảng nồng độ khảo sát, phương pháp xây dựng có tính tuyến tính, tính xác, tính cao, đảm bảo yêu cầu định lượng Captopril nguyên liệu Captopril  Áp dụng phương pháp HPLC xây dựng, định lượng hàm lượng Captopril nguyên liệu Captopril công ty dược phẩm Traphaco Các kết cho thấy mẫu nguyên liệu định lượng đạt tiêu chuẩn hàm lượng 4.2 ĐỀ XUẤT - Nghiên cứu kỹ độ ổn định dung dịch định lượng - Tiếp tục nghiên cứu để định lượng đồng thời tạp chất liên quan : captopril disulfid Tài liệu Tham Khảo Tiếng Việt Bộ Y Tế, Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, trang 124-126 Bộ Y Tế, Dược thư Việt Nam, 2006, trang 142 - 144 PGS.TS Mai Tất Tố, TS Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học tập II, Nhà xuất Y học, trang 26-28 Bộ Y Tế(2007), Kiểm nghiêm dược phẩm, Nhà xuất Y học, trang 84 – 110 PGS.TS Trần Tử An, PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu, Hóa Phân Tích 2, Nhà xuất Y học, trang 168 – 200 PGS.TS Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược tập 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 68 - 69 Trần Thị Lan Hương (2005), Nghiên cứu định lượng Artesunat có mặt Dihydro Artemisinin và/ Acid Succinic thành phẩm viên nén Artesunat 50mg phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 10 – 17, 32 – 37 Tiếng Anh Australian Pharmaceutical Formulary and Handbook 21, p.11, p.91, p.324, p.473 Bristish pharmacopeia(2009) volume I&II, p.1020 – p.1022 10 Chromatographia, volume 55, issue 9, p.565 – p.571 11 Clarke's Analysis of Drugs and Poisons 4th ed - A Moffat, et al., (Pharma Press, 2011) BBS, p.1038 – p.1039 12 Profiles of Drug Substances Vol 11, p.80 – p.130 13 The United States Pharmacopeia thirty edition, USP Monographs, C, Captopril 14 Martindale Thirty-six edited by Sean C Sweetman, p1239 – p.1240 15 HPLC for Pharmaceutical Scientists(2007), Yuri Karakevich & Rosario Lobrutto, p.139 – p.188 & p.75 – p.132 ... trình định lượng captopril nguyên liệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao  Thẩm định phương pháp xây dựng theo tiêu chí phương pháp định lượng, từ đề quy trình định lượng thường quy để định lượng Captopril. .. kiện sắc ký chọn 25 3.2 Xây dựng đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong nguyên liệu phương pháp HPLC 25 3.2.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 25 3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng. .. 1.2.1 Đinh lượng Captopril phép đo Iod 1.2.2 Định lượng Captopril phương pháp đo quang 1.3 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Các thông số trình sắc ký 1.3.3 Nguyên