Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong viên nang mềm bổ gan bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MAI XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MAI XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn nhận hướng dẫn, giúp đỡ góp ý tận tình q thầy trường Đại học Dược Hà Nội Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh trường Đại học Dược Hà Nội dành nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn dạy tận tình suốt trình nghiên cứu tài liệu, thực nghiệm để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ dược học Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô ban Giám hiệu, phòng sau Đại học, mơn Hóa phân tích - trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn ban lãnh đạo cán phòng phân tích Kiểm nghiệm - Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia thầy mơn Hóa lý tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập q trình thực nghiên cứu đề tài Tơi xin cảm ơn công ty cổ phần Traphaco tạo điều kiện thời gian, hỗ trợ mẫu nghiên cứu giúp tơi hồn thành luận văn Cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, bố mẹ, anh chị em gia đình, chồng gái - người ln động viên, chỗ dựa tinh thần giúp đỡ hoàn thiện luận văn Trong phạm vi khả mình, tơi cố gắng hồn thành luận văn cách tốt có thể, nhiên khơng tránh khỏi thiếu sót, mong nhận góp ý quý báu quý thầy cô, anh chị em bạn đồng nghiệp Hà Nội, ngày 03 tháng năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Mai MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu thành phần chế phẩm viên nang mềm Bổ gan 1.1.1 Actiso 1.1.2 Rau đắng đất 1.1.3 Bìm bìm biếc 1.2 Acid chlorogenic 1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 1.2.2 Tác dụng 1.2.3 Các phương pháp xác định acid chlorogenic 1.3 Tổng quan cao thuốc 11 1.3.1 Định nghĩa 11 1.3.2 Phương pháp điều chế 12 1.3.3 Yêu cầu chất lượng 13 1.4 Tình hình tiêu chuẩn hóa chế phẩm Đơng Dược 14 1.5 Tổng quan phương pháp nghiên cứu sắc ký lỏng hiệu cao 15 PHẦN ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu trang thiết bị 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất, dung môi 20 2.1.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu 21 2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 22 2.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongmẫu cao Actiso viên nang mềm Bổ gan 23 2.2.4 Ứng dụng 24 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 26 3.1.1 Khảo sát dung môi loại chất béo 26 3.1.2 Khảo sát dung môi chiết 27 3.1.3 Khảo sát thời gian chiết 28 3.2 Thẩm định phương pháp 37 3.2.1 Độ chọn lọc: 37 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống sắc ký 39 3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 39 3.2.4 Độ xác 40 3.2.5 Độ 42 3.2.6 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 44 Ứng dụng 45 4.1 Định lượng acid chlorogenic cao actiso 45 4.2 Định lượng acid chlorogenic số lô chế phẩm viên nang mềm Bổ gan thị trường 46 PHẦN BÀN LUẬN 49 Lựa chọn phương pháp phân tích 49 Về xây dựng phương pháp phân tích 50 Về thẩm định phương pháp phân tích 51 Về ứng dụng phương pháp xây dựng phân tích mẫu thực 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ACG Acid chlorogenic AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức (Association of Official Analytical Chemists) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) ICH International Conference on Harmonisation LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MeCN Acetonitril MeOH Methanol PTFE Polytetrafluoroethylene RSD Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard Deviation) YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Kết khảo sát dung môi loại béo xử lý mẫu viên nang 26 mềm Bổ gan Bảng Kết khảo sát dung môi chiết 27 Bảng Kết khảo sát thời gian chiết 28 Bảng Các hệ gradient tỷ lệ pha động tốc độ dòng 32 Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính 39 Bảng Tính thích hợp hệ thống sắc ký 39 Bảng Kết đánh giá độ xác phương pháp cao 40 actiso Bảng Kết đánh giá độ xác phương pháp viên 41 nang mềm Bổ gan Bảng Kết khảo sát độ cao actiso 42 Bảng 10 Kết khảo sát độ viên nang mềm Bổ gan 43 Bảng 11 Kết giới hạn phát 44 Bảng 12 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu cao actiso 45 Bảng 13 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu viên nang 47 mềm Bổ gan DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cơng thức cấu tạo acid chlorogenic Hình Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 15 Hình Biểu đồ kết khảo sát nồng độ dung môi chiết acid 28 chlorogenic viên nang mềm Bổ gan (n = 2) Hình Kết khảo sát thời gian chiết acid chlorogenic viên 29 nang mềm Bổ gan (n=2) Hình Sắc ký đồ tách chất phân tích với hệ pha động 30 Hình Sắc ký đồ khảo sát gradient pha động chương 1(a), hệ 2(b) 33 hệ 3(c) Hình Sắc ký đồ đánh giá ảnh hưởng nhiệt cột 34 Hình Phổ UV pic acid chlorogenic 35 Hình Sắc ký đồ mẫu thử cao actiso 36 Hình 10 Sắc ký đồ mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 37 (a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d) Hình 11 Sắc ký đồ mẫu cao actiso (a), mẫu chuẩn (b), mẫu 37 placebo (methanol 60%) (c), mẫu thử thêm chuẩn (d) Hình 12 Chồng phổ UV tinh khiết píc mẫu viên nang mềm Bổ 38 gan Hình 13 Chồng phổ UV tinh khiết píc mẫu cao actiso 38 Hình 14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích 40 pic Hình 15 Sắc ký đồ xác định LOD phương pháp dung dịch 44 chuẩn/placebo (a) dung dịch chuẩn/MeOH 60% (b) Hình 16 Sắc ký đồ mẫu cao actiso AC04 45 Hình 17 Sắc ký đồ mẫu thử viên nang mềm Bổ gan 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ ngàn năm thuốc YHCT phòng chữa bệnh lưu truyền dân gian trở thành nhu cầu người giữ vai trò quan trọng nhiệm vụ chăm sóc bảo vệ sức khỏe nhân dân Sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên có tác dụng chữa bệnh tốt, giúp điều hòa, cân hoạt động quan, phận thể Với xu hướng “trở thiên nhiên” việc sử dụng thuốc từ dược liệu người dân ngày gia tăng thuốc độc hại gây tác dụng phụ so với thuốc tân dược Thuốc Đơng dược nói chung dược liệu nói riêng cần phải qua chế biến trước đưa vào sử dụng Trước đây, dược liệu dùng dạng tươi phơi sấy khô, chế biến (trích, tẩm, sao…) sau hãm, sắc uống dùng theo kinh nghiệm nên khơng kiểm sốt hàm lượng, chất lượng hiệu điều trị Ngày nay, với thành tựu vượt bậc công nghiệp hóa, đại hóa ngành Dược nghiên cứu, phát triển ứng dụng bào chế dạng chế phẩm viên nang, viên nén… từ bột dược liệu, cao dược liệu dịch chiết dược liệu Việc tiêu chuẩn hóa ổn định chất lượng sản phẩm cần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu đầu vào Tuy nhiên, nguyên liệu sản xuất lấy từ nhiều nguồn nên mức hàm lượng hoạt chất lơ ngun liệu khơng đồng Do đó, để ổn định chất lượng sản phẩm cần tiêu chuẩn bán thành phẩm trước đưa vào sản xuất Actiso trồng quy mô lớn sử dụng làm nguyên liệu nhiều chế phẩm Đơng dược Cao Actiso với cao Rau đắng đất cao Bìm bìm biếc có cơng thức bào chế chế phẩm Bổ gan viên nang mềm viên bao đường Boganic công ty CP Traphaco, viên nang mềm Giadogane HD Pharma, viên nang cứng Chobil DHG Pharma, nang mềm (cứng) Liverbil công ty CP Dược OPC, Sự phối hợp vị thuốc quý có tác dụng tăng cường chức gan - giải độc - mát gan Hoạt chất acid chlorogenic có Actiso có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế phát triển khối u; chống đột biến gen tế bào; Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\036-2101.D Sample Name: CA04.2 ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 21 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 36 Injection Date : 2/2/2018 11:38:39 PM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\036-2101.D) mAU 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.902 1036.49231 29.56905 0.98 0.5400 4803 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:40:15 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\037-2201.D Sample Name: CA04.3 ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 22 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 37 Injection Date : 2/3/2018 12:09:42 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\037-2201.D) mAU 70 60 50 40 30 20 10 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.905 1050.08398 30.21875 0.98 0.5333 4928 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:40:36 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\035-2001.D Sample Name: CA04.1 ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 20 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 35 Injection Date : 2/2/2018 11:07:39 PM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\035-2001.D) mAU 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.862 1067.32935 30.58005 0.97 0.5400 4779 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:38:36 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\054-3901.D Sample Name: CA05 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 39 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 54 Injection Date : 2/3/2018 8:57:32 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\054-3901.D) mAU 100 80 60 40 20 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.946 1019.98389 29.22053 0.96 0.5400 4831 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:46:27 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\053-3801.D Sample Name: CA05 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 38 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 53 Injection Date : 2/3/2018 8:26:27 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\053-3801.D) mAU 100 80 60 40 20 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.951 1042.65088 29.72229 0.97 0.5467 4718 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:46:05 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\056-4101.D Sample Name: CA06 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 41 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 56 Injection Date : 2/3/2018 9:59:35 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\056-4101.D) mAU 100 80 60 40 20 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.996 926.10645 26.43788 0.98 0.5400 4860 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:47:17 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\057-4201.D Sample Name: CA06 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 42 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 57 Injection Date : 2/3/2018 10:30:39 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/3/2018 2:37:04 PM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (CAO BIM BIM 2018-02-02 13-16-52\057-4201.D) mAU 100 80 60 40 20 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.987 936.39215 26.81475 0.97 0.5400 4856 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/3/2018 2:47:42 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\026-2401.D Sample Name: CA06 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 24 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 26 Injection Date : 2/4/2018 2:24:57 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\026-2401.D) mAU 100 80 60 40 20 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.943 907.27588 26.00790 0.96 0.5333 4949 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/4/2018 3:49:28 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\030-2801.D Sample Name: CA07 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 28 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 30 Injection Date : 2/4/2018 4:28:59 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\030-2801.D) mAU 60 50 40 30 20 10 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.961 793.60638 22.68109 0.98 0.5400 4839 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/4/2018 3:51:03 PM GIAP-TUYEN Page of 25 Data File C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\031-2901.D Sample Name: CA07 THU ===================================================================== Acq Operator : MAICH21 Seq Line : 29 Acq Instrument : Instrument Location : Vial 31 Injection Date : 2/4/2018 5:00:00 AM Inj : Inj Volume : 10.000 µl Acq Method : C:\CHEM32\1\DATA\ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/2/2018 1:16:52 PM by MAICH21 Analysis Method : C:\CHEM32\1\METHODS\ACID CHLOROGENIC.M Last changed : 2/4/2018 11:04:08 AM by GIAP-TUYEN (modified after loading) Additional Info : Peak(s) manually integrated DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off (ACTISOMAI 2018-02-03 14-29-54\031-2901.D) mAU 60 50 40 30 20 10 0 10 15 20 ===================================================================== Area Percent Report with Performance ===================================================================== Multiplier: : 1.0000 Dilution: : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs Signal 1: DAD1 A, Sig=330,4 Ref=off RetTime k' Area Height Symm Width Plates Resol Select [min] [mAU*s] [mAU] [min] ution ivity -| | | | -| -| -| -| -15.953 814.34772 23.21540 0.96 0.5400 4835 - ===================================================================== *** End of Report *** Instrument 2/4/2018 3:51:28 PM GIAP-TUYEN Page of 25 l Nghiên cứu - Kỹ thuật Các kết thẩm định thu cho thấy phương pháp đáp ứng đầy đủ yêu cầu ICH Ứng dụng phân tích mẫu thực Ứng dụng quy trình xây dựng thẩm định định lượng mẫu tam thất thu hái tỉnh Lào Cai Hà Giang Kết hàm lượng ginsenosid Rb3 tính theo dược liệu khơ trình bày bảng Bảng Hàm lượng ginsenosid Rb3 có mẫu tam thất (TB ± sd; n = 3) TT Mẫu thử M1 M2 M3 M4 M5 Nơi thu hái Bắc Hà, Lào Cai Si Ma Cai, Lào Cai Đồng Văn, Hà Giang Đồng Văn, Hà Giang Quản Bạ, Hà Giang Năm tuổi 3 2 Hàm lượng ginsenosid Rb3 (%) 1,54 ± 0,03 1,86 ± 0,05 2,11 ± 0,03 1,62 ± 0,02 1,69 ± 0,04 Kết luận Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ginsenosid Rb3 tam thất (Panax notoginseng) trồng Việt Nam HPLC Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn ICH cho kết đạt theo qui định Với khoảng tuyến tính rộng (từ 10 – 500 µg/ml), độ cao (99,58%), độ xác đảm bảo với giá trị RSD% nhỏ (1,27%), giới hạn định lượng (LOQ) thấp (0,257 µg/ml), đồng thời phương pháp ứng dụng định lượng ginsenosid Rb3 mẫu tam thất thu hái Lào Cai Hà Giang cho kết khách quan chứng tỏ tính khả thi phương pháp Do đó, phương pháp sử dụng để định lượng ginsenosid Rb3 có tam thất trồng Việt Nam Tài liệu tham khảo CP (2015), Vol IB, p 1326, Total sapogium of Notoginseng Folium Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Fang Liu, Ni Ma, Chengwei He, Yuanjia Hu, Peng Li, Meiwan Chen, Huanxing Su, Jian-Bo Wan (2017), “Qualitative and quantitative analysis of the saponins in Panax notoginseng leaves using ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight tandem mass spectrometry and high perfoemance liquid chromatography coupled with UV detector”, J of Ginseng Research , pp.1-9 Xu Y X., Shi J S., Jiang Z L (2005), “Innibitory influence of ginsenoside Rb3 on activation of strychnine-sensitive glycine receptors in hippocampal neurons of rat”, Brain Res , 1037, pp 99-106 Xiang H., Liu Y., Zhang B., Huang J, Li Y., et al (2011), “The antidepressant effects and mechanismof action of total saponins from the caudexes and leaves of Panax notoginseng in animal models of depression”, Phytomedicine, 18, pp 731-8 Wang M Zhang X J., Liu F., Hu Y J., He C W., Li P., Su H X., Wan J B (2015), “Saponins isolated from the leaves of Panax notoginseng protect against alcoholic liver injury via inhibiting ethanol-induced oxidative stress and gut-derived endotoxin-mediated inflammation”, J Funct Foods, 19, pp 214-224 (Ngày nhận bài: 13/10/2017 - Ngày phản biện: 05/04/2018 - Ngày duyệt đăng: 16/04/2018) Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic viên nang mềm Bổ gan sắc ký lỏng hiệu cao Nguyễn Thị Mai*, Nguyễn Thị Kiều Anh Trường Đại học Dược Hà Nội *E-mail: maipharmacist88@gmail.com Summary An HPLC was developed for the determination of chlorogenic acid in “Bo gan” soft capsules For injection, the samples were extracted by ultrasonication with a mixture of methanol and water (60:40, v/v), injection volume - 10 µl The HPLC separation was performed on an Inertsil ODS column (250 x 4.6 mm; µm) with the mobile phase consisting of phosphoric acid 0.1% in water and acetonitrile (in gradient elution) and UV detector (330nm) The procedure was validated for specificity, linearity, precision (repeatability, intermediate precision), accuracy, LOD and LOQ These all indicated the method well satisfactory to the ICH requirements By practical trial, Bo Gan soft capsules from commercial production batches were analyzed The chlorogenic acid of these all products were found to exceed the claimed formulated content of 1.50 mg per capsule Keywords: Chlorogenic acid, Bo gan soft capsules, HPLC, quantification TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58) 35 l Nghiên cứu - Kỹ thuật Đặt vấn đề Xã hội ngày phát triển, cách ăn uống, sinh hoạt thay đổi dẫn tới số bệnh lý tăng cao bệnh tim mạch, huyết áp, tiểu đường Trong đó, bệnh gan (gan nhiễm mỡ, viêm gan B, ung thư gan…) bệnh chiếm tỷ lệ cao Bên cạnh sử dụng thuốc tân dược, số người tìm hiểu sử dụng sản phẩm thuốc từ thảo dược không ngừng tăng lên người dùng cho các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên, có lợi cho sức khỏe, khơng độc hại Hiện nay, có nhiều chế phẩm thuốc bổ gan có nguồn gốc thảo dược sản xuất lưu hành thị trường góp phần quan trọng nghiệp chăm sóc sức khỏe cộng đồng viên nang mềm Boganic của Traphaco, viên nang mềm Giadogane của HD Pharma, viên nang cứng Chobil của Công ty CP Dược Hậu Giang, viên nang mềm (cứng) Liverbil của Cơng ty CP Dược phẩm OPC… Thành phần chế phẩm chủ yếu gồm actiso (Cynara scolymus), bìm bìm biếc (Pharbitisnil) rau đắng đất (Glinus oppositifolius) với lượng actiso chiếm tỷ lệ khoảng 54,6% so với thành phần lại Tiêu chuẩn dược liệu Dược điển IV [1], tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm chưa đề cập tới định lượng chất định danh Dược điển Trung Quốc 2015 [3], Dược điển châu Âu [4] yêu cầu định tính định lượng acid chlorogenic dược liệu, cao actiso; Dược điển Mỹ 38 [7] yêu cầu định lượng acid chlorogenic số dược liệu Acid chlorogenic hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế phát triển khối u; chống virus Đây thành phần quan trọng tạo nên tác dụng bảo vệ gan, tăng cường chức gan, giải độc gan chế phẩm Nhằm góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm bổ gan chứa dược liệu actiso, bìm bìm biếc rau đắng đất, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic viên nang mềm Bổ gan HPLC, từ ứng dụng định lượng acid chlorogenic số chế phẩm viên nang mềm chứa thành phần Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Thiết bị, hóa chất, chất chuẩn Thiết bị: Hệ thống HPLC Agilent 1260 series với detector DAD (Mỹ) Hóa chất: Cloroform, n-hexan loại thuốc thử (Trung Quốc); acid phosphoric 85% loại PA (JTBaker, Mỹ); acetonitril methanol loại HPLC ( Merck, Đức) 36 Chất chuẩn: Acid chlorogenic (C16H18O9) hàm lượng 99,60% (nguyên trạng); SKS: 71121F AK Scientific, TnC, Mỹ Đối tượng nghiên cứu - Mẫu chế phẩm viên nang mềm Bổ gan có thành phần cơng thức gồm: cao actiso, cao rau đắng đất, cao bìm bìm biếc cơng ty, cơng ty lấy mẫu mã hóa công ty (A, B), số thứ tự mẫu (01, 02, 03) ngày lấy mẫu (ngày/ tháng/ năm); cách dấu chấm - Mẫu placebo gồm sáp ong trắng, palm oil, lecithin, colloidan silicon dioxid, dầu đậu nành với tỷ lệ theo công thức công bố Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử - Dung dịch chuẩn gốc: Dung dịch acid chlorogenic có nồng độ chính xác khoảng 0,35 mg/ml methanol - Dung dịch chuẩn làm việc: Dung dịch acid chlorogenic có nồng độ chính xác khoảng 35 µg/ml hỗn hợp methanol - nước (60:40) - Dung dịch thử: Lấy 20 viên nang mềm, cân tính khối lượng trung bình thuốc viên Trộn Cân chính xác một lượng dịch thuốc tương ứng viên vào cốc có mỏ, thêm 20 ml nước, siêu âm 15 phút Chuyển toàn mẫu vào bình gạn 100 ml, tráng cốc bằng 25 ml n-hexan tập trung vào bình gạn Lắc phút, để lắng, bỏ lớp n-hexan Tiếp tục chiết vậy thêm lần nữa bằng 25 ml n-hexan Chuyển dịch chiết nước vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Ly tâm dịch chiết 6000 vòng/phút 10 phút, thu lấy phần dịch Lọc qua màng lọc PTFE 0,22 μm Điều kiện sắc ký - Cợt Inertsil ODS (250 x 4,6 mm, µm); nhiệt độ cột: 25oC - Pha động: Acetonitril (A) – dung dịch acid phosphoric 0,1% (B) theo chương trình gradient: Thời gian (phút) A (%) B (%) → 14 10 90 Tốc độ dòng (ml/ phút) 1,5 14,0→ 14,5 10 90 1,5 → 1,0 14,5→ 21,0 10 90 1,0 21,0→ 21,5 10 90 → 1,5 22,0→ 22,5 10 → 90 90 → 10 1,5 - Detector UV bước sóng 330 nm; Thể tích tiêm: 10 µl Sau lần tiêm mẫu, rửa giải với hỗn hợp acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,1% TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58) l Nghiên cứu - Kỹ thuật theo tỷ lệ 90:10 10:90, tỷ lệ phút Thẩm định quy trình Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn ICH [5] Đánh giá tính thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ xác, độ đúng, LOD LOQ phương pháp Kết quả nghiên cứu Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Trong thành phần chế phẩm có lượng lớn dầu béo nên cần loại để giảm thiểu ảnh hưởng tới độ bền cột tách, cản trở trình tách sắc ký Dung môi loại dầu béo khảo sát gồm cloroform và n-hexan Kết quả cho thấy dung mơi có khả loại chất béo tốt, cloroform tạo nhũ gây khó khăn trình chiết nên lựa chọn n-hexan làm dung môi chiết loại dầu béo Để làm tốt mẫu thử thực chiết n-hexan lặp lại lần q trình xử lý mẫu Dựa vào đợ tan của acid chlorogenic tài liệu công bố Dược điển châu Âu, Dược điển Mỹ Dược điển Trung Quốc, khảo sát dung môi chiết methanol, hỗn hợp methanol - nước với tỷ lệ methanol từ 90 - 50% (DC = 10%), kết cho thấy hỗn hợp dung môi methanol - nước (60:40) cho hiệu suất chiết cao Đồng thời, khảo sát thời gian chiết siêu âm từ - 20 phút (Dt = phút) thấy thời gian siêu âm tăng, lượng acid chlorogenic chiết tăng, với thời gian chiết 20 phút lượng acid chlorogenic chiết không khác so với siêu âm 15 phút Qui trình xử lý mẫu lựa chọn trình bày mục chuẩn bị mẫu Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện sắc ký Dựa vào tính chất của acid chlorogenic tài liệu công bố Dược điển châu Âu, Dược điển Mỹ Dược điển Trung Quốc lựa chọn sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 để phân tích acid chlorogenic chế phẩm Sử dụng hệ dung môi acetonitril dung dịch acid phosphoric 0,1% với tỷ lệ acetonitril từ 30% (DC = 5%), kết cho thấy tỷ lệ acetonitril tăng thời gian lưu acid chlorogenic giảm không tách rời khỏi pic lân cận tỷ lệ acetonitril 20% lựa chọn hệ pha động với tỷ lệ acetonitril 10% Mặt khác, trì tỷ lệ hệ pha động khơng đổi q trình rửa giải thời gian phân tích kéo dài tỷ lệ thành phần tốc độ dòng pha động thay đổi để rửa giải tất thành phần mẫu thử thời gian 30 phút Quét phổ UV vị trí ứng với đỉnh pic acid chlorogenic sắc ký đồ, bước sóng cực đại 330 nm Thể tích mẫu thử ảnh hưởng TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58) tới độ phân giải pic sắc ký, mặt khác mẫu dược liệu thể tích mẫu nhỏ góp phần hạn chế ảnh hưởng mẫu làm bẩn cột sắc ký dẫn đến ổn định phân tích Điều kiện sắc ký lựa chọn trình bày mục điều kiện sắc ký Phương pháp nghiên cứu Thẩm định phương pháp Độ chọn lọc Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt các dung dịch sau: mẫu placebo (chuẩn bị tương tự mẫu thử); mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn Kết trình bày hình Hình Sắc ký đồ mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 (a), mẫu chuẩn (b), mẫu placebo (c), mẫu thử thêm chuẩn (d) Kết hình cho thấy sắc ký đờ của mẫu thử có pic có cùng thời gian lưu với pic acid chlorogenic sắc ký đồ của mẫu chuẩn; pic ứng với acid chlorogenic sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tăng lên, sắc ký đồ mẫu placebo khơng xuất pic ứng với thời gian lưu acid chlorogenic Tiến hành chồng phổ UV của pic acid chlorogenic sắc ký đồ của dung dịch thử và chuẩn, hệ số match thu là 999,98 Độ tinh khiết của pic acid chlorogenic sắc ký đồ mẫu thử là 999,753 cho thấy pic thu được sắc ký đồ của mẫu thử là tinh khiết Như vậy, phương pháp đạt yêu cầu độ chọn lọc Khoảng nồng độ tún tính Từ dung dịch ch̉n gớc pha lỗng xác để thu dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp methanol: nước (60:40) có nồng độ acid chlorogenic 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định lượng (35 µg/ml) Tiến hành sắc ký Kết quả được thể hiện ở bảng và hình Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính Nờng đợ acid chlorogenic (µg/ml) 17,9 28,6 35,7 42,8 53,6 Diện tích pic (mAU.s) 530,3 843,7 1058,2 1260,1 1568,3 Phương trình hồi quy: y = 29109x + 12,335 Hệ số tương quan: 0,99995 % hệ số chắn: 1,17% 37 l Nghiên cứu - Kỹ thuật Kết bảng cho thấy khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ acid chlorogenic diện tích pic tương ứng với hệ số tương quan r ≈ Tính thích hợp của hệ thống sắc ký Tiêm vào hệ thống sắc ký lần lặp lại dung dịch chuẩn mức nồng độ 100% Kết quả thu thời gian lưu trung bình 17,29 phút với RSD = 0,173%; diện tích pic trung bình 1058,15 mAU.s với RSD = 0,274% Kết đạt theo yêu cầu ICH RSD < 2,0% Độ xác Độ lặp lại phương pháp: Tiến hành định lượng lặp lại lần song song mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 Kết trình bày bảng Độ xác trung gian: Tiến hành định lượng lặp lại lần song song mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 vào ngày phân tích khác Kết trình bày bảng Độ Tiến hành theo phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử biết hàm lượng Thêm thể tích xác dung dịch chuẩn acid chlorogenic vào mẫu thử (khối lượng xác khoảng nửa viên - 50% lượng mẫu thử) để thu mẫu tương ứng với lượng acid chlorogenic xử lý mẫu mức nồng độ 70; 100; 130% so với nồng độ định lượng Tại mức nồng độ thực mẫu độc lập Tiến hành phân tích Dựa vào hàm lượng hoạt chất biết mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào diện tích pic mẫu thử thêm chuẩn, diện tích pic acid chlorogenic nồng độ dung dịch chuẩn làm song song tính lượng thu hồi acid chlorogenic Kết trình bày bảng Bảng Kết thẩm định độ xác độ phương pháp Ngày phân tích Độ lặp lại (yêu cầu RSD < 2%; n = 6) RSD (%) TB (mg/viên) RSD (%) 1,796 1,70 1,787 1,81 Độ xác trung gian (yêu cầu RSD < 3,0%; n = 12) Độ (yêu cầu độ thu hồi 98,0 – 102,0%; RSD < 2,0%; n = 3) Ngày phân tích TB (mg/viên) Trung bình (mg/viên): 0,791 RSD: 1,70% Mức Min (%) Max (%) TB (%) RSD (%) 70% 98,35 100,46 99,15 1,16 100% 100,86 101,88 101,32 0,51 130% 98,33 100,12 99,26 0,9 Kết bảng cho thấy, phương pháp đạt yêu cầu độ độ xác theo ICH Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) công ty nhà thuốc địa bàn Hà Nội Tiến hành định lượng acid chlorogenic mẫu theo phương pháp xây dựng Kết trình bày bảng hình Pha lỗng dung dịch chuẩn gốc dịch chiết từ mẫu placebo dung dịch có nồng độ xác khoảng 17 µg/ml Pha lỗng gấp đơi dung dịch thu dịch chiết từ mẫu placebo Tiến hành sắc ký Nồng độ có tỷ lệ S/N 10 coi LOD LOQ phương pháp Từ kết thu được, xác định phương pháp có LOD LOQ 0,196 µg/ml 0,647 µg/ml Từ kết thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng yêu cầu độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác theo qui định ICH; phương pháp có độ nhạy cao, khoảng làm việc 70130% nồng độ định lượng 35 µg/ml Ứng dụng Mua mẫu thuốc viên nang mềm Bổ gan 38 Hình Sắc ký đồ mẫu thử viên nang mềm Bổ gan A.01.0872017 (a), B.01.0982017 (b) TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58) l Nghiên cứu - Kỹ thuật Bảng Kết định lượng acid chlorogenic mẫu viên nang mềm Bổ gan lưu hành thị trường (n = 3) Hàm lượng Hình thức (mg/viên) ± RSD% A.02.1592017 1,721 mg ± 1,28% Viên nang mềm màu nâu, dịch A.02.1692017 1,675 mg ± 0,89% thuốc nang màu vàng nâu, mùi thơm dược liệu A.03.1992017 1,829 mg ± 0,93% TT Mẫu thử B.01.2292017 B.02.0872017 B.03.0982017 1,604 mg ± 0,89% Viên nang mềm màu nâu, dịch 1,572 mg ± 1,31% thuốc nang màu vàng nâu, mùi thơm dược liệu 1,544 mg ± 1,82% Bàn luận Theo Dược điển châu Âu 8.0 [4], acid chlorogenic chiết hồi lưu methanol lặp lại lần giờ/lần chiết hỗn hợp methanol – nước (30:70) cao actiso Tuy nhiên, lặp lại điều kiện chiết mẫu nghiên cứu, hiệu suất thu thấp chiết với hỗn hợp methanol – nước (60:40) Li-Mei Wang CS chiết acid chlorogenic kim ngân hoa với dung môi ethanol 70o cách siêu âm 30 phút; lọc lấy dịch chiết; dịch cô đặc làm khơ 45ºC chân khơng; sau hòa tan cắn methanol định lượng HPLC [6] Quy trình xử lý mẫu phức tạp gây mẫu Dược điển Trung Quốc [3] Nguyễn Thị Ánh Nguyệt CS định lượng acid chlorogenic kim ngân hoa HPLC với với hệ dung môi acetonitril : dung dịch acid phosphoric 0,4% (13:87), chế độ đẳng dòng [2] Với hệ áp dụng phân tích mẫu viên nang mềm Bổ gan khơng đảm bảo rửa giải hết chất chương trình gradient mà xây dựng Nghiên cứu khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký quy trình xử lý mẫu tối ưu để tách acid chlorogenic (tR=17,3 phút, Rs=1,73 As=0,97) chế phẩm viên nang mềm Bổ gan với thời gian phân tích 30 phút Nghiên cứu sử dụng pha tĩnh cột C18 Inertsil ODS có điều nhiệt cột 25oC pha động hỗn hợp MeCN dung dịch acid phosphoric 0,1% với chương trình rửa giải gradient, gradient tốc độ dòng, điều kiện phân tích sắc ký lỏng dễ dàng áp dụng Chế độ gradient pha động tốc độ dòng, kèm rửa giải sau lần phân tích nhằm tách chất cần phân tích, rửa giải chất phân cực đồng thời đưa điều kiện pha động trạng thái ban đầu để phân tích mẫu cho kết ổn định Kết thẩm định theo tiêu chuẩn ICH [4] cho thấy, quy trình đảm bảo tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính 17,9 - 53,6 µg/ml Độ xác ngày ngày có giá trị RSD nhỏ 2%, độ phương pháp với độ tìm lại khoảng 98,0 102,0%, giới hạn định lượng 0,647 µg/ml, thời gian phân tích 30 phút Do sử dụng quy trình cho phân tích thường quy kiểm tra chất lượng chế phẩm viên nang mềm Bổ gan thị trường Phương pháp ứng dụng định lượng acid chlorogenic mẫu thuốc viên nang mềm Bổ gan công ty lưu hành thị trường, kết cho thấy hàm lượng aicd chlorogenic lớn 1,50 mg/ viên đưa tiêu định lượng acid chlorogenic vào tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm Mặt khác, thị trường có nhiều chế phẩm viên nang mềm dùng hỗ trợ điều trị bệnh gan dạng thực phẩm chức lưu hành nên để áp dụng phương pháp cần tiếp tục khảo sát mở rộng khoảng làm việc thẩm định để khẳng định độ độ xác phương pháp Kết luận Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic viên nang mềm Bổ gan bằng HPLC Quy trình xử lý mẫu đơn giản nhanh chóng, điều kiện sắc ký dễ dàng áp dụng Phương pháp xây dựng có độ chính xác đạt yêu cầu, độ đúng tốt, phương pháp có khoảng tuyến tính rộng so với nồng độ định lượng đồng thời có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp nên thích hợp để phân tích thành phần hoạt chất mẫu chế phẩm viên nang mềm Bổ gan lưu hành thị trường Tài liệu tham khảo Hội đồng Dược điển (2009), Dược Điển Việt Nam IV, tr 681, 695 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Lê Phan Kim Trang, Phạm Đông Phương (2016), “Phân lập thiết lập chất chuẩn acid Chlorogenic”, Tạp chí Dược học, 56 (487), tr 22 - 27 Chinese Pharmacopoeia (2015), pp 270-271 European Pharmacopoeia, 8.0, pp 1154-1156 ICH (2005), Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2 (R1) Li-Mei Wang, Mao-Teng Li, You-Yu Yan, Ming-Zhang Ao, GengWu, Long-Jiang Yu (2009), “Influence of flowering stage of Lonicera japonica Thunb On variation in volatiles and chlorogenic acid”, Research Article, (98), pp 953-957 USP 38, Bản online (Ngày nhận bài: 21/02/2018 - Ngày phản biện: 05/04/2018 - Ngày duyệt đăng: 16/04/2018) TẠP CHÍ DƯỢC HỌC - 4/2018 (SỐ 504 NĂM 58) 39 ... Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic viên nang mềm Bổ gan sắc ký lỏng hiệu cao , với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic cao Actiso viên nang. .. TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MAI XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG VIÊN NANG MỀM BỔ GAN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH:... độ viên nang mềm Bổ gan 43 Bảng 11 Kết giới hạn phát 44 Bảng 12 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu cao actiso 45 Bảng 13 Kết định lượng acid chlorogenic mẫu viên nang 47 mềm Bổ gan DANH MỤC