Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHÍ THỊ BẢO THOA Mã sinh viên : 1201576 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG CAO ACTISO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHÍ THỊ BẢO THOA Mã sinh viên : 1201576 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG CAO ACTISO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy hướng dẫn bảo tận tình cho suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Ngô Minh Thúy, giảng viên môn Hóa Phân tích – Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người giúp đỡ giải đáp thắc mắc trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Hoá phân tích - Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu Cuối muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho trình học tập nghiên cứu Hà Nôi, ngày 10 tháng năm 2017 Sinh viên Phí Thị Bảo Thoa MỤC LỤC Table of Contents MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan actiso 1.1.1 Đặc điểm actiso 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Công dụng dạng dùng 1.2 Tổng quan acid chlorogenic 1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 1.2.2 Tác dụng 1.2.3 Phương pháp xác định acid chlorogenic 1.3 Tổng quan cao thuốc 10 1.3.1 Định nghĩa 10 1.3.2 Phương pháp điều chế 11 1.3.3 Yêu cầu chất lượng 12 1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu sắc ký lớp mỏng 13 1.4.1 Nguyên tắc 13 1.4.2 Đại lượng đặc trưng 14 1.4.3 Pha tĩnh 14 1.4.4 Pha động 15 1.4.5 Khai triển sắc ký 15 1.4.6 Phát vết sắc ký đồ 16 1.4.7 Ứng dụng sắc ký lớp mỏng 16 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu: 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Nghiên cứu khảo sát chọn điều kiện sắc ký 20 2.2.2 Nghiên cứu phương pháp chiết acid chlorogenic actiso 21 2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.2.4 Ứng dụng phương pháp xây dựng định lượng acid chlorogenic số mẫu thực 23 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 25 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch 25 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện HPTLC 25 3.2 Khảo sát lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 28 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 28 3.2.2 Khảo sát thời gian chiết 29 3.3 Quy trình phân tích 30 3.3.1 Xử lý mẫu 30 3.3.2 Điều kiện sắc ký 30 3.4 Thẩm định phương pháp 31 3.4.1 Độ thích hợp hệ thống 31 3.4.2 Độ chọn lọc 32 3.4.3 Khoảng tuyến tính 33 3.4.4 LOD - LOQ 35 3.4.5 Độ lặp lại 36 3.4.6 Độ 37 3.5 Áp dụng phương pháp định lượng acid chlorogenic số mẫu cao actiso lưu hành thị trường 38 CHƢƠNG BÀN LUẬN 41 4.1 Về lựa chọn phương pháp phân tích 41 4.2 Về xây dựng phương pháp phân tích 42 4.3 Về việc thẩm định phương pháp phân tích 43 4.4 Về kết nghiên cứu mẫu thực 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ analog đường chuẩn Phụ lục 2: Sắc ký đồ analog mẫu thực Phụ lục 3: Quy trình xử lý mẫu điều kiện phân tích 10 Chuẩn bị mẫu 10 Điều kiện sắc ký 10 Phụ lục 4: Số liệu khảo sát lựa chọn điều kiện chiết 11 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT HPLC : High-performance liquid chromatography CGA : Acid chlorogenic HPTLC :High-performance thin layer chromatography TLC : Thin layer chromatography UV : Ultra violet SKLM : Sắc ký lớp mỏng UPLC : Ultra performance liquid chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các mẫu cao actiso lưu hành thị trường 19 Bảng 2.2 Tên nguồn gốc hóa chất sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Kết khảo sát dung môi chiết 28 Bảng 3.2 Kết khảo sát thời gian chiết 30 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống 31 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ tuyến tính acid chlorogenic 33 Bảng 3.5 Kết xác định LOD, LOQ acid chlorogenic: 35 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp (Mẫu CA1) 36 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ phương pháp 37 Bảng 3.8 Kết hàm lượng acid chlorogenic mẫu thử 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây actiso Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid chlorogenic Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động 27 Hình 3.2 Phổ hấp thụ vết ứng với acid chlorogenic chuẩn 27 Hình 3.3 Biểu đồ kết khảo sát nồng độ dung môi chiết acid chlorogenic cao actiso (n = 2) 29 Hình 3.4 Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống 31 Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc phương pháp 32 Hình 3.6 Sắc ký đồ analog xác định tính chọn lọc phương pháp (Mẫu CA1) 33 Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định khoảng tuyến tính acid chlorogenic 34 Hình 3.8 Đường biểu diễn mối tương quan lượng chuẩn vết diện tích pic acid chlorogenic 34 Hình 3.9: Sắc ký đồ analog mẫu chuẩn acid chlorogenic xác định LOD - LOQ 35 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu thực 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Chăm sóc sức khỏe ban đầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng công việc cấp bách cần thiết Công nghiệp hóa phát triển nhanh môi trường sống có nguy bị suy thoái, việc phòng chữa bệnh trở lên cấp bách Chữa bệnh thuốc y học cổ truyền phương pháp có từ lâu đời nước ta giữ vai trò quan trọng y học nước nhà Những năm gần đây, nước giới có khuynh hướng đẩy mạnh việc sử dụng thuốc đông y kết hợp với thuốc tây y điều trị số bệnh mãn tính Ở Việt Nam, thị trường thuốc đông dược dược liệu làm thuốc trở nên đa dạng chủng loại phong phú nguồn gốc Công tác kiểm tra chất lượng thuốc đặc biệt thuốc đông dược dược liệu làm thuốc nhiệm vụ cấp thiết quan trọng góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Actiso có tên khoa học Cynara scolymus L, thuộc họ cúc (Asteraceae), tên gọi khác artichoke, globe artichoke (Anh); artichaut (Pháp) Actiso có nhiều tác dụng, tác dụng quan trọng làm tăng lượng nước tiểu lượng urê nước tiểu, làm giảm số Ambard, giảm nồng độ cholesterol máu urê máu Thành phần có tác dụng giảm béo phì, hạ huyết áp, kháng virus, chống ung thư đại tràng nhờ khả sửa chữa tổn thương ADN mô hình chuột thực nghiệm acid chlorogenic [6] Hoạt chất acid chlorogenic actiso biết đến chất có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế phát triển khối u; chống đột biến gen tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng chống virus, kháng khuẩn chống nấm kèm độc tính mức độ thấp Đã có số nghiên cứu định lượng acid chlorogenic dược liệu HPLC Dược điển Mỹ [29], Dược điển châu Âu [17], sắc ký lớp mỏng [19], [22], [24] (10:1,1:1,1:2,7) có khả tách tốt chất mẫu thử, vết acid chlorogenic rõ ràng Rf acid chlorogenic đạt 0,50 Phát chất phân tích sau tách sắc ký lớp mỏng bước quan trọng để đánh giá kết Acid chlorogenic có huỳnh quang xanh sáng ánh sáng tử ngoại 366 nm nên lựa chọn điều kiện để phát định tính chất phân tích Mặt khác, phát huy ưu thiết bị có chế độ Scan nên vết acid chlorogenic sắc ký đồ quét từ 200 – 700 nm xác định cực đại hấp thụ bước sóng 330 nm Bước sóng lựa chọn để lấy kết định lượng Việc lấy kết đáp ứng bước sóng cực đại cho phép tăng độ nhạy phép phân tích Phương pháp định tính, định lượng acid chlorogenic actiso nghiên cứu công bố chủ yếu dùng phương pháp HPLC với detector UV – DAD [12], [17], [20], LC-MS/MS [18], [14] Ngoài xác định thành phần acid chlorogenic nghiên cứu công bố thành phần polyphenol khác có actiso acid 1,3-di-O-caffeoylquinic (cynarin) acid 1,5-di-O-caffeoylquinic Với phương pháp này, yêu cầu thiết bị đắt tiền, mẫu thử làm cột nhồi Sephadex LH-20 [20] nên phức tạp đắt tiền 4.3 Về việc thẩm định phƣơng pháp phân tích Phương pháp phân tích nghiên cứu thẩm định tiêu độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ xác, độ đúng, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Kết cho thấy phương pháp cho độ chọn lọc cao Khoảng tuyến tính xây dựng khoảng lượng acid chlorogenic 1,94 – 4,85 µg/ vết, kết cho thấy có tương quan chặt chẽ hàm lượng hoạt chất đáp ứng pic sắc ký (diện tích pic sắc ký) với hệ số tương quan lớn 0,99 Độ lặp lại đánh giá mẫu búp actiso cho kết đáp ứng yêu cầu AOAC mức hàm lượng chất phân tích – 10 % RSD lần phân tích song song phải < 2,7% (2,30%) 43 Độ phương pháp đánh giá thông qua độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn, kết cho thấy độ thu hồi phương pháp phải đạt 97,07% – 102,39% (n = 6) đáp ứng yêu cầu AOAC nằm khoảng 97-103% mức hàm lượng chất phân tích – 10 % [13] 4.4 Về kết nghiên cứu mẫu thực Phương pháp nhiên cứu thực đối tượng mẫu thực tiến hành thu thập khu vực thành phố Hà Nội Cụ thể là, mẫu cao khô cung cấp Công ty Dược phẩm Traphaco Công ty CP BV Pharma, mẫu cao mềm mua trực tiếp từ cửa hàng phân phối sản phẩm Kết cho thấy, mẫu thực có chứa chất phân tích acid chlorogenic đạt Rf = 0,50 Tuy nhiên lượng chất phân tích có mẫu lại chênh lệch nhiều mẫu thực với Cụ thể mẫu có lượng chất phân tích cao 4,57% (CA5 – cao khô cung cấp Công ty CP BV Pharma); mẫu có chứa hàm lượng acid chlorogenic thấp đạt 0,70% (CA4 – cao mềm, cao hoa Ngọc Duy), mẫu CA3 - cao mềm, cao Ngọc Duy có hàm lượng chất phân tích trung bình 2,56% Vậy, phương pháp HPTLC giúp định lượng hàm lượng acid chlorogenic mẫu cao actiso lưu hành thị trường từ giúp đánh giá chất lượng sản phẩm quy trình sản xuất sử dụng 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thực nghiệm thu có kết luận sau: Đã xây dựng thẩm định phương pháp xác định acid chlorogenic cao actiso sắc ký lớp mỏng hiệu cao Cụ thể là: Phương pháp định lượng: Mẫu thử (cao khô, cao mềm) chiết dung môi methanol – nước = 60:40 Acid chlorogenic dung dịch mẫu thử tách mỏng silica gel 60 F254 rửa giải với pha động etyl acetat: acid acetic: acid formic: nước (10:1,1:1,1:2,7); thể tích chấm: 25 µl; định tính soi đèn UV 366 nm xác định Rf quan sát màu sắc vết; định lượng bước sóng 330 nm Phát acid chlorogenic mẫu thử dựa vào so sánh Rf màu sắc vết hoạt chất xuất sắc ký đồ dung dịch mẫu thử với sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Nồng độ acid chlorogenic dung dịch mẫu thử xác định dựa vào đường chuẩn xây dựng ngày phân tích với r ≥ 0,99 Căn vào lượng cân, độ pha loãng mẫu thử diện tích pic sắc ký đồ mẫu thử xác định hàm lượng acid chlorogenic mẫu thử Phương pháp thẩm định tiêu chí độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Kết đáp ứng yêu cầu AOAC Ứng dụng phương pháp định lượng mẫu cao actiso lưu hành thị trường cho thấy kết định lượng chênh lệch tương đối lớn ( 0,70 – 4,57%) Từ cho thấy chất lượng cao actiso thị trường cần kiểm tra chặt chẽ góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm chứa actiso phục vụ người sử dụng Kiến nghị 45 Ứng dụng phương pháp phân tích acid chlorogenic xây dựng để kiểm tra chất lượng loại cao actiso lưu hành nhằm kiểm soát chất lượng sản phẩm phục vụ công tác kinh doanh, sản xuất chế phẩm chứa thành phần actiso 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2015), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr 681 Bộ Y Tế (2012), Hóa phân tích-Tập II, NXB Y Học, Hà Nội, tr 205214 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, NXB khoa học kỹ thuật, tr 79-81 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, tr 221-222 Lê Thị Thu Hiền (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam trồng hái, chế biến trị bệnh ban đầu, NXB Nông nghiệp, tr 977-978 Phạm Lý Hà (2015), Nghiên cứu đa dạng sinh học Kim ngân (Lonicera SPP.), Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Dược Hà Nội, tr 33 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Lê Phan Kim Trang, Phạm Đông Phương (2016), Phân lập thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic, Tạp chí Dược học, 56 (487), tr 22-27 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Phạm Phương Chi, Nguyễn Thị Duyên Anh, Phạm Đông Phương (2016), Phân lập thiết lập chất chuẩn cynarin, Tạp chí Dược học, 56 (483), tr 37-42 10 Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Trần Thị Hoàng Chi, Phạm Đông Phương (2016), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cynarosid scolymosid actisô (Cynara scolymus L., Asteracea), Tạp chí Dược học, 56 (482), tr 22-26 11 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 33 Tiếng Anh 12 Abdul Mutalib A.G Nasser (2012), “Phytochemical Study of Cynara scolymus L (Artichoke) (Asteraceae) Cultivated in Iraq, Detection and Identification of Phenolic Acid Compounds Cynarin and Chlorogenic Acid”, Phytochemical study of cynara scolymus L.cultivated in Iraq, 21(1), pp 6-13 13 AOAC International (2016), Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements 14 Aveen Nozad Adham (2015), “Simultaneous estimation of caffeic and chlorogenic acid content in Ammi majus seed by TLC and HPLC”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7(6), pp 263-267 15 Bin Zhang, Ruiyuan Yang, Yan Zhao, Chun-Zao Liu, Journal of chromatography B, “separation of chlorogenic acid honeysuchle crude extracts by macroporous resin”, www.elsevier.com/locate/chromb 16 EUROPEAN MEDICINES AGENCY, Assessment report on Cynara scolymus L., folium (2011), Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC) 17 European Pharmacopoeia 8.0, pp 1154-1156 18 Florinda Fratianni, Rosa Pepe, Filomena Nazzaro (2014), “Polyphenol Composition, Antioxidant, Antimicrobial and Quorum Quenching Activity of the “Carciofo di Montoro” (Cynara cardunculus var scolymus) Global Artichoke of the Campania Region, Southern Italy”, 5, pp 2053-2062 19 Hisae Oku,Yuko Ogawa, Emiko Iwaokaand Kyoko Ishiguro (2011),”Allergy - Preventive Effects of Chlorogenic Acid and Iridoid Derivatives from Flower Buds of Lonicera japonica”,Pharmaceutical Society of Japan, 34(8), pp 1330-1333 20 Jan Fritsche, Christaan M Beindorff, Markus Dachtler, Hui Zhang, Jan G Lammers (2002), Isolation, characterization and determination of minor artichoke (Cynarascolymus L.) leaf extract compounds, European Food Research and Technology, 215(2), pp 149–157 21 Li-Mei Wang, Mao-Teng Li, You-Yu Yan, Ming-Zhang Ao, GengWu and Long-Jiang Yu (2009), “Influence of flowering stage of Lonicera japonica Thunb On variation in volatiles and chlorogenic acid”, Research Article, 98, pp 953-957 22 Mirna Leonor Sua rez-Quiroz, Angelina Alonso Campos, Gerardo Valerio Alfaro, Oscar Gonzalez-Rıos, Pierre Villeneuve, Maria Cruz Figueroa-Espinoza (2014), “Isolation of green coffee chlorogenic acids using activated carbon”, Journal of Food Composition and Analysis, 33, pp 55-58 23 Nassar MI, Mohamed TK, Elshamy AI, El-Toumy SA, Abdel Lateef AM, Farrag AR (Aug 15, 2013), Chemical constituents and antiulcerogenic potential of the scales of Cynarascolymus (artichoke) heads, 93(10):2, pp 494-501 24 Nia Kristiningrum, Yuni Retnaningtyas Ni Putu Pertiwi (2015), “Validated TLC-Densitometry Method for Determination of Chlorogenic Acid In Coffee Leaves Extract”, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 6(5), pp 11381143 25 Schütz K, Kammerer D, Carle R, Schieber A (2004 Jun 30), Identification and quantification of caffeoylquinic acids and flavonoids from artichoke (Cynarascolymus L.) heads, juice, and pomace by HPLC-DAD-ESI/MS(n), 52(13): 4090-6 26 Sherma, Joseph Fried, Bernard (2003), Handbook of thin-layer chromatography-vol.89, CRC press 27 sigmaaldrich.com 28 T.V Orlovskaya, I.L Luneva, V.A Chelombit´ko, Chemical composition of Cynarascolymus leaves, Chemistry of Natural Compounds 43(2), pp: 239-240 29 USP Pharmacopoeia 38, online 30 Xianfeng Zhu, Hongxun Zhang, Raymond Lo (2004), Phenolic Compounds from the Leaf Extract of Artichoke (Cynara scolymus L.) and Their Antimicrobial Activities, J Agric Food Chem., 52 (24), pp 7272–7278 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ analog đƣờng chuẩn Lượng chất/ vết (µg) 1,94 2,91 Sắc ký đồ analog 3,88 4,85 Phụ lục 2: Sắc ký đồ analog mẫu thực Mẫu Sắc ký đồ analog CA2 CA3 CA4 CA5 CA6 Phụ lục 3: Quy trình xử lý mẫu điều kiện phân tích  Chuẩn bị mẫu - Dung dịch chuẩn: Dung dịch acid chlorogenic chuẩn methanol có nồng độ xác khoảng 1,00 mg/ml Pha loãng xác dung dịch MeOH thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,20 mg/ml; 0,30 mg/ml; 0,40 mg/ml; 0,50 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,0200 g cao dược liệu cho vào bình định mức ml Thêm vào bình định mức khoảng ml MeOH 60% Siêu âm 15 phút Thêm dung môi vừa đủ đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm  Điều kiện sắc ký - Bản mỏng silica gel GF254 (10 × 15 cm) hoạt hóa 110oC 30 phút - Pha động: Ethyl acetat: acid acetic: acid formic: nước (10:1,1:1,1:2,7) - Quãng đường dung môi: 13 cm - Thể tích mẫu: 25 µl - Xử lý kết quả: định tính đèn UV 366 nm xác định Rf quan sát màu sắc vết; định lượng bước sóng 330 nm Phụ lục 4: Số liệu khảo sát lựa chọn điều kiện chiết Khảo sát dung môi chiết Lần Tỷ lệ dung Lần môi m (g) A (AU) m (g) A (AU) 30 0,02042 26074,5 0,0215 23812,3 40 0,02094 26649,9 0,0206 23482,3 50 0,0203 26690,3 0,0198 23073,8 60 0,01934 27678,0 0,0206 24061,2 70 0,02064 26241,6 0,0192 22119,1 80 0,0213 21978,6 0,0231 22198,9 30 0,02276 24429,6 0,0208 20188,1 40 0,01974 21787,1 0,0216 21583,5 50 0,01842 20360,3 0,0211 21721,3 60 0,0196 22274,5 0,0197 22103,3 70 0,0214 23608,7 0,0221 23001,2 80 0,01964 21049,4 0,0204 20232,7 0,0239 27741,7 0,0225 22942,0 MeOH EtOH Nước Khảo sát thời gian chiết Thời gian Lần Lần chiết (phút) m (g) A (AU) m (g) A (AU) 15 0,0202 21715,5 0,0221 22842,0 30 0,0214 23017,7 0,0206 21459,3 ... actiso phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao , với mục tiêu sau: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic cao actiso phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao - Ứng dụng phương pháp. .. NỘI PHÍ THỊ BẢO THOA Mã sinh viên : 1201576 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG CAO ACTISO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng... dụng phương pháp định lượng acid chlorogenic số mẫu cao actiso lưu hành thị trường 38 CHƢƠNG BÀN LUẬN 41 4.1 Về lựa chọn phương pháp phân tích 41 4.2 Về xây dựng phương pháp