Phân lập và xây dựng quy trình định lượng acid oleanolic và acid ursolic trong lá cây xạ đen ( celastrus hindsii benth )

THÁI PHÁT - KHÓA 2020 – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI PHÁT PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC VÀ ACID URSOLIC TRONG LÁ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII BENTH.) - NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI PHÁT PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC VÀ ACID URSOLIC TRONG LÁ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII BENTH.) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ THỊ THANH DIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan Tác giả luận văn Thái Phát ii Luận văn thạc sỹ dược học Khóa 2020 – 2022 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc & độc chất – Mã số: 8720210 PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC VÀ ACID URSOLIC TRONG LÁ CÂY XẠ ĐEN (CELASTRUS HINDSII BENTH.) Học viên: Thái Phát NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGƠ THỊ THANH DIỆP Từ khóa: sắc ký lỏng hiệu cao, xạ đen, acid ursolic, acid oleanolic, mangiferin Mở đầu: Xạ đen loại dược liệu phân bố rộng số nước thuộc khu vực Đông Á Đông Nam Á Trung Quốc, Việt Nam, My-an-ma, Thái Lan Thành phần hóa học xạ đen có chứa nhiều hợp chất thuộc nhóm flavonoid, triterpen polyphenol, đặc biệt acid oleanolic, acid ursolic mangiferin chứng minh có tác dụng tốt điều trị ung thư, kháng vi khuẩn, virus in vitro in vivo Các loại thuốc thực phẩm chức từ Xạ đen bắt đầu xuất thị trường Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Xạ đen tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, đồng thời kiểm tra chất lượng chế phẩm có nguồn gốc từ xạ đen lưu hành thị trường vấn đề quan tâm Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Lá xạ đen Celastrus hindsii Benth thu mua vào tháng 05 năm 2021 Viện Dược liệu trung ương Lá sấy khô, xay thành bột thô Phương pháp nghiên cứu: Dùng phương pháp ngấm kiệt xạ đen với ethanol 70 % Cắn thu đem lắc phân bố thu phân đoạn có độ phân cực khác Phân lập hợp chất từ phân đoạn, xác định cấu trúc chất phân lập dựa vào liệu phổ UV, IR, MS NMR Định lượng acid oleanolic acid ursolic Xạ đen máy HPLC Shimadzu SPD-20A, đầu dò PDA SPD-M20A với cột Gemini C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm) Kết quả: Từ kg bột xạ đen, chiết ngấm kiệt với ethanol 70 % thu 408 g cao toàn phần, 11,52 g cao dicloromethan 5,23 g cao n-butanol Sử dụng 11,52 g cao iii dicloromethan phân lập hợp chất acid oleanolic (OA: 35,28 mg) acid ursolic (UA: 31,21 mg) Sử dụng 5,23 g cao n-butanol phân lập mangiferin (23,95 mg) Định lượng acid oleanolic acid ursolic bột xạ đen phương pháp HPLC đầu dò PDA Kết cho thấy hàm lượng acid oleanolic acid ursolic xạ đen khoảng 0,63 mg/g 0,54 mg/g Kết luận: Những kết tiền đề cho nghiên cứu kiểm nghiệm dược liệu xạ đen tác dụng dược lý sau iv Master’s thesis of Pharmacy Academic course: 2020 – 2022 Major: Drug quality control & Toxicology – Speciality code: 8720210 ISOLATION AND DEVELOPMENT OF QUANTITATIVE PROCEDURE FOR ACID OLEANOLIC AND ACID URSOLIC FROM CELATRUS HINDSII BENTH LEAVES Thai Phat Supervisor: Assoc Prof Dr Ngo Thi Thanh Diep Keywords: HPLC, Celatrus hindsii Benth., acid oleanolic, acid ursolic, mangiferin Introduction: Celastrus hindsii Benth is a medicinal herbs originating from the East Asia and Southeast Asia such as China, Vietnam, Myanmar, Thailand The chemical composition in Celastrus hindsii Benth includes flavonoid, triterpene and polyphenols, especially acid oleanolic, acid ursolic mangiferin has been verified to be effective in treating cancer disease, antibacterial, antivirus in vitro and in vivo Drugs and dietary supplements from Celastrus hindsii Benth have sold in pharmacies Standardization of Celastrus hindsii Benth to produce raw materials for production for treatment of cancer disease, antibacterial, antivirus, and controlling the quality of products from Celastrus hindsii Benth Materials and Methods Materials: Leaves of Celastrus hindsii Benth were purchased in May 2021, National Institute of Medicine Materials Leaves are dried, milled into raw powder Methods of study: Using exhausting method, leaves of Celastrus hindsii Benth were extracted with ethanol 70 % This extract was shaken to distribute the fractions with different polarization Compouds from fractions were isolated and determined the structure based on UV, IR, MS, NMR data Quantificating acid oleanolic and acid ursolic from leaves of Celastrus hindsii Benth was performed on the HPLC Shimadzu SPD-20A, PDA SPD-M20A detector, Gemini C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm) column Results: Defatted kg leaves powder of Celastrus hindsii Benth., extracted with ethanol 70 %, got 408 g total extract, 11,52 g dicloromethan extract and 5,23 g n- v butanol Using 11,52 g dicloromethan extract isolated acid oleanolic (OA: 35,28 mg) acid ursolic (UA: 31,21 mg) Using 5,23 g n-butanol extract isolated 23,95 mg mangiferin Quantificating acid oleanolic and acid ursolic from leaves of Celastrus hindsii Benth was performed on the HPLC with PDA detector The results showed that the content of acid oleanolic and acid ursolic in leaves of Celastrus hindsii Benth were 0,63 mg/g acid oleanolic and 0,54 mg/g acid ursolic Conclusion: These results are the first step for further studies on quality control in Celastrus hindsii Benth as well as its pharmacological effects in the future vi MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ xii CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học 1.2 Tổng quan thành phần hóa học xạ đen 1.3 Tổng quan tác dụng sinh học xạ đen 1.4 Tổng quan acid oleanolic, acid ursolic mangiferin 1.5 Một số sản phẩm từ xạ đen 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Xác định độ ẩm xạ đen 26 3.2 Kiểm tra tính xạ đen 26 3.3 Xác định chất chiết xạ đen 29 3.4 Khảo sát sơ thành phần hóa học xạ đen 30 3.5 Chiết xuất 32 3.6 Phân lập – tinh chế - xác định cấu trúc 32 3.7 Xây dựng qui trình định lượng acid oleanolic acid ursolic xạ đen phương pháp HPLC 58 CHƯƠNG BÀN LUẬN 72 4.1 Kiểm tra tính dược liệu 72 4.2 Khảo sát sơ thành phần hóa học xạ đen 73 4.3 Chiết xuất – phân lập – tinh chế 73 4.4 Xác định độ tinh khiết 75 vii 4.5 Xác định cấu trúc acid oleanolic, acid ursolic mangiferin 76 4.6 Xây dựng qui trình định lượng đồng thời acid oleanolic acid ursolic xạ đen (Celastrus hindsii Benth.) 79 CHƯƠNG 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Việt Từ nguyên Trung bình X ACN Acetonitrile AR Analytical Reagent As Hệ số bất đối xứng đỉnh AU Absorbance Unit CTPT d Công thức phân tử Doublet DCM Dicloromethan DĐVN V Dược điển Việt Nam V DMSO Dimethyl sulfoxid F Trắc nghiệm Fisher Acetonitril Hóa chất phân tích Đỉnh đơi* High Performance HPLC Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao IR Chromatography InfraRed Hồng ngoại J Hằng số ghép* k Hệ số dung lượng Liquid chromatography – LC/MS Sắc kí lỏng đầu dò khối phổ LD50 mass spectrometry Lethal dose 50 % Liều gây chết 50 % vật thử nghiệm MeOH MS Methanol Mass Spectroscopy Khối phổ N Số đĩa lý thuyết Cỡ mẫu n Nuclear Magnetic NMR OA Resonance Acid oleanolic PDA Photodiode array Cộng hưởng từ hạt nhân* Dãy diod quang Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-21 PHỤ LỤC 25 Sắc kí đồ tính đặc hiệu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-22 Temperature T.Max :20 C :85 C Model Lamp Type Wavelength From Wavelength To Use Cell Temp Cell Temp Slit Width :SPD-M20A :D2 :190 nm :800 nm :Use :40 C :1.2 nm Time 30.00 Unit Controller Channel :Extracted Chromatogram Width :5 sec Slope :1000 uV/min Drift :0 uV/min T.DBL :1000 Max Slices :0 Peak Top Detection :Normal RT Compensation Mode :Normal Min Area/Height :1000 counts Calculated by :Area Registered Spectrum Table :OFF Channel :Ch1 205nm Width :5 sec Slope :158211 uV/min Drift :0 uV/min T.DBL :1000 Max Slices :0 Peak Top Detection RT Compensation Mode Min Area/Height :1e+006 counts Calculated by :Area Registered Spectrum Table :Normal :Normal :OFF Channel :Extracted Chromatogram None Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Command Stop Value Comment Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-23 PHỤ LỤC 26 Sắc kí đồ mẫu thử Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-24 Pump Mode Pump A Total Flow B.Conc C.Conc D.Conc LPGE Mode :Low pressure gradient :LC-20AD :1.00 mL/min :1.0 % :88.0 % :0.0 % :Auto AutoSampler Use AutoSampler Sample Rack Sample Cooler Temp Oven Use Oven Temperature T.Max :SIL-20AC :Use :Rack 1.5mL 70 vials :OFF :CTO-10ASvp :Use :20 C :85 C Model Lamp Type Wavelength From Wavelength To Use Cell Temp Cell Temp Slit Width :SPD-M20A :D2 :190 nm :800 nm :Use :40 C :1.2 nm Time 30.00 Unit Controller Command Stop Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Value Comment Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-25 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-26 PHỤ LỤC 27 Sắc kí đồ tính tuyến tính Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-27 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-28 PHỤ LỤC 28 Sắc kí đồ tính độ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-29 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-30 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-31 PHỤ LỤC 29 Sắc kí đồ độ xác trung gian Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-32 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-33 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-34 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn