Định lượng ginsenoside RB1, RE, RG1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Bài viết trình bày việc định tính và định lượng 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1, khảo sát và lựa chọn bước sóng xác định ginsenoside Rb1, Re, Rg1 và xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng HPTLC.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013 ĐỊNH LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO Trần Quang Trung*; Trịnh Văn Lẩu**; Nguyễn Văn Bạch* TÓM TẮT Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) với điều kiện: + Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254 + Hệ dung mơi: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10 + Bước sóng:  = 275 nm * Từ khóa: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao; Phương pháp định lượng ginsenoside QUANTITATIVE ANALYSIS OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BY HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY SUMMARY Quantitative analysis method of ginsenoside Rb1, Re, Rg1 by high performance thin layer chromatography was built based on the following conditions: + Thin layer: HPTLC silica gel 60F254 + Solvens system: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10 + Wavelength:  = 275 nm * Key words: High performance thin layer chromatography; Ginsenoside quantitative method ĐẶT VẤN ĐỀ hoạt chất có chế phẩm, đặc biệt Sắc ký lớp mỏng hiệu cao kỹ thuật đại, nước ta trang thiết bị đắt tiền Tuy nhiên, độ nhạy độ xác cao phân tích chế phẩm có nguồn gốc dược liệu Chúng tiến hành xây dựng phương pháp nhằm: Định tính định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 * Học viện Quân y ** Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS TS Nguyễn Liêm PGS TS Nguyễn Văn Minh 12 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu * Ngun liệu, dung mơi, hố chất: - Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 loại SH (hãng Chromadex, Mỹ) - Các dung mơi, hố chất tinh khiết PA * Dụng cụ trang thiết bị: - Hệ thống HPTLC hãng DESAGA; mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x 10 cm; 20 x 20 cm; pipet tự động - 10 l, - 20 l, 100 l, 200 l, 500 l; loại dụng cụ thuỷ tinh có độ xác thích hợp Phƣơng pháp nghiên cứu * Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp: - Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch ginsenoside Rb1 có nồng độ 51,1875 g/ml; ginsenoside Re có nồng độ 20,0625 g/ml ginsenoside Rg1 có nồng độ 51,475 g/ml - Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch ginsenoside Rb1 có nồng độ 150,9375 g/ml; ginsenoside Re có nồng độ 40,125 g/ml ginsenoside Rg1 có nồng độ 200,575 g/ml - Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch ginsenoside Rb1 có nồng độ 250,6875 g/ml; ginsenoside Re có nồng độ 60,1875 g/ml ginsenoside Rg1 có nồng độ 351,45 g/ml - Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch ginsenoside Rb1 có nồng độ 350,4375 g/ml; ginsenoside Re có nồng độ 80,25 g/ml ginsenoside Rg1 có nồng độ 500,55 g/ml - Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch ginsenoside Rb1 có nồng độ 450,1875 g/ml; ginsenoside Re có nồng độ 100,3125 g/ml ginsenoside Rg1 có nồng độ 651,425 g/ml - Khảo sát lựa chọn pha động: Tiến hành khảo sát trình tách ginsenoside Rb 1, Re, Rg1 dung dịch chuẩn hỗn hợp với hệ dung môi sau: chloroform/MeOH/H 2O = 13/7/2 (lớp dưới); n-Butanol/AcOEt/H 2O = 4/1/5 (lớp trên); chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10 Dựa vào kết quả, giá trị Rf phổ tử ngoại-khả kiến sắc ký đồ, lựa chọn pha động phù hợp cho tách ginsenoside Rb1, Re, Rg cho peak gọn cân xứng * Khảo sát lựa chọn bước sóng xác định ginsenoside Rb1, Re, Rg1: Dựa vào phổ hấp thụ tử ngoại saponin phun thuốc thử màu, tiến hành quét phổ UV mẫu thử mẫu chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 nhiều bước sóng khoảng từ 200 - 800 nm Trên sở phổ UV saponin kết hợp với phổ mẫu chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 nhiều bước sóng khác nhau, lựa chọn bước sóng cho cường độ tín hiệu peak ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lớn * Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 HPTLC: - Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký: Chấm lần hỗn hợp dung dịch chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lên mỏng chuẩn bị sẵn tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn Ghi diện tích peak thu Đánh giá độ thích hợp hệ thống sắc ký sở xác định sai số tương đối lần chấm mẫu thử phải < 5% * Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký: 14 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 - Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích peak Pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ biến thiên khoảng từ 51,1875 g/ml đến 450,1875 g/ml (đối với ginsenoside Rb1), 20,0635 g/ml đến 100,3125 g/ml (đối với ginsenoside Re) 51,475 g/ml đến 651,425 g/ml (đối với ginsenoside Rg1) Dựa điều kiện sắc ký chọn, chấm 20 l dung dịch lên mỏng chuẩn bị sẵn Ghi diện tích peak thu - Xác định giới hạn định tính, định lượng phương pháp: Chấm lần dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 có nồng độ tương ứng: 51,1875 g/ml; 20,0625 g/ml; 51,475 g/ml lên mỏng chuẩn bị sẵn tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Ghi diện tích peak thu - Khảo sát độ lặp lại phương pháp: Dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 ethanol tuyệt đối Hình 1: Phổ HPTLC hỗn hợp (Rb1, Re, Rg1) từ 200 - 800 nm (3D) (Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/ H2O = 15/40/22/10) Trên sắc phổ thu bước sóng 275 nm, peak tách gọn, cân xứng cường độ tín hiệu peak ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lớn Vì vậy, chúng tơi chọn bước sóng * Kết khảo sát lựa chọn pha động: Chấm hỗn hợp dung dịch chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lên mỏng sắc ký chuẩn bị sẵn, tiến hành sắc ký điều kiện chọn Ghi diện tích peak thu sắc đồ mẫu chuẩn mẫu thử tương ứng Đánh giá độ lặp lại sở xác định độ lệch chuẩn tương đối phép thử song song KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký Hình 2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn Rb1, Re, Rg1 bước sóng 275 nm (3D) * Kết khảo sát lựa chọn bước sóng xác định ginsenoside Rb1, Re, Rg1: (Hệ dung môi: cloroform/AcOEt/MeOH/ H2O = 15/40/22/10) 15 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Kết khảo sát hệ dung môi cho thấy: có tách rõ rệt vết ginsenoside Rb1, Re, Rg1 mẫu thử cho peak gọn Có thể sử dụng hệ dung mơi để định tính định lượng ginsenoside Kết xây dựng phƣơng pháp định lƣợng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 HPTLC * Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký: Bảng 1: Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký DIỆN TÍCH PEAK (AU) STT Ginsenoside Rb1 Ginsenoside Re Ginsenoside Rg1 187,1300 82,5000 300,4500 175,2300 79,4600 292,4900 198,8100 76,8400 320,2500 186,2600 74,0200 328,6200 190,0300 80,0200 318,0900 187,4920 78,5680 311,9800 SD 8,4638 3,2417 14,9617 RSD% 4,5142 4,1260 4,7957 Hệ thống có tính thích hợp tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 5%, phù hợp với yêu cầu Dược điển Trung Quốc (2005), bảo đảm định tính định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 dược liệu * Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định lượng: Bảng 2: Kết xác định khoảng tuyến tính nồng độ diện tích peak GINSENOSIDE Rb1 DUNG DỊCH GINSENOSIDE Re GINSENOSIDE Rg1 Nồng độ (g/ml) Diện tích pic (AU) Nồng độ (g/ml) Diện tích pic (AU) Nồng độ (g/ml) Diện tích pic (AU) 51,1875 41,5800 20,0629 14,3300 51,4750 54,3400 150,9375 239,7667 40,1250 100,2433 200,5750 351,7767 250,6875 411,3633 60,1875 178,8933 351,4500 636,6433 350,4375 597,0800 80,2500 248,66 500,5500 952,7067 450,1875 767,6867 100,3125 332,4133 651,4250 1257,9900 Phương trình hồi quy: ginsenoside Rb1: Y1 = 1,8141X1 - 43,267; ginsenoside Re: Y2 = 3,9107X2 - 60,467; ginsenoside Rg1: Y3 = 2,0055X3 - 53,455 Hệ số tương quan r1 = 0,9997; r2 = 0,9994; r3 = 0,9998 16 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Kết cho thấy: khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính nồng độ ginsenoside Rb1, Re Rg1 với diện tích peak với hệ số tương quan 0,9997; 0,9999 0,9998 Các khoảng tuyến tính ginsenoside Rb1, Re, Rg1 phù hợp để định lượng chúng * Kết xác định giới hạn định tính, định lượng phương pháp: Xác định giới hạn định tính (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) dựa đáp ứng dung dịch chuẩn có nồng độ thấp khoảng tuyến tính hệ số góc đường hồi quy Bảng 3: Kết xác định độ lệch chuẩn đáp ứng mẫu chuẩn có nồng độ 51,1875 g ginsenoside Rb1 ethanol STT Diện tích peak 44,4400 39,5400 43,5400 42,2400 41,0800 Thống kê Trung bình = 42,1680; SD = 1,9455 RSD = 4,6137 Bảng 4: Kết xác định hệ số góc (a) đường hồi quy tuyến tính diện tích peak nồng độ ginsenoside Rb1 0.9997 1.8141 43.2670 0.9987 1.8217 32.6710 0.9980 1.822 35.4880 0.9991 1.7258 39.5520 0.9985 1.8531 35.1450 Trung b×nh = 1,8073 SD = 0,0480 RSD = 2,6549 Giới hạn định tính định lượng ginsenoside Rb1 là: 3,2368 g/ml 10,6814 g/ml * Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp: Bảng 5: Kết khảo sát độ lặp lại STT LƯỢNG CÂN THỬ (gam) DIỆN TÍCH PEAK (AU) HÀM LƯỢNG (%) Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Rb1 Re Rg1 Rb1 Re Rg1 1,0333 992,8900 190,2800 1437,0200 1,1055 0,1241 1,4385 1,0253 954,9300 177,3400 1384,7900 1,0733 0,1186 1,3989 1,0254 958,8700 180,3000 1390,8800 1,0775 0,1201 1,4047 17 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 1,0541 1064,9000 199,4900 1533,6700 1,1590 0,1261 1,5015 1,0309 977,4600 186,6400 1415,9800 1,0916 0,1226 1,4215 1,0338 989,8100 183,8100 1432,4680 1,1014 0,1223 1,4330 SD 44,6498 8,7309 60,2851 0,0346 0,0030 0,0413 RSD% 4,5109 4,7499 4,2085 3,1434 2,4676 2,8822 Kết khảo sát cho thấy: Độ lặp lại hệ thống sắc ký phù hợp với yêu cầu phân tích định lượng Dược điển Trung Quốc (2005) với RSD < 5% KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO - Đã xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với cỏc điều kiện sau: + Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254 + Hệ dung mụi: chloroform/AcOEt/MeOH/ H2O = 15/40/22/10 + Bước súng:  = 275 nm - Đã xacs định tính thích hợp hệ thống sắc ký HPTLC, khoảng tuyến tính, giới hạn định tớnh, giới hạn định lượng, độ lặp lại khoảng tuyến tính phương pháp Phương pháp ứng dụng để định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 nhân sâm Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tập II, 2004, tr.704-710 Viện Dược liệu Nghiên cứu thuốc từ thảo dược Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 2006, tr.434-450, 493-513 Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW Đảm bảo chất lượng thuốc số phương phỏp kiểm nghiệm 2007, tr.107-120, 372-392 Kurt Randerath Sắc ký lớp mỏng Nhà xuất Y học Người dịch: Nguyễn Hữu Bảy, Trần Trung Nam 1974 Pharmacopoeia of the Peoples’ Republic of China English Edition, Vol I Chemical Industry Press, 2005, pp.205-207, 223-225 Appendix VI, A 38-40 Ngày nhận bài: 10/9/2012 Ngày giao phản biện: 10/10/2012 Ngày giao thảo in: 28/12/2012 18 ... độ tín hiệu peak ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lớn * Xây dựng phương pháp định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 HPTLC: - Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký: Chấm lần hỗn hợp dung dịch chuẩn ginsenoside. .. tách rõ rệt vết ginsenoside Rb1, Re, Rg1 mẫu thử cho peak gọn Có thể sử dụng hệ dung mơi để định tính định lượng ginsenoside Kết xây dựng phƣơng pháp định lƣợng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 HPTLC * Kết... bảo đảm định tính định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 dược liệu * Kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp định lượng: Bảng 2: Kết xác định khoảng tuyến tính nồng độ diện tích peak GINSENOSIDE