Nghiên cứu này nhằm thẩm định quy trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Các acid amin trong mẫu thử được dẫn xuất bằng AQC (6 - aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển thành các chất có thể phát hiện được bằng đầu dò cực tím (UV), phân tách các dẫn xuất AQC của acid amin bằng phương pháp UPLC, định lượng bằng đầu dò TUV.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG DỊCH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG Lê Duy Cường1, Trần Thị Chi Mai2 Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, 2Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu nhằm thẩm định quy trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự dịch sinh học sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) Các acid amin mẫu thử dẫn xuất AQC (6 - aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển thành chất phát đầu dò cực tím (UV), phân tách dẫn xuất AQC acid amin phương pháp UPLC, định lượng đầu dò TUV Giới hạn định lượng phương pháp µmol/L Khoảng tuyến tính phương pháp từ đến 1000 µmol/L Độ xác ngắn hạn CV ≤ 2,4%, độ xác dài hạn CV ≤ 3% Qui trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự dịch sinh học phương pháp UPLC xác xác thực, sử dụng để phục vụ chẩn đoán theo dõi điều trị rối loạn chuyển hoá bẩm sinh Từ khoá: acid amin, dịch sinh học, sắc ký lỏng siêu hiệu năng, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh I ĐẶT VẤN ĐỀ Định lượng acid amin tự máu thần kinh, bệnh tim mạch, kháng insulin, nước tiểu công cụ quan trọng nghiên cứu sinh lý, dược lý, nuôi cấy tế bào chẩn đoán theo dõi rối loạn chuyển hóa phân tích giá trị dinh dưỡng thực phẩm bẩm sinh Sử dụng phân tích acid amin tự [3; 4; 5] chương trình sàng lọc sơ sinh cho phép chẩn đoán nhanh số rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bệnh phenylceton niệu, MSUD (maple syrup urine disease), số rối loạn chu trình urê, bệnh homocystine niệu [1; 2] Việc theo dõi cẩn thận trì nồng độ acid amin máu mức tối ưu bệnh nhân mang lại lợi ích lâu dài điều trị Bên cạnh ứng dụng đánh giá tình trạng dinh dưỡng bệnh nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, định lượng acid amin tự dịch sinh vật khác áp dụng số nghiên cứu như: tình trạng suy tế bào gan, bệnh lý ung thư, chuyển hóa cơ, rối loạn dẫn truyền Theo báo cáo từ Khoa Nội tiết Rối loạn chuyển hóa Bệnh viện Nhi Trung ương vài năm gần đây, số trẻ mắc bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh với tỷ lệ 1/5000 trẻ sinh ra, tỷ lệ tử vong lên đến 48% Đồng thời việc xét nghiệm chẩn đoán khó khăn, mẫu bệnh phẩm định lượng acid amin tự phải gửi nước dẫn đến kết xét nghiệm chậm Ở Việt Nam, có nhiều bệnh nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh khơng chẩn đốn xác định sớm dẫn đến di chứng nặng nề [1] Trên Thế giới, định lượng acid amin tự máu nước tiểu tiến hành từ năm đầu thập niên 60 kỷ XX [6; 7] Phương Địa liên hệ: Lê Duy Cường, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Email: v.cuongdl@vinmec.com pháp phổ biến sử dụng sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất hậu cột Ngày nhận: 25/7/2016 ninhydrin Đây phương pháp có ưu điểm rẻ Ngày chấp thuận: 18/12/2016 tiền, dễ sử dụng Tuy nhiên, sắc ký trao đổi 62 TCNCYH 102 (4) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ion có nhược điểm thời gian phân tích dài Mẫu thử khử protein dung dịch (120 phút/mẫu) đòi hỏi bảo trì phức tạp acid sulfosalicylic (SSA) 10% chứa nội chuẩn nên kỹ thuật trở nên khơng phù hợp với norvaline 250 µM với thể tích tương đương, ly phòng xét nghiệm [2,8,9] tâm dung dịch thời gian phút tốc độ Trong năm gần đây, phương pháp ứng dụng để thay cho phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng siêu hiệu (Ultraperformance liquid chromatography - UPLC) So với sắc ký trao 13000 vòng/phút, thu dịch tiến hành tạo dẫn xuất theo quy trình nhà sản xuất Phương pháp phân tích acid amin bao gồm giai đoạn sau: (1) Kiềm hoá mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu đổi ion, phương pháp UPLC có ưu vượt trắng (blank) khử tạp SSA trội hiệu rút ngắn thời gian dung dịch NaOH/ borat phân tích [8; 9; 10] Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương trang bị hệ thống (2) Phản ứng tạo dẫn xuất: Dẫn xuất hoá UPLC nhằm phân tích acid amin tự acid amin mẫu thử AQC (6 - dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán, aminoquinolyl sàng lọc, theo dõi điều trị số rối loạn carbamate) để chuyển acid amin bậc chuyển hóa bẩm sinh Để áp dụng thiết bị UPLC vào phân tích acid amin tự do, cần - N - hydroxysuccinimidyl bậc hai thành chất phát đầu dò cực tím (UV) phải đánh giá phương pháp trước đưa vào (3) Phân tách dẫn xuất AQC acid sử dụng Do đó, đề tài tiến hành với amin phương pháp UPLC, định lượng mục tiêu: Thẩm định quy trình định lượng acid đầu dò TUV amin tự máu nước tiểu phương pháp UPLC Thẩm định phương pháp định lượng acid amin tự dịch sinh học II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Trang thiết bị chất liệu nghiên cứu UPLC - Khảo sát độ tuyến tính phương pháp: Nước cất tinh khiết chuẩn nồng độ cao Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) Acquity Waters; Cột sắc ký MassTrak AAA Column, 1,7 µm 150 x 2,1 mm; Chuẩn acid amin Sigma-Aldrich; Thuốc thử MassTrak AAA tạo dẫn xuất acid amin Waters Pha động A: MassTrak AAA Eluent A Concentrate, pha loãng 1:10 (8 - 10% acetonitrile, - 6% formic acid, 84 - 88% ammonium acetate/H2O) Pha động B: MassTrak AAA Eluent B đậm đặc (≥ 95% acetonitrile, ≤ 5% acetic acid) Kỹ thuật định lượng acid amin UPLC TCNCYH 102 (4) - 2016 gần với giá trị dự đốn khoảng phân tích Trộn hai mẫu chuẩn với tỷ lệ thể tích sau: 1/0, 4/1, 3/2, 2/3, 1/4 0/1 Tiến hành phân tích định lượng acid amin mẫu Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần Tính giá trị trung bình thu mẫu Vẽ đồ thị để đánh giá độ tuyến tính phần mềm tích hợp hệ thống UPLC với: trục hoành X nồng độ pha loãng (0%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%), trục tung Y nồng độ trung bình đo nồng độ qua lần Thiết lập phương trình Y = aX + b Tính hệ số tương quan R, R2 ≥ 0,99 chấp nhận 63 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC dải giá trị này, không đạt phải thu hẹp dải nồng độ đạt R ≥ 0,99 - Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) LOQ xác định phân tích bình thường phân tích lần chạy, đo lặp lại 10 lần (n = 10), thu thập liệu đánh giá độ ngắn hạn + Xác định độ xác dài hạn (độ tái chuẩn mức độ lặp): mẫu QC chạy 20 mẻ khác khác lần chạy Pha lỗng dung (n = 20) vòng tháng, dịch chuẩn có nồng độ cao để thu mẻ, mẫu QC đo lặp lại lần, thu thập dung dịch có tỷ lệ pha loãng 2, 4, 8, 16, liệu đánh giá độ xác dài hạn dung dịch acid amin 32, 64 lần Các chuẩn pha loãng chạy + Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn lặp lại lần mẻ phân tích Tính SD (SD) hệ số biến thiên (CV) để đánh giá CV, LOQ giá trị nồng độ thấp mà độ xác ngắn hạn dài hạn Tiêu phương pháp tuyến tính chặt chẽ chuẩn chấp nhận: theo AOAC, độ chấp với R > 0,99, CV ≤ 20% nhận phân tích nồng độ 10-6 - 10-4 - Độ xác phương pháp mol/L CV < 11% độ xác dài + Xác định độ xác ngắn hạn (độ lặp hạn, CV < 5,3% độ xác ngắn lại): mẫu QC tạo từ huyết tương trẻ hạn [3] III KẾT QUẢ Hình Kết phân tích nhiệt độ 430 C Ở nhiệt độ khuyến cáo Waters quy trình chuẩn, hiệu phân tách cặp His + PEA, EA + Asp, Lys + Tyr, Arg + Gly Các cặp His + PEA Lys + Tyr bị lẫn vào Hình Kết phân tích nhiệt độ 41,20 C 64 TCNCYH 102 (4) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Có cải thiện rõ tất cặp peak khó phân tách: His + PEA, Arg + Gly, EA + Asp, Lys + Tyr Hình Sự cải thiện hiệu phân tách thay đổi gradient pha động Khảo sát nhiệt độ 41,20 C, thu cải thiện rõ rệt thời gian lưu xuất cặp peak khó phân tách: His/PEA, Arg/Gly, EA/Asp, Lys/Tyr Bảng So sánh gradient hai phương pháp Gradient tiêu chuẩn (Waters) Gradient cải tiến Thời gian (phút) mL/phút %A %B Curve Thời gian (phút) %A %B Curve 4,5 0,400 98,5 1,5 4,5 98,1 1,9 7,0 0,400 98,0 2,0 7,0 97,5 2,5 8,0 0,400 98,0 2,0 8,0 97,9 2,1 20,0 0,400 88,0 12,0 20,0 87,0 13,0 21,0 0,400 88,0 12,0 21,0 88,0 12,0 Thay đổi tỷ lệ % A/B có ý nghĩa việc thay đổi nhẹ mức pH thời điểm mong muốn, phút 4,5 (His + PEA), (Arg), (Gly) 20 (Lys + Tyr) giảm % A tăng % B làm tăng nhẹ pH hỗn hợp pha di động Phút 21 đặt lại tỷ lệ ban đầu nhằm thiết lập pH trong phương pháp tiêu chuẩn Kết cải thiện sau thay đổi tỷ lệ % A B Bảng Khảo sát độ tuyến tính khoảng - 1000 µmol/L TT Acid amin R R2 TT Acid amin R R2 Ala 0,999810 0,999620 14 Thr 0,999972 0,999944 His 0,998439 0,996881 15 Cyst 0,999885 0,999769 PEA 0,987842 0,975832 16 Phe 0,999079 0,998160 Asn 0,999897 0,999793 17 Orn 0,999777 0,999554 Ser 0,999508 0,999016 18 Lys 0,999516 0,999032 TCNCYH 102 (4) - 2016 65 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TT Acid amin R R2 TT Acid amin R R2 Gln 0,999973 0,999947 19 Tyr 0,999225 0,998451 Carn 0,999709 0,999418 20 Tryp 0,998685 0,997372 Arg 0,999697 0,999394 21 Met 0,999664 0,999329 Gly 0,999800 0,999600 22 Val 0,999994 0,999988 10 EA 0,999218 0,999177 23 Ile 0,999983 0,999966 11 Asp 0,997961 0,995925 24 allo 0,999948 0,999896 12 Glu 0,998928 0,997858 25 Leu 0,999968 0,999936 13 Cit 0,999953 0,999907 26 HCys 0,999813 0,999627 Tất acid amin điển hình có hệ số tương quan R > 0,99 khoảng nồng độ 1000 µmol/L Giới hạn định lượng (LOQ): Trong nghiên cứu này, LOQ acid amin µmol/L Bảng Minh hoạ giới hạn định lượng Valine 66 TCNCYH 102 (4) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC (STD5, STD10… mức nồng độ 5, 10… µmol/L % Deviation: phần trăm độ lệch Trong giới hạn từ - 1000 µmol/L, R R2 valine thỏa mãn thỏa mãn điều kiện > 0,99, đồng thời độ lệch ≤ 8,15% Nồng độ khảo sát mức thấp độ lệch tăng Bảng Độ xác dài hạn (độ lặp lại) Acid amin Ala His PEA Asn Ser Gln Carn Arg Gly EA Asp Glu Cit Thr 216,0 210,5 217,0 220,1 221,9 222,1 223,2 221,8 216,6 215,4 216,9 215,8 221,3 221,6 SD (µmol/L) 2,71 2,13 5,49 3,19 3,19 2,99 3,67 4,16 2,20 3,07 3,01 2,92 2,84 2,80 CV (%) 1,3 1,0 2,5 1,5 1,4 1,3 1,6 1,9 1,0 1,4 1,4 1,4 1,3 1,3 Mean (µmol/L) Acid amin Cyst Phe Orn Lys Tyr Tryp Met Val lle Allo Leu HCys Mean (µmol/L) 226, 220, 218, 214, 229,8 219, 221, 219, 217, 222,0 218,7 225,3 SD (µmol/L) 3,36 3,10 3,64 3,66 4,63 3,55 5,02 2,81 3,31 2,93 2,76 4,03 CV (%) 1,5 1,4 1,7 1,7 2,0 1,6 2,3 1,3 1,5 1,3 1,3 1,8 Độ xác dài hạn tất acid amin có CV < 3,0% Bảng Độ xác ngắn hạn (độ lặp lại) Acid Ala PEA Asn Ser Gln Carn Gly EA Asp Glu Cit Thr 344,2 265,6 56,1 124,6 371,39 8,6 182,9 10,8 12,8 193,3 24,8 98,8 0,08 0,09 0,06 0,07 0,12 0,07 0,51 0,07 0,03 0,06 0,01 0,01 0,02 0,04 0,122 0,06 0,03 0,87 0,28 0,69 0,20 0,03 0,05 0,01 amin Mean (µmol/L) SD CV (%) Acid amin Cyst Phe Orn Lys Tyr Met Val lle Leu Tryp Mean (µmol/L) 6,8 48,6 68,5 188,4 52,2 18,2 208,3 71,3 113,4 41,3 SD 0,04 0,03 0,04 0,15 0,01 0,06 0,02 0,39 0,13 0,37 CV (%) 0,67 0,13 0,07 0,08 0,22 0,36 0,01 0,55 0,11 0,91 Độ xác ngắn hạn acid amin < 1% TCNCYH 102 (4) - 2016 67 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV BÀN LUẬN Khi áp dụng phương pháp UPLC tiêu chuẩn hãng Waters vào điều kiện thực tế, số cặp peak bị chồng His/PEA (phút 4,4 - 5), Arg/Gly (phút - 7,5), EA/Asp (phút 7,5 - 8,0), Lys/Tyr (phút 19 - 21) Vì khơng thể định lượng xác nồng độ acid amin mẫu phân tích Do chúng tơi định cải tiến phương pháp UPLC tiêu chuẩn để nâng cao hiệu suất phân tách Các thông số khảo sát bao gồm: nhiệt độ cột, tỷ lệ phần trăm pha di động A B Kết thu cho thấy, nhiệt độ cách xa 430C hiệu phân tách cặp Lys/Tyr tăng Càng giảm nhiệt độ hiệu phân tách cặp EA/Asp tăng, hiệu phân tách cặp Arg/Gly giảm Cặp His/PEA trở ngại lớn trình khảo sát dù tăng hay giảm nhiệt độ phân tách so với 430C hiệu phân tách khơng cao, chưa thể phân tách hồn tồn Những khó khăn cơng bố tiến hành nghiên cứu mẫu huyết tương [4] Tuy nhiên, nghiên cứu khác hiệu phân tách tối ưu tiến hành phương pháp UPLC tiêu chuẩn (430C) [2] Điều cho thấy, phương pháp tiêu chuẩn nhà sản xuất áp dụng phòng xét nghiệm khác cho kết tối ưu giống nhau, đặc biệt với phương pháp sắc ký Kết khảo sát 5), Arg/Gly(phút - 7,5), EA/Asp (phút 7,5 8,0), Lys/Tyr (phút 19 - 21) Dựa theo điểm đẳng điện (pI- isoelectric point) acid amin: His (7,59), Arg (10,76), Gly (5,97), Lys (9,74), Tyr (5,66) [5], thay đổi tỷ lệ % dung dịch A B thời gian lưu tương ứng với cặp acid amin nêu nhằm nâng cao hiệu phân tách Tại phút 4,5, giảm tỷ lệ % A/B từ 98,5/1,5 98,1/1,9 dẫn đến làm tăng nhẹ pH acid formic dung dịch A mạnh acid acetic dung dịch B Sự thay đổi giúp tăng pH hỗn hợp pha di động phù hợp với pI xu hướng kiềm His Kết thu cải thiện hiệu phân tách cặp His/PEA Tại phút thứ 7, tỷ lệ % A/B từ 98/2 97,5/2,5, gây tăng nhẹ pH phù hợp với pI 10,76 Arg, kết thu cải thiện đáng kể khả phân tách cặp Arg/ Gly Tại phút 8, pI Asp nằm vùng pH thấp nên khôi phục lại tỷ lệ % A/ B gần giống với tỷ lệ chuẩn ban đầu phương pháp Waters tiêu chuẩn - nhằm hạ nhẹ pH Kết thành công phân tách cặp EA/Asp Tại phút 20, pI Lys nằm vùng pH kiềm, nên nâng pH dung dịch rửa giải cách thay đổi tỷ lệ % A/B từ 88/12 87/13, phút 21, pI tyrosin nằm vùng pH acid nên khôi phục lại tỷ lệ % A/B ban đầu: 88/12 Sự thay đổi cải thiện rõ ràng hiệu phân tách cặp Lys/Tyr cho thấy 41,20C, hiệu phân tách tối Trong nghiên cứu acid amin ưu Nhiệt độ gần giống với công bố, gradient giữ nguyên gra- nhiệt độ 410C nghiên cứu khác [4] dient tiêu chuẩn Waters, pH Sau thu nhiệt độ tối ưu, thay đổi tồn q trình phân tách tiến hành khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ % dung dịch B thay đổi từ acid acetic thành pha động A B lên hiệu phân tách acid formic kết thu cải thiện Khảo sát tập trung cặp peak có hiệu tách cặp Lys/ Tyr làm giảm hiệu phân tách thấp: His/PEA (phút 4,4 - độ lệch qua lần chạy lặp lại [4] 68 TCNCYH 102 (4) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Sau thay đổi phương pháp so với phương pháp tiêu chuẩn, thực nghiệm độ tuyến tính sử dụng phương pháp UPLC - MS/MS cao [6] đánh giá tiến hành bao gồm: khoảng Trong nghiên cứu chúng tơi, giới hạn tuyến tính, giới hạn định lượng, độ xác định lượng (LOQ) µmol/L, LOQ nghiên cứu công bố trước Trong dải - 1000 µmol/L chưa thu hệ số R2 > 0,99 tất acid amin mong muốn Tiến hành thu hẹp dải phân µmol/L [2; 4], so với nghiên cứu LOQ nghiên cứu cao Nồng độ hệ số R > 0,99 hầu hết acid amin, acid amin máu nước tiểu dải tuyến tính chúng tơi bao gồm giá trị có ngoại trừ phosphoethanolamine (PEA) Với R2 tính định lâm sàng, giới hạn tuyến > 0,97- xem có tương quan tuyến tính đảm bảo để phát rối loạn chuyển hóa bẩm sinh Độ xác tích - 1000 µmol/L, chúng tơi thu tính chặt chẽ, với R > 0,99, xem tiệm cận giá trị Do nói độ tuyến tính phương pháp UPLC phương pháp thể qua độ lệch chuẩn hệ số biến thiên (CV) Kết phương pháp sắc ký đại So sánh giá trị nghiên cứu thỏa mãn tiêu chuẩn AOAC với CV độ xác ngắn hạn < 5,3% R nghiên cứu với tác CV độ xác dài hạn < 11% mức giả khác thấy rằng, thiết kế nồng độ 10-6 - 10-4 µmol/L [3; 7] Hệ số biến thiên nghiên cứu cao, ưu điểm chung cho nghiên cứu định lượng acid amin UPLC khoảng từ 0,8658 - 0,9932 với nhiệt độ tương đồng với nghiên cứu khác tác giả: CV < 5% [4], CV 0,9 - 2,9% [8], CV 1,8 gradient chuẩn [2] Trong nghiên cứu - 4,9% [9]) CV ≤ 6% [6], CV < 4% [10] tác giả khác R nằm khoảng 0,85 - 0,99 V KẾT LUẬN - TUV, tác giả khác công bố hệ số R (ngoại trừ với methionine, R = 1) Trong đó, 0,85 < R < 0,9 acid amin: Glutamate, proline, citrulline, valine) [4] Hệ số R Phương pháp cải tiến định lượng acid amin dịch sinh học UPLC có: nghiên cứu lớn hơn, có khác biệt Khoảng tuyến tính acid amin cách lấy giá trị khoảng tuyến - 1000 µmol/L Độ xác ngắn hạn CV < tính Nghiên cứu giới hạn tuyến tính 5- 1%, độ xác dài hạn CV < 3% 1000 µmol/L, nghiên cứu tác Lời cảm ơn giả khác - 3500 µmol/L - 2000 µmol/L [2; 4] Khoảng tuyến tính rộng độ lệch Nhóm nghiên cứu xin bày tỏ lời cảm ơn chuẩn cao, điều giải thích R sâu sắc tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi Trung lại giảm Cùng với đó, dung dịch chuẩn ương hỗ trợ kinh phí cho việc thực với nồng độ thấp mẫu (matrix) nghiên cứu bị thay đổi so với dung dịch chuẩn gốc (stock) bị pha loãng với tỷ lệ lớn Nghiên TÀI LIỆU THAM KHẢO MS, R2 > 0,99 (R > 0,999) tất Hồng Hạnh Phúc (2008) Chẩn đốn bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh kỹ thuật sắc ký khí khối phổ Tạp chí nghiên cứu acid amin, với LOQ ≤ 10 µmol/L Như vậy, y học, 57(4), - cứu định lượng acid amin dịch thể năm (2009) với phương pháp UPLC - MS/ TCNCYH 102 (4) - 2016 69 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Narayan S B (2011) Measurement of plasma amino acids by Ultraperformance(R) Liquid Chromatography Clin Chem Lab Med, Thực Phẩm Quốc Gia (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi 49(7),1177 - 1185 AOAC International methods commit- sinh vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội, 11 - 47 tee (2012) Guidelines for Standard Method Performance Requirements J AOAC Int, Appendix F, Fiechter, G and H.K Mayer (2011) Characterization of amino acid profiles of cul- Peake, R.W (2013) Improved separation and analysis of plasma amino acids by hydroxysuccinimidyl carbamate derivatization modification of the MassTrak AAA Solution Ultraperformance(R) liquid chromatography method Clin Chim Acta, 423, 75 - 82 Chauhan, B.S (2008) Principles of Bio- Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh ture media via pre-column 6-aminoquinolyl-Nand ultra performance liquid chromatography J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 879(17-18), 1353 - 1360 chemistry and Biophysics Laxmi Publications Terrlink, T., P.A van Leeuwen, and A Houdijk (1994) Plasma amino acids determined by liquid chromatography within 17 min- Pvt Limited, 150 - 151 Waterval W A (2009) Quantitative UPLC-MS/MS analysis of underivatised amino acids in body fluids is a reliable tool for the utes Clin Chem, 40(2), 245 - 249 10 Fekkes, D (1995) Validation of the determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography using diagnosis and follow-up of patients with inborn errors of metabolism Clin Chim Acta, 407(1- automated pre-column derivatization with o - phthaldialdehyde J Chromatogr B Biomed 2), 36 - 42 Appl, 669(2), 177 - 186 Summarry MEASUREMENT OF AMINO ACIDS IN BIOLOGICAL SAMPLES BY ULTRAPERFORMANCE CHROMATOGRAPHY (UPLC) The aim of this study was to validate the modified method for quantitation of free amino acids by UPLC The amino acids in samples were derivatized by AQC (6 - aminoquinolyl - Nhydroxysuccinimidyl carbamate), separated by UPLC method and quantified by TUV detector The limit of quantitation was µmol/L for all amino acids The linearity range was to 1000 µmol/L The short - term precision was ≤ 2.4%, the long-term precision was ≤ 3% The proposed method for quantitation of free amino acids in biological fluid using UPLC was precise and accurate This method could be applied to the routine diagnosis and treatment monitoring of inborn error of metabolism Key words: amino acids, physiolosical samples, UPLC, inborn error of metabolism 70 TCNCYH 102 (4) - 2016 ... với amin phương pháp UPLC, định lượng mục tiêu: Thẩm định quy trình định lượng acid đầu dò TUV amin tự máu nước tiểu phương pháp UPLC Thẩm định phương pháp định lượng acid amin tự dịch sinh học. .. dung dịch thời gian phút tốc độ Trong năm gần đây, phương pháp ứng dụng để thay cho phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng siêu hiệu (Ultraperformance liquid chromatography - UPLC) So với sắc. .. chuyển hóa bẩm sinh kỹ thuật sắc ký khí khối phổ Tạp chí nghiên cứu acid amin, với LOQ ≤ 10 µmol/L Như vậy, y học, 57(4), - cứu định lượng acid amin dịch thể năm (2009) với phương pháp UPLC - MS/