Xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Nội dung bài viết trình bày về việc nghiên cứu xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 TRONG SÂM NGỌC LINH TỰ NHIÊN VÀ SINH KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO Trần Quang Trung*; Phan Thị Thu Hằng*; Nguyễn Văn Bạch* TÓM TẮT Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) để định lượng ginsenoside (Rb1, Re Rg1) sâm Ngọc Linh sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, kết cho thấy: + Hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh là: 1,0916%, 0,1226% 1,4215% + Hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh là: 0,3281%, 0,0817% 0,3646% Như vậy, tổng hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh gấp 3,4 lần tổng hàm lượng ginsenoside sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh * Từ khoá: Sâm Ngọc Linh; Sắc ký lớp mỏng hiệu cao DETERMINATION OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 IN NATURAL NGOCLINH GINSENG AND ITS PLANT CELL BY HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY SUMMARY Applying the method to quantifying ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in natural Ngọclinh ginseng and its plant cell, the result showed that: - The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of natural Ngọclinh ginseng was 1.0916% 0.1226% and 1.4215%, respectively - The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of Ngọclinh ginseng’s plant cell was 0.3281%, 0.0817% and 0.3646%, respectively The data indicated that total quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in 100 grams of natural Ngọclinh ginseng was 3.4 times as much as its total quantity in 100 grams of Ngọclinh ginseng’s plant cell * Key words: Ngoclinh ginseng, High performance thin layer chromatography * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung (tranquangtrunghvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 26/12/2012; Ngày phản biện đánh giá báo: 16/10/2013 Ngày báo đăng: 19/11/2013 25 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Ngọc Linh dược liệu quý sinh trưởng núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Quảng Nam Kon Tum [2] Ngoài ra, từ sâm Ngọc Linh tự nhiên, Học viện Quân y nghiên cứu, sản xuất thành công sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Ginsenoside Rb1, Re, Rg1 hoạt chất thuộc nhóm dammaran có sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Để tiêu chuẩn hoá chất lượng nguyên liệu thành phẩm từ sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu * Nguyên liệu, dung mơi, hố chất: - Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên 10 năm tuổi (đã Viện Dược liệu - Bộ Y tế thẩm định) - Sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh (do Trung tâm Nghiên cứu Y học quân sự, Học viện Quân y cung cấp) - Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 loại SH (Hãng Chromadex, Mỹ) - Các dung mơi, hố chất: đạt tiêu chuẩn PA Linh, việc xác định hàm lượng hoạt * Dụng cụ trang thiết bị: chất việc làm cần thiết - Hệ thống HPTLC Hãng DESAGA Hiện nay, số dược điển ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để - Bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x 10 cm; 20 x 20 cm định lượng chất phân tích định - Micropipet l; pipet tự động - lượng [3] Tuy nhiên Việt Nam, chưa có đề tài áp dụng phương pháp HPTLC để xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc linh Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh phương pháp HPTLC 10 l, - 20 l, 100 l, 200 l, 500 l - Cột chiết pha rắn C18 - Máy lắc siêu âm Soniclean Australia - Máy ly tâm - Cân phân tích Mettler có độ xác 0,1 mg - Dụng cụ chiết Soxhlet - Các loại dụng cụ thuỷ tinh có độ xác thích hợp 26 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Phƣơng pháp nghiên cứu * Xây dựng đường chuẩn gensenosid Rb1, Re, Rg1: Từ chất chuẩn, pha dãy dung dịch Rb1, Re, Rg1 có nồng độ khoảng 50, 150, 250, 350 450 mcg/ml Tiến hành HPTLC theo điều kiện Trần Quang Trung CS xây dựng [4] * Chiết xuất saponin toàn phần mẫu thử: Cân xác gam bột sâm Ngọc Linh (hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh) cho vào bình nón dung tích 100 ml, gắn với phận hồi lưu Thêm xác 50 ml methanol Cân khối lượng bình nón chứa mẫu (bao gồm nắp) khối lượng m1 Đun hồi lưu cách thủy (tính từ lúc sơi) Để nguội bình nón cân lại khối lượng bình nón (gồm nắp) khối lượng m2 Nếu m2 < m1, thêm methanol vào bình nón sau đun hồi lưu đạt đến khối lượng m1 ban đầu Ly tâm với tốc độ 2.500 vòng/phút 10 phút Hút xác 25 ml dịch sau ly tâm Cơ khơ cách thủy Hồ tan cắn ml nước cất Sau đó, ứng dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu [1] Cụ thể: cho dịch qua cột chiết pha rắn (C18, 360 mg) hoạt hoá ml methanol, ml methanol 50%, ml H2O cất Rửa cột chứa mẫu với 20 ml nước, 10 ml methanol 30% với tốc độ 20 - 25 giọt/phút Bỏ dịch rửa Rửa giải 40 ml methanol Lấy dịch rửa giải cô tới khô cách thuỷ Hoà tan cắn 10 ml ethanol đem chấm sắc ký * Phương pháp xử lý mẫu: - Mẫu thử: + Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên rửa sạch, thái lát mỏng sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, sấy khô 600C 20 Nghiền thành bột + Cân xác gam bột, chiết theo quy trình thu dịch ethanol chấm sắc ký - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: + Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch có ginsenoside Rb1 nồng độ 51,1875 mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ 20,0625 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng độ 51,475 mcg/ml + Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch có ginsenoside Rb1 nồng độ 150,9375 mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ 40,125 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng độ 200,575 mcg/ml + Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch ginsenoside Rb nồng độ 250,6875 mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ 60,1875 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng độ 351,45 mcg/ml + Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch ginsenoside Rb1 nồng độ 350,4375 mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ 80,25 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng độ 500,55 mcg/ml 27 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 + Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch ginsenoside Rb nồng độ 450,1875 mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ 100,3125 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng độ 651,425 mcg/ml * Định lượng mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên mẫu thử sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh: - Dung dịch thử: dịch chiết saponin toàn phần mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 ethanol Chấm 20 l dung dịch thử dung dịch chuẩn hỗn hợp lên mỏng HPTLC tiến hành sắc ký với điều kiện sau: - Máy HPTLC (Hãng DESAGA) - Pha động: chloroform/AcOEt/MeOH/ H2O (15/40/22/10) - Bản mỏng HPTLC 20 x 10 cm hoạt hóa 1000C 30 phút - Thuốc thử màu: dung dịch H2SO4 10% ethanol Tiến hành định lượng cách dựa vào đường chuẩn Diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn thực điều kiện sắc ký Từ đó, tính hàm lượng (%) ginsenoside Rb1, Re, Rg1 mẫu sâm Ngọc linh tự nhiên mẫu sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh theo cơng thức sau: Trong đó: Ct: nồng độ (mcg/ml) ginsenoside Rb1 (hoặc Re, Rg1) tương ứng với diện tích pic thu từ phổ đồ thơng qua đường chuẩn m: khối lượng (g) sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh k: hệ số pha loãng dung dịch thử KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết xây dựng đƣờng chuẩn Rb1, Re, Rg1 Nồng độ (mcg/ml) Hình 1: Đường chuẩn ginsenoside Rb1 28 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Nồng độ (mcg/ml) Hình 2: Đường chuẩn ginsenoside Re Nồng độ (mcg/ml) Hình 3: Đường chuẩn ginsenoside Rg1 Trong khoảng nồng độ khảo sát (50 - 450 mcg/ml) có tương quan tuyến tính nồng độ nồng độ ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích pic r  Các đường chuẩn sử dụng để định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Kết xác định Rb1, Re, Rg1 mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên mẫu thử sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh phƣơng pháp HPTLC * Tạo mẫu thử: - Mẫu thử 1: cân xác gam bột sâm Ngọc Linh tự nhiên, chiết xuất theo quy trình trên, thu dịch ethanol saponin toàn phần sâm Ngọc Linh tự nhiên chấm sắc ký 29 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 - Mẫu thử 2: cân xác gam bột sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, chiết xuất theo quy trình trên, thu dịch ethanol saponin tồn phần sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh chấm sắc ký * Tiến hành định lượng: - Chuẩn bị mỏng HPTLC có kích thước 10 x 10 cm - Sấy mỏng nhiệt độ 1000C 30 phút - Chấm mẫu thử dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với thể tích 20 l lên mỏng sấy - Triển khai sắc ký với hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O (15/40/22/10) - Sấy khô mỏng triển khai xong thiết bị sấy chuyên dụng - Phun thuốc thử màu dung dịch H2SO4 10% ethanol - Ghi phổ máy HPTLC Tính diện tích pic Từ diện tích pic thu phương trình hồi quy tuyến tính, tính hàm lượng ginsenoside Rb1, Re Rg1 Bảng 1: Hàm lượng ginsenoside mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên (n = 5) STT CÁC GINSENOSIDE HÀM (%) Ginsenoside Rb1 1,0916 ± 0,069 Ginsenoside Rg1 1,4215 ± 0,075 Ginsenoside Re 0,1226 ± 0,007 Tổng LƯỢNG 2,6357 ± 0,2975 Bảng 2: Hàm lượng ginsenoside mẫu sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh STT CÁC GINSENOSIDE HÀM (%) Ginsenoside Rb1 0,3281 ± 0,0197 Ginsenoside Rg1 0,3646 ± 0,0243 Ginsenoside Re 0,0817 ± 0,0073 Tổng LƯỢNG 0,7744 ± 0,062 Tổng hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 100 g sâm Ngọc Linh 2,6357% Trong đó, hàm lượng ginsenoside sinh khối tế bào sâm Ngoc Linh 0,7744% Như vậy, hàm lượng ginsenoside sâm Ngọc Linh tự nhiên gấp 3,4 lần so với sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, rút số kết luận sau: - Hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên là: 1,0916%, 0,1226% 1,4215% - Hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh là: 0,3281, 0,0817% 0,3646% - Tổng hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên gấp 3,4 lần tổng hàm lượng ginsenoside sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh 30 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Tử An (Bộ mơn Hố phân tích độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội) Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm thuốc độc chất 2002, tr.33-39 tr.76-83 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 2007, tr.69-267 Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Văn Bạch Nghiên cứu định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao Tạp chí Y - Dược học Quân 2013, tập 38, số 1, tr.13-18 Pharmacopoeia of the Peoples’s Republic of China English Edition, Vol I Chemical Industry Press, 2005, pp.205-207, pp.223-225 Appendix VI, A, pp.38-40 31 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 32 ... Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc linh Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh phương pháp. .. ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích pic r  Các đường chuẩn sử dụng để định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Kết xác định Rb1, Re, Rg1. .. lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sâm Ngọc Linh tự nhiên là: 1,0916%, 0,1226% 1,4215% - Hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh là: 0,3281, 0,0817% 0,3646% - Tổng hàm lượng