Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dpph và xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic a trong bào tử nấm linh chi (ganoderma lucidum spore)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  PHAN THÀNH TRÍ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore) LUẬN VĂN CAO HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã ngành: 8720210 Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  PHAN THÀNH TRÍ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore) LUẬN VĂN CAO HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã ngành: 8720210 Thầy hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người cam đoan Phan Thành Trí i Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học - Khóa: 2017 -2019 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore ) Học viên: Phan Thành Trí Thầy hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy Mở đầu: Hiện bào tử nấm Linh chi sử dụng ngày nhiều, với mong muốn góp phần vào việc kiểm tra chất lượng nghiên cứu thêm số hoạt tính sinh học cao chiết từ bào tử, đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A, xây dựng số tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ bào tử Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng: acid ganoderic A cao chiết từ bào tử nấm Linh chi Phương pháp nghiên cứu: Acid ganoderic A định lượng phương pháp HPLC với kỹ thuật rửa giải đẳng dòng Xây dựng đề xuất số tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi dựa vào chuyên luận Dược điển Việt Nam V Khảo sát hoạt tính chống oxy với thuốc thử DPPH cao chiết từ bào tử Kết quả: Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (5,0 – 60,0 ppm, R ≥ 0,995), độ xác (RSD ≤ 2,0 %), độ (98,07 – 104,5 %) Xây dựng số tiêu kiểm nghiệm cảm quan; khối lượng làm khơ; độ tro; định tính; định lượng acid ganoderic A Phân đoạn cao chiết aceton có khả chống oxy hóa mạnh IC50 335,7 ppm Kết luận: Xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A đề xuất số tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa với thuốc thử DPPH cho thấy phân đoạn cao chiết aceton cho khả chống oxy hóa mạnh (kém vitamin C 19,8 lần) Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019 INVESTIGATE ANTIOXIDANT ACTIVITY DPPH AND DEVELOPING A QUANTITATIVE PROCESS OF GANODERIC A ACID IN SPORE OF GANODERMA LUCIDUM Phan Thanh Tri Supervisor: PhD Nguyen Huu Lac Thuy Introduction: Currently, spore of Ganoderma lucidum are being used more and more, with the desire to contribute to the quality control and study some more biological activities of spore extract, the thesis also developed a quantitative process of ganoderic A acid, develop some criteria for testing spore of Ganoderama lucidum and investigate antioxidant activity extracted from spores Matericals and Methods: Materical: ganoderic A acid and extracts from spore of Ganoderma lucidum Method: ganoderic A acid is quantified by HPLC with isocratic elution technique, some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed based on monographs in Vietnamese Pharmacopoeia V The antioxidant activity of spore of Ganoderma lucidum were investigated in vitro by 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay Results: The method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity (5.0 – 60.0 ppm, R ≥ 0.995), precision (RSD ≤ 2,0 %), and accuracy (recovery: 98.07 – 104.5 %) some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed: description, loss on drying, total ash, determination, assay of ganoderic A acid Acetone extract showed the highest antioxidant activity (IC50 = 335.7 ppm) Conclusion: The quantitative process of ganoderic A acid and some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed The results of investigation of antioxidant activity showed that acetone extract has highest activity (below than Vitamin C 19.8 times) MỤC LỤC MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI 1.2 TỔNG QUAN VỀ BÀO TỬ NẤM LINH CHI 1.3 TỔNG QUAN VỀ ACID GANODERIC A 12 1.4 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GAA TRONG BTNLC – DỰ THẢO QUY TRÌNH 29 i 3.2 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG GAA TRONG MỘT SỐ MẪU BTNLC 43 3.3 XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM BTNLC 45 3.4 DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM BTNLC 47 3.5 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA VỚI THUỐC THỬ DPPH CỦA CAO CHIẾT TỪ BTNLC 50 3.6 BÀN LUẬN 59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .62 4.1 KẾT LUẬN 62 4.2 ĐỀ NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC i Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu chữ viết tắt Từ nguyên Tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitrile BTNLC Bào tử nấm Linh chi DC Dịch chiết DM Dung môi DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl GAA Ganoderic acid A HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IC50 Nồng độ ức chế 50% N Số đĩa lý thuyết PDA Photodiode array PĐ Dãy điod quang Phân đoạn Rt Retention time Thời gian lưu Diện tích pic S SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét SKĐ Sắc ký đồ TP Toàn phần Ultraviolet – Visible UV-Vis Quang phổ tử ngoại – khả kiến ii Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục bảng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng, điều trị số hoạt chất nấm Linh chi .5 Bảng 1.2 Hàm lượng % hoạt chất thể bào tử Linh chi Bảng 1.3 Các nghiên cứu phân lập polysaccharid từ bào tử .9 Bảng 2.4 Pha dãy dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính .24 Bảng 2.5 Dãy dung dịch thử để xác định IC50 cao BTNLC 28 Bảng 3.6 So sánh lượng GAA chiết từ mẫu bào tử 31 Bảng 3.7 Kết khảo sát dung môi chiết GAA 32 Bảng 3.8 So sánh GAA chiết phương pháp siêu âm đun hồi lưu .33 Bảng 3.9 So sánh GAA chiết khoảng thời gian khác 33 Bảng 3.10 Các thông số sắc ký điều kiện pH khác 34 Bảng 3.11 Kết đánh giá tính tương thích hệ thống 38 Bảng 3.12 Kết khoảng tuyến tính .41 Bảng 3.13 Kết độ xác xác trung gian .42 Bảng 3.14 Kết độ 43 Bảng 3.15 Kết định lượng GAA số mẫu BTNLC 43 Bảng 3.16 Kết tiêu khối lượng làm khô 45 Bảng 3.17 Kết tiêu tro toàn phần 45 Bảng 3.18 Kết tiêu chất chiết dược liệu 46 Bảng 3.19 Kết định lượng GAA lô khác 47 Bảng 3.20 Hiệu suất chiết cao toàn phần, cao phân đoạn từ bào tử Linh chi 51 Bảng 3.21 Kết khảo sát độ ổn định dung dịch DPPH 51 Bảng 3.22 Kết xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 vitamin C 52 Bảng 3.23 Kết xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 cao TP cồn 96 % 53 Bảng 3.24 Kết xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 cao TP methanol 54 x Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục bảng Bảng 3.25 Kết xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 cao PĐ n-hexan 55 Bảng 3.26 Kết đường tuyến tính xác định IC50 cao PĐ cloroform 55 Bảng 3.27 Kết đường tuyến tính xác định IC50 cao PĐ aceton 56 Bảng 3.28 Kết xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 cao PĐ methanol 57 Bảng 3.29 So sánh IC50 vitamin C loại cao 58 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 24 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 25 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 26 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 27 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 28 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC 5: SKĐ PHẦN ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GAA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 29 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 30 Luận văn Thạc sĩ Dược học PHỤ LỤC 6: SKĐ PHẦN TIÊU CHUẨN HĨA Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 31 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 32 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 33 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC 7: ĐÁNH GIÁ HỆ SỐ A VÀ B (PHẦN ĐỘ TUYẾN TÍNH) SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.999786528 R Square Adjusted R Square 0.999573101 Standard Error 46699.70421 0.999466376 Observations ANOVA df SS MS F Significance F 9365.89626 6.8351E-08 P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Regression 2.04257E+13 2.04257E+13 Residual 8723449491 2180862373 Total 2.04345E+13 Coefficients Intercept X Variable Standard Error t Stat -36460.2936 34268.36872 -1.0639635 0.34731012 -131604.54 58683.951 131604.538 58683.951 101042.878 1044.073412 96.7775607 6.8351E-08 98144.0655 103941.69 98144.0655 103941.691 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 34 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC 8: DỮ LIỆU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CAO BTNLC Phụ lục 8.1: Phổ UV dung dịch DPPH Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 35 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 8.2: Khảo sát độ ổn định dung dịch DPPH Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 36 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 8.3: Xác định IC50 Vitamin C Phụ lục 8.4: Xác định IC50 cao toàn phần methanol, ethanol Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 37 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục 8.5: Xác định IC50 cao phân đoạn n-hexan; cloroform; aceton; methanol Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 38 Luận văn Thạc sĩ Dược học Phụ lục PHỤ LỤC 9: ĐÁNH GIÁ Ý NGHĨA HỆ SỐ A VÀ B (PHẦN XÁC ĐỊNH IC50 CỦA VITAMIN C) SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R R Square Adjusted Square Standard Error 0.99923 0.99845 R 0.99814 1.10872 Observations ANOVA df SS MS Regression 3964.777 3964.78 Residual 6.146332 1.22927 Total 3970.923 Coefficients Standard Error t Stat F 3225.3 P-value Significance F 3.2E-08 Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 2.396062724 0.57974 4.13299 0.0091 0.905793 3.8863 0.9058 3.88633 X Variable 2.807570986 0.049436 56.7919 3E-08 2.680491 2.9347 2.6805 2.93465 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... h? ?a cao acid ganoderic γ, acid ganoderic δ, acid ganoderic ε, acid ganoderic ξ, acid ganoderic θ, acid ganoderic η với acid ganolucidic D acid ganoderic C2 phân lập từ bào tử Linh chi [25] Triterpenoid... ganoderic A bào tử nấm Linh chi? ?? với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A từ bào tử nấm Linh chi phương pháp HPLC Tiêu chuẩn h? ?a bào tử nấm Linh chi Thử nghiệm hoạt tính. .. dược học - Kh? ?a: 2017 -2019 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY H? ?A DPPH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore ) Học viên: Phan Thành Trí