KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANGKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG TRỒNG TẠI AN GIANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC

MÃ SỐ: 52720401

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG

(Polyscias fruticosa (L.) Harms)

TRỒNG TẠI AN GIANG

LỚP: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC

MÃ SỐ: 52720401

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG

(Polyscias fruticosa (L.) Harms)

TRỒNG TẠI AN GIANG

LỚP: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

LỜI CÁM ƠN

Để có thể hoàn thành khoá luận này, trong thời gian nghiên cứu tại bộ môn Dược liệu trường Đại học Tây Đô, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình

Với lòng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn đầu tiên em muốn gửi đến thầy PGS.TS

Trần Công Luận, Ths Đỗ Văn Mãi, hai Thầy đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, chỉnh

sửa và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô của bộ môn Dược liệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện khoá luận này

Em xin gửi đến toàn thể thầy cô Khoa Dược- Điều dưỡng, trường đại học Tây Đô lời cám ơn sâu sắc, trong suốt 5 năm tại giảng đường các thầy cô đã không ngừng truyền đạt những kiến thức, kỹ năng có được để em trưởng thành hơn

Ngoài ra, không thể không kể đến những người bạn của em, cám ơn các bạn đã ở bên cạnh em, cùng em vượt qua các khó khăn và làm cho khoảng thời gian làm khóa luận của em trở nên ý nghĩa và khó quên

Và cuối cùng, em muốn dành lời cám ơn chân thành nhất cho gia đình, gia đình

là nguồn động lực để em cố gắng học tập, luôn bên cạnh em lúc em gặp khó khăn, luôn tạo điều kiện để em có thể hoàn thành chương trình đại học

Xin chân thành cám ơn mọi người

Cần Thơ, ngày 01 tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Đặng Kim Thoa

ii

LỜI CAM KẾT

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên

Đặng Kim Thoa

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Khóa học: 2012 – 2017

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CÂY ĐINH LĂNG

(Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG

TÓM TẮT

Mở đầu và đặt vấn đề

Trong y học cổ truyền, cây Đinh lăng từ lâu đã được sử dụng phổ biến với công dụng nổi bật là bổ dưỡng Ngày nay, Đinh lăng còn được chứng minh với nhiều công dụng như: Kháng viêm, chống trầm cảm, lợi tiểu, ức chế enzym Ở Việt Nam, Đinh lăng được trồng phổ biến, là nguồn cung cấp nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe con người Đề tài này góp phần khảo sát về hoạt tính chống oxy hóa và sơ bộ thành phần hóa học của rễ cây Đinh lăng

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Dược liệu là Đinh lăng được thu hái ở huyện Tri Tôn, An Giang vào tháng 11/2016 Sau khi mô tả hình thái và khảo sát vi phẫu dược liệu, rễ Đinh lăng được phơi khô và xay thành bột Từ 9,3 kg rễ Đinh lăng được chiết ngấm kiệt với cồn 96 %, thu cao cồn (cao toàn phần) Cao cồn được hòa với một lượng nước tối thiểu sau đó lắc phân bố

tuần tự với diethyl ether, ethyl acettat, n - butanol, cô thu hồi dung môi thu các cao

phân đoạn tương ứng Tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng thử nghiệm sử dụng DPPH, chọn ra phân đoạn cho HTCO cao nhất đem đi phân tích sơ bộ thành phần hóa học và phân lập bằng SKC cổ điển nhằm tạo ra những phân đoạn có thành phần đơn giản hơn, phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo sau này

Kết quả và bàn luận

Từ 9,3 kg bột rễ Đinh lăng, sau khi chiết và lắc phân bố thu được: 300 g cao Et2O,

30 cao EA, 405 g cao n-BuOH, 800 g cao nước Tiến hành khảo sát hoạt tính chống

oxy hóa của các cao phân đoạn cho kết quả cao EA có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất (HTCO = 67,82 %, IC50 = 758,55 µg/ml) Phân tích sơ bộ thành phần hóa học thấy rằng cao EA có chứa: Alkaloid, flavonoid, anthocyanoid, proanthocyanidin, saponin, acid hữu cơ, chất khử Bước đầu phân lập 10 g cao EA bằng SKC cổ điển thu được: 5 phân đoạn từ I → V (có thành phần đơn giản hơn) với khối lượng lần lượt là: 1,5311 g, 1,2835 g, 0,5612 g, 0,5824 g, 0,1889 g

iv

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH- SƠ ĐỒ vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 CÂY ĐINH LĂNG 2

2.1.1 Vị trí phân loại 2

2.1.2 Đặc điểm thực vật họ Nhân sâm 2

2.1.3 Đặc điểm thực vật chi Polyscias 3

2.1.4 Đặc điểm thực vật cây Đinh lăng 3

2.1.5 Thành phần hóa học 5

2.1.6 Tác dụng dược lý và công dụng 15

2.1.7 Một số bài thuốc có Đinh lăng 17

2.1.8 Một số chế phẩm từ Đinh Lăng 20

2.2 GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 21

2.2.1 Khái niệm gốc tự do 21

2.2.2 Tác động của gốc tự do và sự liên quan đến bệnh tật con người 21

2.2.3 Chất chống oxy hóa 22

2.2.4 Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro 22

2.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP 25

2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng 25

2.3.2 Kỹ Thuật chiết rắn – lỏng 26

2.3.3 Một số phương pháp phân lập hợp chất hữu cơ 29

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31

3.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31

3.2.1 Dung môi, hóa chất 31

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ 31

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.3.1 Khảo sát đặc điểm thực vật học 32

3.3.2 Thử tinh khiết 32

3.3.3 Nghiên cứu hóa học 33

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

4.1 THỰC VẬT HỌC 39

4.1.1 Đặc điểm hình thái 39

4.1.2 Đặc điểm vi phẫu rễ 43

4.1.3 Đặc điểm bột rễ Đinh lăng 45

4.2 THỬ TINH KHIẾT 46

4.2.1 Độ ẩm 46

4.2.2 Xác định độ tro 46

4.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 47

4.3.1 Chiết xuất và điều chế cao phân đoạn 47

4.3.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn 48

4.3.3 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trên cao ethyl acetat 53

4.3.4 Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetat 54

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

5.1 KẾT LUẬN 57

5.2 KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Phản ứng thử nghiệm DPPH 36

Bảng 4.1 Kết quả thử tinh khiết bột rễ Đinh lăng 47

Bảng 4.2 Kết quả xác định độ ẩm của các cao phân đoạn 48

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát HTCO của 5 cao, ở nồng độ 1000 µg /ml 50

Bảng 4.4 Kết quả đo OD của cao EA ở 5 nồng độ 50

Bảng 4.5 Kết quả đo OD của Vitamin C ở 5 nồng độ 51

Bảng 4.6 Kết quả xác định giá trị IC50 của cao EA và vitamin C 52

Bảng 4.7 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cao ethyl acetat 53

Bảng 4.8 Kết quả SKC trên cao EA (10 g) 56

DANH MỤC HÌNH ẢNH- SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí phân loại của Polyscias fruticosa (L.) Harms 2

Hình 2.2 Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 7

Hình 2.3 Một số chế phẩm từ Đinh lăng 20

Hình 2.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 23

Hình 2.5 Phản ứng trong phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA 23

Hình 2.6 Phản ứng FRAP 25

Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các loại cao bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 34

Hình 4.1 Cây Đinh lăng 39

Hình 4.2 Lá Đinh lăng 40

Hình 4.3 Hoa Đinh lăng 41

Hình 4.4 Quả Đinh lăng 42

Hình 4.5 Rễ Đinh lăng 42

Hình 4.6 Vi phẫu rễ Đinh lăng 44

Hình 4.7 Bột rễ Đinh lăng 45

Hình 4.8 Soi bột rễ Đinh Lăng 46

Hình 4.9 Sơ đồ chiết và tách phân đoạn từ rễ Đinh lăng 48

Hình 4.10 Sắc kí đồ các phân đoạn trong khảo sát HTCO 49

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ cao EA 51

Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa HTCO và nồng độ của vitamin C 52

Hình 4.13 Biểu đồ so sánh khả năng chống oxy hóa của cao EA với vitamin C 53

Hình 4.14 Sắc kí đồ thăm dò hệ dung môi cho cao EA 55

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Việt Nam vốn có nền văn hóa phương Đông nên việc sử dụng cây cỏ, dược liệu

để làm thuốc phục vụ sức khỏe trở nên quen thuộc, phổ biến; lại thêm có khí hậu nóng

ẩm, nhiều mưa, là điều kiện thuận lợi để thực vật phát triển phong phú đa dạng, tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dạo có thể nói là vô tận để phát triển các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên mang lại lợi ích sức khỏe cho con người

Ngày nay, xã hội phát triển hiện đại thì cũng phát sinh nhiều yếu tố mới như: Môi trường ô nhiễm, chất phụ gia trong thức ăn, các chất có hại trong mỹ phẩm, thuốc lá, rượu bia, thức ăn nhanh hay căng thẳng thần kinh (stress)… Đây là những tác nhân chính gây ra gốc tự do Theo thời gian gốc tự do không ngừng sản sinh và gây hại trong khi hệ thống phòng vệ của cơ thể lại từng bước suy yếu dần Gốc tự do được xem là “ sát thủ giấu mặt ” gây ra quá trình lão hóa và phần lớn các bệnh tật nguy hiểm như: Trầm cảm, tăng huyết áp, ung thư, đái tháo đường, sa sút trí tuệ, Alzheimer

(Viện dược liệu, 2006 ; Lại Thị Ngọc Hà và cs, 2009) Vậy nên, để bảo vệ sức khỏe,

bên cạnh việc hạn chế các yếu tố làm tăng sinh gốc tự do cần phải bổ sung các chất chống gốc tự do cho cơ thể Việc sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên để trung hòa gốc

tự do, hạn chế quá trình oxy hóa đang được quan tâm và phát triển vì tính hiệu quả và

an toàn mà nó đem lại

Ở Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, Đinh lăng đã được trồng và sử dụng từ rất lâu và phổ biến Ngoài việc sử dụng để làm gia vị trong một số món ăn, Đinh lăng được sử dụng như một vị thuốc trong nền y học cổ truyền Ngoài tác dụng bồi bổ tăng cường sức khỏe giống như Hải Thượng Lãn Ông có ví "Đinh lăng là nhân sâm của người nghèo", Đinh lăng còn được biết đến với tác dụng khác như lợi tiểu,

chống trầm cảm, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt, ức chế enzym (Bensita mary bernard et

al., 1998 ; Đỗ Tất Lợi, 2004 ; Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, 2001 ; Hồ

Lương Nhật Vinh, 2014) Nhưng tác dụng chống oxy hóa của Đinh lăng thì chưa được nghiên cứu Nhằm góp phần tìm hiểu thêm về tác dụng và giá trị mà cây Đinh lăng

mang lại, đề tài " Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng (Polyscias

fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang " được tiến hành với mục tiêu sau:

- Khảo sát sơ bộ về hình thái cây Đinh lăng và đặc điểm vi học của rễ Đinh lăng

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ Đinh lăng để chọn ra phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất

- Khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học của phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CÂY ĐINH LĂNG

2.1.1 Vị trí phân loại

Cây Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm (họ Ngũ gia bì) có vị trí phân loại như sau (Trương Thị Đẹp, 2011):

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí phân loại của Polyscias fruticosa (L.) Harms

2.1.2 Đặc điểm thực vật họ Nhân sâm

Ở Việt Nam, họ Nhân sâm bì có trên 20 chi: Acanthopanax, Aralia, Aralidium,

Arthrophyllum, Brassaiopsis, Dendropanax, Dizygotheca, Evodiopanax, Grushvitzkia,

Giới thực vật (Plantae)

Phân giới thực vật bậc cao (Cormobionta)

Ngành ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp ngọc lan (Magnoliopsida) Phân giới thực vật bậc cao (Cormobionta) Giới thực vật (Plantae)Phân lớp Thù du (Cornidae)

Hedera, Heteropanax, Macropanax, Panax, Pentapanax, Plerandropsis, Polycias, Pseudopanax, Scheffleropsis, Tetrapanax, Trevesia, Tupidanthus: Gần 120 loài

Thân: Thân cỏ hay cây gỗ nhỏ mọc đứng hoặc cây gỗ to ít phân nhánh, đôi khi leo Lá: Lá thường mọc cách ở gốc thân mộc đối ở ngọn, đôi khi mọc vòng Lá có thể đơn hay kep hình lông chim hoặc kép hình chân vịt Phiến lá nguyên, có khía răng hoặc có thùy Lá kèm rụng sớm hay đính vào cuống lá Bẹ lá phát triển Cụm hoa: Tán đơn hay kép, tụ thành chùm, đầu, gié ở nách lá hay ngọn cành Hoa: Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, mẫu 5, 4 vòng Bao hoa: Lá đài thu hẹp chỉ còn 5 răng, 5 cánh hoa rời và rụng sớm Bộ nhị: 5 nhị xen kẽ cánh hoa Bộ nhụy: 5 lá noãn dính nhau thành bầu dưới

có 5 ô, mỗi ô 1 noãn; đôi khi có 10 lá noãn, ít khi giảm còn 3 hay 1 lá noãn; vòi rời Quả: Quả mọng hay quả hạch Hạt có nội nhũ (Trương Thị Đẹp, 2011)

2.1.3 Đặc điểm thực vật chi Polyscias

Chi Polyscias Forst & Forst F có gần 100 loại trên thế giới, phân bố rải rác ở

cận vùng nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam có

7 loài đều là cây trồng (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

Cây gỗ nhỏ hay vừa có dáng mảnh và có tán lá đẹp, thường xanh, không gai Lá kép lông chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van Bộ nhị 5, bao phấn hình trứng hay thuôn Bầu dưới 2 ô, ít khi 3 – 4 ô; vòi nhụy 2 – 4 rời hay hợp ở gốc Quả dẹt, ít khi

gần hình cầu Hạt dẹt (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

2.1.4 Đặc điểm thực vật cây Đinh lăng

Đinh lăng còn gọi là cây Gỏi cá

Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harms, thuộc họ Nhân sâm- Araliaceae

(Võ Văn Chi, 1997)

Tên khác: Nam dương lâm

Tên đồng nghĩa: Panax fruticosum L, Nothopanax fruticosum(L.) Miq

Tieghenopanax fruticosus(L.) R Vig (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Mô tả: Cây nhỏ dạng bụi, cao 1,5 – 2m Thân nhẵn, ít phân nhánh, các nhánh non

có nhiều lỗ bì lồi Lá kép mọc so le, có bẹ, phiến lá xẻ 3 lần lông chim, mép có răng cưa không đều, chóp nhọn, lá chét và các đoạn đều có cuống Cụm hoa chùy ở ngọn, gồm nhiều tán Hoa nhỏ, màu trắng xám Quả hình trứng, dẹt, màu trắng bạc (Võ Văn Chi, 1997)

Phân bố sinh thái

Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie ở Thái Bình Dương Cây được trồng ở Malaysia, Indonesia, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, Đinh lăng cũng có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh viện Để làm cảnh, làm thuốc và làm rau gia vị

Đinh lăng là loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, trồng được trên nhiều loại đất, thậm chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được, theo kiểu cây cảnh bonsai Trồng bằng cành sau 2 – 3năm cây có hoa quả Chưa quan sát được cây con mọc từ hạt

Đinh lăng có khả năng tái sinh vô tính khỏe, với một đoạn thân hoặc cành cắm

xuống đất đều trở thành cây mới (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

Đất trồng Đinh lăng cần màu mỡ, tầng canh tác sâu, tơi xốp, cao ráo, thoát nước

và tiện tưới Đinh lăng được trồng quanh năm, tốt nhất là giâm cành vào tháng 5 – 6 và trồng vào tháng 7 – 8 Khi trồng nên cắt bớt lá để hạn chế thoát hơi nước, giúp cây nhanh phục hồi Cây ưa bóng và ưa ẩm nên có thể trồng xen dưới tán cây trong vườn Thường xuyên làm cỏ nhất là đối với cây mới trồng

Đinh lăng không có sâu bệnh nghiêm trọng Cây trồng sau 7 – 10 năm mới thu

hoạch Cây càng già, năng suất và chất lượng rễ càng cao (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

Bộ phận dùng

Rễ, thân, lá – Radix, Caulis et Folium Polyscias

Thu hoạch rễ của những cây đã trồng từ 3 năm trở lên, đem rửa sạch phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió để đảm bảo mùi hương và phẩm chất Khi dùng, đem rễ tẩm nước gừng tươi 5 % sao qua, rồi tẩm 5 % mật ong hoặc mật mía Lá thu hái quanh năm

thường dùng tươi (Võ Văn Chi, 1997)

2.1.5 Thành phần hóa học

Rễ Đinh lăng có glycosid, alcaloid, saponin, flavonoid, tannin, vitamin tan trong nước (B1, B2, B6, C…), polyacetylen, các phytosterol và tới 20 acid amin (Arginin, alanin, asparagin, cystein, acid glutamic, leucin, lysin ) Các saponin triterpen trong cây Đinh lăng đều có phần sapogenin là acid oleanolic, phần đường là glucose, galactose, rhammose …, với tỷ lệ hàm lượng là: rễ 0.49 %; vỏ rễ 1.00 %; lõi rễ 0.11%

( Võ Xuân Minh, 1992 ; Nguyễn Thị Nguyệt và cs, 1992 ; Vo D H., et al.,1998 ; Võ Xuân Minh và cs, 1991 ; Nguyễn Thời Nhâm và cs, 1990 ; Lutomski J et al., 1992)

Trong lá Đinh lăng cũng có các thành phần hóa học như trong rễ Đinh lăng nhưng hàm lượng ít hơn Hàm lượng saponin toàn phần trong lá là 0,38 % Ngoài ra

còn có tinh dầu với thành phần chính là β-elemen, α-bergamoten, germacren, bisabolen (Võ Văn Chi ,1997 ; Võ Xuân Minh và cs, 1991 ; Brophy J.J et al., 1990)

E-γ-Bisabolen α-Bergamoten

Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng như: diyn-3,10-diol; Palcarinol; (8Z)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on; (8E)- Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, Panaxydol (Lutomski J et al., 1992):

10

17

86431

(8E)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol

HO

13

(8E)-Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on

31

O

1710

Panaxydol

Một số loại saponin có trong cây Đinh lăng đã phân lập được có công thức như

sau ( Proliac J et al., 1996 ; Vo D H et al., 1998 ; Nguyễn Thị Nguyệt và cs, 1992):

CHH3HO

HO OH

HO HO

CHH3

O

O

O O

HOOC HO

O OH

HO HO

CHH3O

O

O O

HOOC HO O

O

O

O

HOOC O HO

HO

OH

HO OH

O HO

CHH3

O O

OH

HOOC O

OH HO

HO HO

HO O

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D

-glucopyranosyl ester

HO HO O

HO

O HO

HO HO

OH

3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D

-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

CHH3

O

O O

HOOC O

HO HO O

HO

O HO

HO

OH HO

3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D

-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

O

O O

HOOC O

HO HO O

HO

O HO

HO

OH HO

3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D

-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

CHH3

O

O OH

HOOC O

O HO HO

O

O OH HO

H3C HO

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-α-L

-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester

O

O O

HOOC O

O HO HO

O

O OH HO

H3C HO OH

HO

HO HO

3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D

-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-

CHH3O

HO

Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl] oleanolic

OH

HO OH

HO

O

CH3

OH OHHO

Acid 3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D

-glucopyranosyl] oleanolic

Trong những năm gần đây, có nhiều hợp chất saponin mới được phân lập Năm

2014, Hồ Lương Nhật Vinh đã phân lập được 3-O-{β-D glucopyranosyl (1→2)-[β-Dgalactopyranosy l(1→4)]-β-D-glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl] ester từ lá cây Đinh lăng Năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu và cộng sự lần đầu tiên phân lập được hợp chất falcarindiol từ rễ Đinh lăng Cùng năm 2016, Trần Thị Hồng Hạnh và cộng sự lần đầu tiên phân lập được 3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-

-glucuronopyranosyl} oleanolic acid

28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranosyl ester (từ lá Đinh lăng) và được đặt tên là polyscioside I (Hồ Lương

Nhật Vinh, 2014 ; Nguyễn Thị Bích Thu và cs, 2016 ; Trần Thị Hồng Hạnh và cs,

2016)

O

O O O

HO

OH

O OH

OH HO

OH

OH O

OH O

O

OH

OH HO

OH

3-O-{β-D glucopyranosyl (1→2)-[β-D-galactopyranosy l(1→4)]-β-Dglucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D-

CHH3

O

O O

HOOC O

O

OH

HO HO

O

O

OH OH

HO

O HO

HO HO

OH O

Polyscioside I

Viện hóa sinh biển-Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ lá Đinh lăng là quercitrin, afzelin và kaempferol-3-O-rutonosid

(Nguyễn Thị Luyến và cs, 2012):

OOH

OH

O

OHOH

OH

OO

Đỗ Tất Lợi, 2004)

Đinh lăng có tác dụng làm tăng hiệu lực điều trị của cloroquin trong bệnh sốt rét thực nghiệm trên động vật Đinh lăng có tác dụng tăng co bóp tử cung, có tác dụng an thần và ít độc, có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen Nước sắc Đinh lăng có tác dụng đối kháng trùng roi Euglena viridis, trùng tiêm mao Paramoecium caudatum và một số động vật nguyên sinh khác trong nước ngâm rơm và nước ao Nước săc Đinh lăng còn

có tác dụng chống choáng phản vệ ở mức độ vừa, bảo vệ được 60 % chuột Lang qua

cơn choáng Đinh lăng có tác dụng kháng Entamoeba histolyca, làm đơn bào co thành

kén Đinh lăng đã được nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong thí nghiệm gây mẫn cảm chuột nhắt bằng hồng cầu cừu Đinh lăng có tác dụng

ức chế mạnh hoạt độ men MAO ở não và gan Dịch chiết Đinh lăng còn được thử tác dụng đối với ATPase màng tế bào, và thấy K+, Na+, ATPase đều được kích thích bởi dịch chiết thân, rễ và lá của cây Đinh lăng còn có tác dụng kích thích sinh dục ở động vật già và kích thích tăng sinh lực ở động vật gây mệt mỏi, tác dụng kéo dài và bền

vững (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

Ở Ấn Độ, người ta cho là cây có tính làm săn, dùng trong điều trị sốt Ở Campuchia, người ta dùng lá phối hợp với các cây thuốc khác làm bột hạ nhiệt, thuốc giảm đau Lá dùng xông để ra mồ hôi và chữa chứng chóng mặt, dùng tươi giã nát đắp ngoài trị viêm thần kinh khớp và vết thương Lá nhai nuốt với chút phèn giúp trị hóc xương cá (Võ Văn Chi, 2004)

Cụ thể các nghiên cứu cho thấy:

- Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như nhân sâm (Đỗ Tất Lợi, 2004)

- Các thí nghiệm trên chuột cho thấy cây Đinh lăng có tác dụng lợi tiểu, làm tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng của chuột

đối với các bức xạ siêu cao tần (Đỗ Tất Lợi, 2004 ; Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

- Cây Đinh lăng có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể thao (Nguyễn Thị Thu Hương và Lương Kim Bích, 2001)

- Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol

phân lập được từ cây Panax vietnamensis và Polycias fruticosa cho thấy có hoạt

tính kháng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được vi khuẩn Gram (-) (Lutomski J et al., 1992)

- Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng Kết quả cho thấy

cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress với liều 45 – 180 mg/kg thể trọng, khoảng liều này cũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch (Nguyễn Thị Thu Hương

và Lương Kim Bích, 2001)

- Dịch chiết cồn của rễ Đinh lăng được nuôi cấy mô trong 6 tháng đã thể hiện tác dụng tăng lực dài ngày, chống stress nóng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như dịch chiết cồn của rễ cây Đinh lăng 5 năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Ngọc Dung, 1998)

- Dịch chiết n-butanol của lá cây Đinh lăng với liều 500 mg/kg có tác dụng hạ

sốt, giảm đau, chống viêm và diệt nhuyễn thể trên chuột nhắt trắng (Bernard

M.B et al., 1998 )

- Cao lá Đinh lăng ở liều 200 mg/kg và 500 mg/kg làm giảm lượng Malondialdehyde trong não và gan chuột nhắt trắng sau khi được gây tăng bằng CCl4 và làm giảm nồng độ cholesterol trong máu so với lô không điều trị Cao

lá Đinh lăng ở liều 200 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa và hạcholesterol ở chuột nhắt cao hơn so với liều 500 mg/kg (Nguyễn Trần Châu và Đỗ Mai Anh, 2008)

- Năm 2011, Varadharajan và cộng sự đã chứng minh được hoạt tính lợi tiểu của dịch chiết dầu hỏa rễ Đinh lăng trên động vật thí nghiệm (Varadharajan R and Rajalingam D., 2011)

- Năm 2012, viện Hóa sinh biển – Viện khoa học công nghệ Việt Nam đã chứng minh trên in vitro tác dụng ức chế enzyme α-amylase của 2 flavonoid phân lập

là quercitrin và kaempferol-3-O-rutonosid với giá trị IC50tương ứng là 4,61

µg/ml và 59,4 µg/ml (Nguyễn Thị Luyến và cs, 2012)

- Năm 2014, kết quả thử in vitro cho thấy lá Đinh lăng có tác dụng ức chế tốt 2

enzyme α- amylase và α- glucosidase Đây là 2 enzyme đóng vai trò quan trọng

trong quá trình thủy phân, hấp thu tinh bột và chuyển hóa đường trong cơ thể và việc ức chế 2 enzyme này có thể giúp ngăn chứng tăng đường huyết (Hồ Lương

Nhật Vinh, 2014)

2.1.7 Một số bài thuốc có Đinh lăng

Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình Lá Đinh lăng có vị nhạt, hơi đắng, tính bình (Võ Văn Chi, 1997)

Theo dân gian, rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, chữa cơ thể suy nhược, gầy

yếu mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho, ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ, làm thuốc lợi tiểu Thân và cành dùng chữa phong thấp, đau lưng Lá dùng chữa cảm sốt, mụn nhọt sưng tấy, sưng vú (Võ Văn Chi, 2004).Dưới đây là một số bài thuốc dân gian có Đinh lăng:

 Thuốc bồi bổ cơ thể, tăng cường thể lực:

Rễ củ Đinh lăng thái lát, phơi khô, sao vàng sắc uống hằng ngày, có thể nghiền thành bọt mịn để uống ngày 20 – 30 g (Quách Tuấn Vinh, 2006)

 Chữa Phong thấp, thấp khớp:

Rễ Đinh lăng 12 g; Cối xay, Hà thủ ô, Huyết rồng, cỏ Rễ xước, Thiên niên kiện tất cả 8 g; vỏ Quýt, Quế chi 4 g (riêng vị Quế chi bỏ vào sau cùng khi sắp nhấc ấm thuốc xuống) Đổ 600 ml nước sắc còn 250 ml Chia làm hai lần uống trong ngày Uống khi thuốc còn nóng (Võ Hà, 2008)

- Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động:

Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 0.50 g thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2 – 3 lần uống trong ngày

 Thông tia sữa, căng vú sữa:

Rễ Đinh lăng 30 – 40 g Thêm 500 ml nước sắc còn 250 ml Uống nóng Uống luôn 2 – 3 ngày, vú hết nhức, sữa chảy ra bình thường (Đỗ Tất Lợi, 2004)

 Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật (Đỗ Tất Lợi, 2004)

 Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau, tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh lăng tươi (rễ, cành) 30 g, lá hoặc vỏ Chanh 10 g, vỏ Quýt 10 g, Sài hồ (rễ, lá,cành) 20 g, lá Tre tươi 20 g, Cam thảo dây hoặc Cam thảo đất 30 g, Rau má tươi 30

g Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần trong ngày (Đỗ

Huy Bích và cs, 2006)

 Chữa đau tử cung:

Cành và lá Đinh lăng rửa sạch sao vàng, sắc uống thay chè (Đỗ Huy Bích và cs,

2006)

 Chữa mẫn ngứa do dị ứng:

Lá đinh lăng 80 g, sao vàng, sắc uống Dùng trong 2 – 3 tháng (Đỗ Huy Bích và

cs, 2006)

 Chữa thiếu máu:

Rễ Đinh lăng, Hà thủ ô, Thục địa, Hoàng tinh, mỗi vị 100 g, Tam thất 20 g Tán

bột, sắc uống ngày 100 g (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

 Chữa viêm gan mạn tính:

Rễ Đinh lăng 12 g, Nhân trần 20 g, Ý dĩ 16 g; Chi tử, Hoài sơn, Biển đậu, rễ Cỏ tranh, Xa tiền tử, Ngũ gia bì, mỗi vị 12 g; Uất kim, Nghệ, Ngưu tất, mỗi vị 8 g Sắc

uống, ngày một thang (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

 Chữa liệt dương:

Rễ Đinh lăng, Hoài sơn, Ý dĩ, Hoàng tinh, Hà thủ ô, Kỷ tử, Long nhãn, cám Nếp, mỗi vi 12 g; Trâu cổ, cao long ban, mỗi vị 8 g; Sa nhân 6 g Sắc uống, ngày một thang

(Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

 Chữa sốt rét:

Rễ Đinh lăng, Sài hồ, mỗi vị 20 g; Rau má 16 g; lá Tre, Cam thảo nam, mỗi vị 12

g; Bán hạ sao vàng 8 g, Gừng 6 g, sắc uống (Đỗ Huy Bích và cs, 2006)

 Phòng tác dụng của thuốc chữa lao:

Lá Đinh lăng sao vàng 20 – 25 g, hãm nước uống hàng ngày (Quách Tuấn Vinh, 2005)

 Chữa ho suyễn lâu năm:

Rễ đinh lăng, Bách bộ, Đậu săn, rễ cây Dâu, Nghệ vàng, rau tần dày lá, mỗi vị 8

g, củ Xương bồ 6 g, Gừng khô 4 g Đổ 600 ml sắc còn 250 ml Chia làm hai lần uống trong ngày Uống lúc thuốc còn nóng (Võ Hà, 2008)

2.1.8 Một số chế phẩm từ Đinh Lăng

Trên thị trường hiện nay, có các chế phẩm từ Đinh lăng sau:

Trà Đinh lăng Công ty TNHH Lava

2.2 GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

2.2.1 Khái niệm gốc tự do

Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (ROS và RNS), là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do Gốc tự do

là những phân tử hoặc nguyên tử có điện tử độc thân, điện tử này làm cho gốc tự do có khả năng oxy hóa rất cao Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyd, nitroperoxyd là tiền chất của các gốc tự do Các gốc tự do không bền với thời gian nên nó phải nhận điện tử từ các phân tử khác để đạt được cấu trúc bền vững Quá trình này tạo thành một dây chuyền phản ứng với các phân tử chung quanh

nó, do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như ADN, protein, lipid (Proctor P.H., 1989 ; Favier A., 2003 ; Viện dược liệu, 2006) Trong cơ thể người và động vật, thường xuyên có sự hình thành các gốc tự do, phát sinh trong quá trình chuyển hóa hay là sản phẩm của phản ứng khử độc đối với một số chất hoặc yếu tố ngoại lai trong hệ thống lưới nội bào Ngoài ra chúng có thể được sinh ra do một số tác nhân bên ngoài như tia tử ngoại, nhiễm độc lân hữu cơ, hay bệnh lý gây ra bởi stress như chấn thương, bỏng… Khi có sự gia tăng hình thành gốc

tự do, làm mất cân bằng hệ thống oxy hóa, kết quả làm tổn thương cấu trúc phân tử của tế bào như lipid, ADN, protein… dẫn đến thay đổi chức năng hoạt động của tế bào (Viện dược liệu, 2006)

2.2.2 Tác động của gốc tự do và sự liên quan đến bệnh tật con người

Gốc tự do sinh ra quá mức sẽ vượt qua hệ thống enzym bảo vệ của cơ thể (enzym superoxid dismutase - SOD, catalase, peroxidase…) và không tránh khỏi việc các gốc này tấn công vào tất cả các chất trong cơ thể Những thành phần tế bào như ADN, protein, phospholipid, carbohydrat… dễ bị gốc tự do tấn công, là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm

Gốc tự do tấn công vào phospholipid màng tế bào gây ra quá trình peroxy hóa lipid Hậu quả dẫn đến tính lỏng, tính thấm của màng tế bào thay đổi Quá trình peroxy hóa ở quanh bao myelin của sợi tế bào thần kinh có thể dẫn tới các dấu hiệu của bệnh thần kinh (bệnh não suy Alzheimer) Nếu peroxy hóa các chất xảy ra trên bề mặt phế nang sẽ gây ra dấu hiệu rối loạn chức năng phổi Quá trình peroxy hóa lipid xảy ra mãnh liệt ở cơ quan, tổ chức tế bào khiến chúng bị phá hủy một cách nghiêm trọng dẫn đến đột biến, ung thư hoặc tổn thương các phân tử ADN

Sự tác động đến các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại các phân tử polysaccharid do oxy hóa có thể làm mất tính nhớt của acid hyalunoric (một chất làm trơn khớp), ảnh

hưởng tới quá trình viêm có thể dẫn tới bệnh viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ… Gốc tự do liên quan chặt chẽ đến sự điều hòa các chất tiết ra từ thành trong mạch máu (prostacyclin, nitrogen oxyd ) để quyết định tính bám dính của tiểu cầu và các mảng xơ vữa là nguyên nhân của một số bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não )

Nói chung gốc tự do liên quan đến khá nhiều bệnh tật trong cơ thể vì thế nếu khả năng chống oxy hóa của cơ thể cao thì xác suất mắc bệnh và mức độ bệnh tật sẽ giảm

Vì thế người ta không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các chất chống oxy hóa cho cơ thể

nhằm nâng cao và bảo vệ sức khỏe con người (Lại Thị Ngọc Hà và cs, 2009 ; Nguyễn

Ngọc Hồng, 2009)

2.2.3 Chất chống oxy hóa

Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa việc tạo ra các gốc oxy hóa và các chất chống oxy hóa, đó là trạng thái căn bản của cân bằng nội môi Các chất chống oxy hóa là những chất giúp bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do tạo ra trong các quá trình oxy hóa nên ngăn cản hay làm chậm quá trình này

Ngoài ra, các chất chống oxy hóa còn được sử dụng trong ngành dược và mỹ phẩm với mục đích bảo vệ sự ổn định của dược chất Do đó, chất chống oxy hóa cũng được định nghĩa là những chất khử mạnh có hoạt tính oxy hóa cao hơn so với dược chất Các chất chống oxy hóa trong dược phẩm được chia ra làm nhiều nhóm dựa trên

cơ chế khác nhau bao gồm các cơ chế chống oxy hóa trực tiếp và chống oxy hóa gián tiếp

- Các chất chống oxy hóa gián tiếp là những tác nhân chelat hóa tác động lên các ion kim loại như Fe2+, Cu2+, Ni2+, Mn2+ … Vì đây là các ion xúc tác cho các quá trình khơi mào phản ứng oxy hóa

- Các chất chống oxy hóa trực tiếp bao gồm các chất khử hóa, các chất oxy hóa chọn lọc và các chất ngắt mạch

Trong thiên nhiên, các chất chống oxy hóa có từ nhiều nguồn gốc khác nhau nhưng cây cỏ vẫn là nguồn quan tâm chủ yếu Một số chất chống oxy hóa đã được tìm

ra, chứng minh và sử dụng hàng loạt như: Vitamin E, vitamin C, polyphenol, flavonoid

(Viện dược liệu, 2006 ; Wang J et al, 2007)

2.2.4 Một số phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro

2.2.4.1 Thử nghiệm sử dụng DPPH

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu

Phương pháp này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm

Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho

hydrogen, làm nhạt dần màu tím của DPPH ( Huang D et al, 2005 ; Wang J et al,

2007)

N N

N NH

Hình 2.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):

HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100

OD: Mật độ quang

2.2.4.2 Thử nghiệm sử dụng TBA - đo lượng MDA

MDA (Malonyl dialdehyd) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào Sử dụng acid thiobarbituric (TBA) để xác định hàm lượng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxy hóa của chất nghiên cứu thể hiện qua việc giảm hàm lượng MDA

Một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử TBA tạo phức màu hồng hấp thu

cực đại ở bước sóng 523 nm (Nguyễn Thượng Dong và cs, 2006 ; Viện dược liệu,

H

S O

S H O O

H S

t

Hình 2.5 Phản ứng trong phương pháp sử dụng TBA – đo lượng MDA

Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):

HTCO (%) = [(CMDA chứng – CMDA thử)/ CMDA chứng] x 100

Nồng độ MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA

2.2.4.3 Thử nghiệm đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II

Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II với thuốc thử Ferrozin (Viện dược liệu, 2006)

EDTA được sử dụng như chất đối chiếu dương tính

Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):

HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)]x100

2.2.4.5 Thử nghiệm đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd

Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử, sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng 550 nm Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím (Viện dược liệu, 2006 ; Wang J, 2007) Enzym superoxyd dismutase (SOD) được sử dụng như chất đối chiếu dương tính

HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100

2.2.4.6 Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Phương pháp FRAP)

Phương pháp FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power) được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử hóa của các chất trong huyết tương, nhưng đây cũng là phương pháp được sử dụng để thử nghiệm các chất chống oxy hóa trong thực vật Phương pháp này dựa vào sự khử phức ferric 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe3+ – TPTZ) thành phức chất ferrous 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe2+ – TPTZ) bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxy hóa) ở pH thấp Phức Fe2+ – TPTZ tạo thành có màu xanh dương đậm, bền vững và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 593 nm (

Benzie I.F.F and Strain J.J, 1999 ; Wojdylo A et al, 2007 ; Nguyen Thi Hoai Thu et al,

2011)

Fe 3+

antioxidant +e

N

Fe 2+

Hình 2.6 Phản ứng FRAP

2.2.4.7 Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H 2 O 2

(Hydrogen peroxide scavenging activity)

Hai tiểu phân O2- và H2O2 sinh ra từ chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng

độ cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra 1O2, .OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ

đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa

H2O2 và đỏ phenol (màu đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2trong sự hiện diện của enzym peroxydase từ cải gia (Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý, 2006)

2.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây Nhưng các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng- lỏng và chiết rắn- lỏng

- Chiết lỏng – lỏng (phân bố lỏng– lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố

- Chiết rắn – lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010)

2.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Cao alcol thô ban đầu (thí

dụ bột cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu

cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng

để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt