Nghiên cứu hoạt tính của hợp chất acetogenin và xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm chức năng từ cây mãng cầu xiêm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ====== ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CỦA HỢP CHẤT ACETOGENIN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT TPCN TỪ CÂY MÃNG CẦU XIÊM GVHD : PGS.TS Trần Đình Thắng SVTH : Lê Trọng Hòa Nguyễn Thị Hằng Lƣơng Thị Hòa Nguyễn Thị Huyền Lê Đông Du Nguyễn Thị Sinh NGHỆ AN – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Trọng Hòa 1152044856 Nguyễn Thị Hằng 1152043897 Lƣơng Thị Hòa 1152043823 Nguyễn Thị Huyền 1152043848 Lê Đông Du 1152043870 Nguyễn Thị Sinh 1152043886 Khóa: 52 Ngành: Kỹ sƣ Cơng nghệ thực phẩm Tên đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính hợp chất acetogenin xây dựng quy trình sản xuất Thực phẩm chức từ Mãng cầu xiêm" Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần hóa học thử hoạt tính hợp chất acetogenin Mãng cầu xiêm - Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm chức từ Mãng cầu xiêm Họ tên cán hƣớng dẫn : PGS.TS Trần Đình Thắng Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2016 Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng năm 2016 Ngày tháng năm 2016 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm Ngƣời duyệt BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH _ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc _ BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Trọng Hòa 1152044856 Nguyễn Thị Hằng 1152043897 Lƣơng Thị Hòa 1152043823 Nguyễn Thị Huyền 1152043848 Lê Đông Du 1152043870 Nguyễn Thị Sinh 1152043886 Khóa: 52 Ngành: Kỹ sƣ Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Đình Thắng Cán duyệt: Ths Hoàng Văn Trung Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nghiên cứu hoạt tính hợp chất acetogenin xây dựng quy trình sản xuất Thực phẩm chức từ mãng cầu xiêm Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2016 Cán hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) PGS.TS Trần Đình Thắng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH _ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc _ BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Lê Trọng Hòa 1152044856 Nguyễn Thị Hằng 1152043897 Lƣơng Thị Hịa 1152043823 Nguyễn Thị Huyền 1152043848 Lê Đơng Du 1152043870 Nguyễn Thị Sinh 1152043886 Khóa: 52 Ngành: Kỹ sƣ Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Đình Thắng Cán duyệt: Ths Hoàng Văn Trung Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nghiên cứu hoạt tính hợp chất acetogenin xây dựng quy trình sản xuất Thực phẩm chức từ mãng cầu xiêm Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2016 Cán hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) PGS.TS Trần Đình Thắng LỜI CẢM ƠN Trong năm học tập trƣờng Đại học Vinh, đƣợc giảng dạy, giúp đỡ tận tình thầy giáo mơn Cơng nghệ thực phẩm Khoa Hóa thầy giáo trƣờng, em hồn thành đƣợc chƣơng trình học tập Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu đồ án tốt nghiệp mà cịn hành trang quý báu để em bƣớc vào đời cách vững tự tin Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô! Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Trần Đình Thắng, trực tiếp giao đề tài tận tình hƣớng dẫn em suốt thời gian qua thầy giáo Khoa Hóa, đặc biệt thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ thực phẩm trƣờng Đại học Vinh giúp đỡ em nhiều việc hồn thành đồ án Do thời gian tìm hiểu cịn hạn chế nên đồ án em khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong góp ý thầy để đồ án đƣợc hồn thiện đƣợc ứng dụng thực tế Cuối cùng, em xin kính chúc q Thầy, Cơ gia đình dồi sức khỏe thành công nghiệp cao quý Em xin chân thành cảm ơn! Vinh, ngày tháng 05 năm 2016 Sinh viên thực Lê Trọng Hòa Nguyễn Thị Hằng Lƣơng Thị Hịa Nguyễn Thị Huyền Lê Đơng Du Nguyễn Thị Sinh MỤC LỤC Chƣơng 1.TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm phân bố 1.2 Các hợp chất acetogenin na xiêm 1.3 Hoạt tính sinh học acetogenin .4 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 12 2.1 Mẫu nghiên cứu 12 2.2 Phân lập hợp chất acetogenin 12 2.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất acetogenin 12 2.4 Phƣơng pháp xác định độ tinh acetogenin làm chất chuẩn 12 2.4.1 Xây dựng liệu nhận dạng chất 12 2.4.2 Đánh giá độ tinh khiết phân tích tạp chất 14 2.4.3 Thiết lập chất chuẩn xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 14 2.4.3.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng 14 2.4 3.2 Qui trình thiết lập phân tích đánh giá chất chuẩn 15 2.5 Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng acetogenin phƣơng pháp HPLC 16 2.5.1 Các bƣớc phân tích định lƣợng 16 2.5.1.1 Lấy mẫu thử 16 2.5.1.2 Tiến hành đo sắc ký 16 2.5.2 Các phƣơng pháp định lƣợng 16 2.5.2.1 Phƣơng pháp đƣờng chuẩn 16 2.5.2.2 Phƣơng pháp nội chuẩn [2] 17 2.6 Phƣơng pháp xác định tiêu chất lƣợng chế phẩm 17 2.6.1 Xác định độ ẩm chế phẩm (TCVN 4295: 1986) 17 2.6.2 Xác định hàm lƣợng tro toàn phần(QCVN 4-21:2011/BYT) 18 2.6.3 Xác định hàm lƣợng protein (TCVN – 1: 2009, ISO 8968-1: 2001) 19 2.6.4 Xác định hàm lƣợng lipid(TCVN 4295: 1986) 20 2.6.5 Xác định hàm lƣợng hydrat carbon (H.HD.QT.162) 21 2.6.6 Xác định giới hạn kim loại nặng: 22 2.6.6.1 Xác định hàm lƣợng chì ( AOAC.999.10:2002) 22 2.6.6.2 Xác định hàm lƣợng cadmi (AOAC.999.10:2002) 24 2.6.6.3 Xác định hàm lƣợng thuỷ ngân (AOAC 971.21: 2002) 25 2.6.7 Xác định độ nhiễm khuẩn: 26 2.6.7.1 Yêu cầu tiêu kĩ thuật: 26 2.6.7.2 Phƣơng pháp thử: 26 2.7 Thử hoạt tính sinh học sản phẩm cao chiết chứa hoạt chất acetogenin 30 2.8 Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn 31 2.8.1 Vật liệu nghiên cứu 32 2.8.2 Bố trí thí nghiệm 32 2.8.3 Theo dõi dõi biểu bên ngồi động vật thí nghiệm 32 2.8.5.Nghiên cứu ảnh hƣởng AMF3 đến số tiêu huyết học, sinh hoá máu 33 2.8.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng TPCN AMF3 đến quan nội tạng 33 2.9 Phƣơng pháp thử độc tính cấp tính thực phẩm chức AMF3 33 2.11 Phƣơng pháp sản xuất cao chiết chứa hoạt chất nhóm acetogenin từ mãng cầu xiêm 34 2.11.1 Phân loại rửa 34 2.11.2 Quá trình sấy tán bột 34 2.11.3 Quá trình ngâm chiết 35 2.11.4 Lọc ly tâm 35 2.11.6 Quá trình phân tích 35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Chiết tách hợp chất acetogenin 37 3.1.1 Xác định phân đoạn cao chiết giàu hoạt chất acetogenin từ mãng cầu xiêm 37 3.1.2 Xác định acetogenin phân đoạn giàu acetogenin 39 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất acetogenin 43 3.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất A 43 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất B (Annonacin ) 56 3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất C (Squamocin ) 56 3.3 Xác định độ tinh acetogenin làm chất chuẩn 57 3.3.1 Sắc ký mỏng (TLC) 57 3.3.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 57 3.4 Phân tích hàm lƣợng acetogenin phân đoạn giàu acetogenin 58 3.5 Thử hoạt tính sinh học sản phẩm cao chiết chứa hoạt chất acetogenin 59 3.5.1 Thử hoạt tính gây độc tế bào cao chiết 59 3.5.2 Thử hoạt tính số hợp chất acetogenin 59 3.6 Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận cao chiết chứa hoạt chất acetogenins từ mãng cầu xiêm, quy mô 10kg nguyên liệu/mẻ 62 3.7 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm chức chứa hoạt chất acetogenin từ mãng cầu xiêm 69 3.7.1 Quy trình sản xuất 69 3.7.2 Tối ƣu hóa q trình chiết dịch Lá mãng cầu xiêm 74 3.7.2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết [1] 74 3.7.2.2 Tối ƣu hóa q trình [2] 74 3.8 Tạo thực phẩm chức chứa hoạt chất nhóm acetogenins từ mãng cầu xiêm 81 3.8.1 Các nhóm tá dƣợc 81 3.8.2 Xác định tá dƣợc độn 81 3.8.3 Xác định tá dƣợc trơn 81 3.8.4 Xác định tá dƣợc rã 82 3.9 Đánh giá an toàn thực phẩm chức 83 3.9.1 Thử nghiệm độc tính cấp sản phẩm TPCN Veda- K+ 84 3.9.2 Thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn sản phẩm TPCN AMF3 84 KẾT LUẬN 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh na xiêm (Annona muricata) Hình 2.1 Ảnh chuột thí nghiệm 33 Hình 3.1: Phổ 1H NMR AMF-1 37 Hình 3.2: Phổ 1H NMR AMF-2 38 Hình 3.3: Phổ1H NMR AMF-3 .38 Hình 3.4: Phổ 1H NMR AMF-4 39 Hình 3.5: Sắc ký đồ HPLC AMF-3 40 Hình 3.6: Sắc ký đồ HPLC AMF-3 (mở rộng) .40 Hình 3.7: AMF-3 chiết xuất sắc ký ion (extracted ion chromatogram- EIC) .41 Hình 3.8 Phổ khối lƣợng MALDI-TOF hợp chất AMF-3 .43 Hình 3.9 : Phổ HR-ESI-MS hợp chất A 45 Hình 3.10: Phổ 1H-NMR hợp chất A 46 Hình 3.11: Phổ 1H-NMR hợp chất A (phổ dãn) .46 Hình 3.12: Phổ 1H-NMR hợp chất A (phổ dãn) .47 Hình 3.13: Phổ 13C-NMR hợp chất A .47 Hình 3.14: Phổ 13C-NMR hợp chất A (phổ dãn) 48 Hình 3.15: Phổ 13C-NMR hợp chất A (phổ dãn) 48 Hình 3.16: Phổ DEPT hợp chất A 49 Hình 3.17: Phổ DEPT hợp chất A (phổ dãn) 49 Hình 3.18: Phổ HMBC hợp chất A 50 Hình 3.19: Phổ HMBC hợp chất A (phổ dãn) 50 Hình 3.20: Phổ HMBC hợp chất A (phổ dãn) .51 Hình 3.21: Phổ HMBC hợp chất A (phổ dãn) 51 Hình 3.22: Phổ HMBC hợp chất A (phổ dãn) 52 Hình 3.23: Phổ HMBC hợp chất A (phổ dãn) 52 Hình 3.24: Phổ HSQC hợp chất A 53 Hình 3.25: Phổ HSQC hợp chất A (phổ dãn) 53 Hình 3.26: Phổ HSQC hợp chất A (phổ dãn) 54 Hình 3.27: Phổ COSY hợp chất A 54 Hình 3.28: Phổ COSY hợp chất A (phổ dãn) 55 Hình 3.29: Phổ COSY hợp chất A (phổ dãn) 55 Hình 3.30 Mẫu sản phẩm 68 Hình 3.31 Mẫu nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 69 Hình 3.32 Thiết bị nghiền 71 Hình 42 Sơ đồ thiết bị chiết 72 Hình 3.33 Thiết bị chiết 73 Hình 3.34 Bản vẽ hệ thống cô giảm áp 73 Hình 3.35 Chiết xuất na xiêm điều kiện nhiệt độ 50, 60, 70, 80oC theo thứ tự trái qua phải 76 Hình 3.36 Thử nghiệm độc tính actetogenin chuột .85 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Một số hợp chất acetogenin phận Na xiêm [5],[716],[18],[21] Bảng 3.1: Số liệu phổ NMR hợp chất A 44 Bảng 3.2: Đƣờng chuẩn, tiêu chuẩn LOD LOQ hợp chất acetogenin 58 Bảng 3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào EEAM phân đoạn chiết .59 Bảng 3.4 Hiệu suất sấy phun chiết xuất nƣớc na xiêm .67 Bảng 3.6 Kết đánh giá an toàn thực phẩm chức AMF3 83 10 xi – yếu tố tác động đến trình Dịch chiết từ Lá mãng cầu xiêm chứa nhiều loại chất hợp chất quan trọng khác nhau, địi hỏi q trình chiết hợp lý nhằm thu nhận tối đa hoạt tính sinh học có thể mãng cầu xiêm mà khơng bị mát hay biến tính hoạt chất Mặt khác nhƣ trình chiết khác, chiết dịch yêu cầu thông số chiết phù hợp nhƣng phải đạt hiệu suất chiết cao nhằm thu đƣợc hàm lƣợng chất chiết cao Một chế độ chiết thích hợp tìm đƣợc chế độ với thông số chủ yếu trình nhƣ nhiệt độ, thời gian tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi thích hợp Ta kí hiệu thơng số ảnh hƣởng đến trình chiết: X1 : nhiệt độ chiết (ºC) X2 : thời gian chiết (h) X3 : tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) MA TRẬN THỰC NGHIỆM YẾU TỐ ĐẦY ĐỦ 23 CÓ DẠNG SAU bảng 3.5 TN X1 X2 X3 + + + _ + + + _ + _ _ + + + _ _ + _ + _ _ _ _ _ Trong : (-), (+) tƣơng ứng với mức dƣới, mức yếu tố mức mức + Khảo sát dung môi chiết: Chúng tiến hành khảo sát số loại dung mơi phân cực đến dung môi phân cực mạnh: n-hexan, chloroform, etyl axetat, ethanol 96%, ethanol 70%, ethanol 45%, nƣớc Do tính chất khác dung môi mà loại dung mơi, dịch chiết thu đƣợc có thành phần khác 75 Để xác định đƣợc dung mơi thích hợp cho trình chiết, mẫu đƣợc chiết điều kiện lƣợng nguyên liệu chiết 10g, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/30, chiết nhiệt độ phịng, ngun liệu dạng xay vỡ kích thƣớc 1x1mm, số lần chiết lần, thời gian chiết tiếng Kết quả: Dung môi hàm lƣợng chất chiết(%) n – hexan 0,30 etyl axetat 0,47 cồn 96 1,27 Chlorofom 0,59 nƣớc 2,93 cồn 70 2,70 cồn 45 1,53 Dựa vào kết thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn dung môi cho nghiên cứu nƣớc Trong sản xuất thực phẩm, dung môi nƣớc vừa rẻ, thông dụng không ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời + Khảo sát nhiệt độ chiết: Sau lựa chọn đƣợc dung mơi thích hợp cho q trình chiết, chúng tơi tiến hành khảo sát nhiệt độ chiết điều kiện tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/30, lƣợng nguyên liệu 10g, nguyên liệu xay vỡ kích thƣớc 1x1mm, thời gian tiếng, có đảo trộn, số lần chiết lần Kết quả: Nhiệt độ(ºc) Hàm lƣợng chất khơ(%) 50 3,43 60 3,64 70 3,78 80 3,99 Hình 3.35 Chiết xuất na xiêm điều kiện nhiệt độ 50, 60, 70, 80oC theo thứ tự trái qua phải 76 + Khảo sát thời gian chiết: Để tìm đƣợc thời gian chiết thích hợp, tiến hành khảo sát thời gian chiết điều kiện nhƣ nhiệt độ chiết 50°C, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/30, có đảo trộn, số lần chiết Kết quả: Thời gian (h) Hàm lƣợng chất khô(%) 2,00 2,46 2,70 2,82 2,93 3,29 3,43 3,74 10 3,94 11 4,13 12 4,24 + Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: Tiến hành khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi điều kiện nhiệt độ chiết 50°C, thời gian chiết tiếng, có đảo trộn, số lần chiết Kết quả: Tỷ lệ Hàm lƣợng chất khô(%) 1/40 4,23 1/35 3.85 1/30 3,43 1/25 3,22 1/20 3,03 1/15 2,61 1/10 2,13 77 Sau khảo sát vùng ảnh hƣởng yếu tố đến trình chiết hợp chất có mãng cầu xiêm Chúng tơi tiến hành tối ƣu hóa q trình dựa theo biến ảnh hƣởng Lựa chọn vùng hoạt động tối ƣu trình chiết: X1 (nhiệt độ chiết - ºC) : 50 – 90 ºC X2 (thời gian chiết - h) : – 10h X3 (tỷ lệ nguyên liệu/dung môi - g/ml) : 1/15 – 1/35 Với hỗ trợ phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design – Expert 7.0, thực theo trình tự để xác định phƣơng trình hồi quy ảnh hƣởng yếu tố đến hàm lƣợng chất khô thu đƣợc sau chiết: - Lập quy hoạch trực giao cấp một, hai mức tối ƣu với biến nhiệt độ, thời gian tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: - Hàm mục tiêu cần quan tâm hàm lƣợng chất khô thu đƣợc sau chiết (hàm lƣợng chất chiết-%): 78 - Ma trận thực nghiệm yếu tố đầy đủ 23 có dạng: - Từ giá trị thực nghiệm sau lập ma trận thực nghiệm gồm 11 thí nghiệm, xác định đƣợc phƣơng trình hồi quy trình chiết: 79 Y = 3,43 + 0,53X1 + 0,44X2 – 0,2X3 Hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại điều kiện: nhiệt độ 90°C, thời gian 10h tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/35 (g/ml) Tuy nhiên với mục tiêu lựa chọn đƣợc thơng số q trình chiết với mục đích hàm lƣợng chất chiết thu hồi cao với điều kiện không ảnh hƣởng tới chất lƣợng hợp chất thiên nhiên thu đƣợc Với hỗ trợ phần mềm quy hoạch thực nghiệm trên, xác định thơng số cơng nghệ thích hợp cho q trình chiết cho thời gian chiết ngắn, nhiệt độ tỷ lệ nguyên liệu/dung môi phù hợp ta thu đƣợc: - Nhiệt độ chiết: 80°C - Thời gian chiết: 8h - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/20 80 3.8 Tạo thực phẩm chức chứa hoạt chất nhóm acetogenins từ mãng cầu xiêm 3.8.1 Các nhóm tá dược – Tá dƣợc trơn: Để điều hoà chảy, giúp cho bột hạt chảy vào nang nhằm đảm bảo đồng khối lƣợng hàm lƣợng dƣợc chất Tá dƣợc trơn hay dùng nhƣ : Magnesi stearat, calci stearat, Aerosil…với tỷ lệ 0,5- 1% Thời gian trộn tá dƣợc trơn với bột thuốc cần phải xác định cụ thể cho loại bột thuốc để phát huy hiệu tá dƣợc – Tá dƣợc độn: Dùng trƣờng hợp liều hoạt chất thấp khơng chiếm hết dung tích nang Cũng có trƣờng hợp bột dƣợc chất trơn chảy kém, phải cho thêm tá dƣợc pha loãng trơn chảy tốt nhƣ tinh bột biến tính, lactose phun sấy… – Đơi để tăng khả thấm ƣớt khối bột dịch tiêu hoá ngƣời ta cho thêm vào cơng thức tỷ lệ chất diện hoạt, ví dụ: Natri lauryl sulfat 3.8.2 Xác định tá dược độn Thành phần Dƣợc chất Công thức AMFB1 AMFB2 AMFB3 50mg 50mg 50mg Vđ Erapac Vđ Avicel pH101 Tinh bột mỳ Vđ Tiến hành: - Nghiền rây dƣợc chất qua rây 250mm - Rây loại tá dƣợc qua kích thƣớc rây 200mm - Chọn cỡ nang số 1( V= 0,48ml) - Đo tỷ trọng biểu kiến tính thể tích biểu kiến dƣợc chất loại tá dƣợc theo công thức - Trộn dƣợc chất loại tá dƣợc theo nguyên tắc đồng lƣợng - Tiến hành đo độ trơn chảy công thức máy đo độ trơn chảy Erwaka  Nhận thấy cơng thức AMFB1 có độ trơn chảy tốt => chọn tá dƣợc độn Erapac 3.8.3 Xác định tá dược trơn Sau đóng nang với tá dƣợc độn Erapac ta tiến hành kiểm tra độ đồng khối lƣợng theo dƣợc điển Việt Nam Tiến hành nghiên cứu công thức với số loại tá dƣợc trơn ta có bảng sau: 81 Thành phần Công thức AMFB AMFB5 AMFB6 AMFB7 Dƣợc chất 50mg 50mg 50mg 50mg Talc 4mg 4mg Natri laurylsulfat Aerosil 4mg 5mg 4mg 5mg 5mg Magnesi stearat 4mg vđ Erapac vđ vđ Vđ Tiến hành: - Dƣợc chất erapac nghiền, rây giống phần - Tá dƣợc trơn rây qua rây 180mm - Trộn khối bột theo nguyên tắc đồng lƣợng Tiến hành đóng nang theo công thức kiểm tra độ đồng khối lƣợng theo nguyên tắc nêu  Kết cho thấy ba công thức đạt độ đồng khối lƣợng - 3.8.4 Xác định tá dược rã Kiểm tra độ rã bốn công thức nang thuốc AMFB4, AMFB5, AMFB6, AMFB7 theo chuyên luận 11.6 PL-226 Dƣợc Điển Việt Nam 4: - Dùng thiết bị thử độ rã Erwaka để thử - Môi trƣờng thử nƣớc cất - Nhiệt độ thử 37 độ - Cho vào ống thử viên nang - Dùng đĩa đậy đậy ống thử - Treo giá ống thử vào cốc môi trƣờng chuẩn bị trƣớc - Vận hành thiết bị, theo dõi thời gian rã viên nang Tiến hành tƣơng tự với mẫu viên  Sau thử bốn mẫu nang ta thấy khả rã công thức AMFB5 tốt Tuy nhiên khả rã(thấm nƣớc) khối bột chƣa đƣợc tốt  Cần lựa chọn thêm tá dƣợc rã để tăng khả rã bột Tiến hành thử thêm tá dƣợc rã Natri Croscarmellose với tỷ lệ khác theo bảng sau: 82 Thành phần Công thức AMFB8 AMFB9 AMFB10 Dƣợc chất 50mg 50mg 50mg Natri lauryl sulfat 4mg 4mg 4mg Aerosil 5mg 5mg 5mg Natri croscarmellose 15mg 30mg 40mg Vđ vđ Vđ Erapac Tiến hành thử độ rã ba công thức AMFB8, AMFB9, AMFB10 theo chuyên luận Các bƣớc tiến hành giống nhƣ làm với mẫu nang AMFB,5,6,7  Kết cho thấy cơng thức nang AMFB8 có độ rã tốt  Chọn công thức phối trộn bột cuối AMFB8 3.9 Đánh giá an toàn thực phẩm chức Bảng 3.6 Kết đánh giá an toàn thực phẩm chức AMF3 STT 10 11 Tên tiêu thử Protein* Béo* Độ ẩm Tro tổng Carbonhydrat Đơn vị % % % % % Phƣơng pháp thử TCVN 8125:2009 AOAC 2003.05.2012 Dƣợc điểnViệt Nam IV “ Food energy method of analysis and conversion factor TCVN 7602:2007 TCVN 7603:2007 AOAC 986.15.2012 TCVN 7604:2007 HD/HS1/118 Kết 1,05 7,99 2,39 0,33 88,99 Chì* mg/kg KPH (LOD = 0,02) Cadimi mg/kg KPH (LOD = 0,02) Asen* mg/kg KPH (LOD = 0,5) Thủy ngân* mg/kg KPH (LOD = 0,05) Aflatoxin B1* µg/kg KPH (LOD = 0,1) Vi sinh vật hiếu < 1,0 x 101 CFU/g TCVN 4884:2005 khí* 12 E Coli* CFU/g TCVN 7924-2:2008 KPH ( < 1,0 x 101) 13 Coliforms* CFU/g TCVN 6848:2007 < 1,0 x 101 14 S aureus* CFU/g TCVN 4830-1:1999 KPH ( < 1,0 x 101) 15 Salmonella* /25g TCVN 4829:2005 KPH 16 Cl perfringens* CFU/g TCVN 4991:2005 KPH ( < 1,0 x 101) 17 Tổngsố men< 1,0 x 101 CFU/g TCVN 8275-2:2010 mốc* Ghichú: (*) tiêu công nhận VILAS (ISO/IEC 17025:2005) KPH không phát hiện; 83 3.9.1 Thử nghiệm độc tính cấp sản phẩm TPCN Veda- K+ Trong thí nghiệm chúng tơi, Độc tính cấp đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Dodehe Yeo cộng (2012), N‟dia Kouadio Frédéri cộng (2013), Aristide Traore cộng (2014) Sau cho uống thực phẩm chức AMF3chuột đƣợc theo dõi liên tục vòng 24 biểu chức năng, tiếp tục theo dõi thời gian từ 24-72 giờ, đồng thời đếm số lƣợng chuột chết lô vòng 72 Theo dõi tiếp biểu chuột sau 14 ngày Kết thử nghiệm cho thấy: - Thực phẩm chức AMF3 cho thấy khơng có độ độc cấp tính, an tồn uống liều cao - Khơng xác định đƣợc liều độc tính cấp hay liều gây chết 50% động vật thí nghiệm viên thực phẩm chức AMF3do chuột không bị chết mức liều cao tối đa 20g/kgP 3.9.2 Thử nghiệm độc tính bán trường diễn sản phẩm TPCN AMF3 Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Cristiani Bürger cộng (2005), Pillaia Gvà cộng (2011), Ramaswamy S R cộng (2012) Bao gồm nghiên cứu thay đổi lông, theo dõi khả thu nhận thức ăn, khả di chuyển so với lô đối chứng, nghiên cứu q trình thay đổi khối lƣợng chuột thí nghiệm nhƣ ảnh hƣởng việc sử dụng thực phẩm chức AMF3 đến số tiêu huyết học, enzym chức gan, thận Kết qua cho thấy thực phẩm chức AMF3 liều nghiên cứu cho uống bán trƣờng diễn liên tục thời gian tuần:  Khơng ảnh hƣởng đến biểu bên ngồi động vật thí nghiệm  Khơng ảnh hƣởng đến tăng trọng lƣợngcủa động vật thí nghiệm  Khơng ảnh hƣởng đến số tiêu huyết học hóa sinh máu  Khơng ảnh hƣởng đến quan nội tạng thể Hay nói cách khác, thực phẩm chức AMF3 an toàn cho động vật uống tuẩn liên tục 84 Hình 3.36 Thử nghiệm độc tính actetogenin chuột 85 KẾT LUẬN Chiết tách hợp chất acetogenin xác định phân đoạn cao chiết giàu hoạt chất acetogenin từ mãng cầu xiêm Thu đƣợc kg cao chiết chứa 35-40 % hoạt chất nhóm acetogenins từ mãng cầu xiêm; Phân lập xác định cấu trúc 03 hợp chất acetogenin làm chất chuẩn: spinencin, annonacin squamocin; Phân tích hàm lƣợng acetogenin phân đoạn giàu acetogenin thử hoạt tính gây độc tế bào sản phẩm cao chiết chứa hoạt chất acetogenin Thử hoạt tính sinh học số hợp chất acetogenin Báo cáo dƣợc tính sản phẩm cao chiết chứa hoạt chất nhóm acetogenins từ mãng cầu xiêm (ức chế ung thƣ độc tính thử nghiệm in vivo) dòng tế bào ung thƣ: A549 (ung thƣ phổi), MCF-7 (ung thƣ vú) NTUB1 (ung thƣ bàng quang); Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết thu nhận cao chiết chứa hoạt chất acetogenins từ mãng cầu xiêm, quy mô 10kg nguyên liệu/mẻ; Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm chức chứa hoạt chất acetogenin từ mãng cầu xiêm: tối ƣu hóa q trình chiết dịch mãng cầu xiêm, yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết; Tạo thực phẩm chức chứa hoạt chất nhóm acetogenins từ mãng cầu xiêm đánh giá an tồn thực phẩm chức Thử nghiệm độc tính cấp sản phẩm TPCN AMF3 Thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn sản phẩm TPCN AMF3 Sản xuất đƣợc 10 kg thực phẩm chức chứa hoạt chất nhóm acetogenins từ mãng cầu xiêm dạng bột; 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO Gleye C, Duret P, Laurens A, Hocquemiller R, Cave´ A, (1998), cisMonotetrahydrofuran Acetogenins from the roots of Annona muricata, J Nat Prod., 61, pp 576-579 A C de Q Pinto;M C R Cordeiro; S R M de Andrade;F R Ferreira;H A de C Filgueiras;R E Alves;D I Kinpara, Annona species, (2005), First published by: International Centre for Underutilised Crops, University of Southampton, Southampton, SO17 1BJ, UK Ds Trần Việt Hƣng (biên soạn), Từ điển thảo mộc dƣợc học Nguyễn Tiến Bân (2000), Họ Na (Annonaceae), Thực vật chí Việt Nam, Flora of Vietnam, Nhà xuất khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Yu D Y (1999), Recent works on anti-tumor constituent from Annonaceae plants in China, Pure Appl Chem., 71 (6), pp 1119-1122 Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Victica D, et al (1991), “New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents”, Eur J Cancer , 27, pp 1162-1168 http://ich.ac.vn/Main.aspx?MNU=237&Style=1&ChiTiet=223 Đỗ Thị Thu Hƣơng, Trần Văn Sung, Nguyễn Hải Nam, Ahn Byung Zun (2004), “Tổng hợp hoạt tính độc tế bào mốt số dẫn xuất 4`,5,6-Trihidroxy3,3`,7-trimetoxyflavon đƣợc phân lập từ Miliusa Balansae”, Tạp chí hóa học, T 42 (1), Tr 57 – 60 Lã Đình Mỡi (chủ biên) cs, 2009, Tài nguyên thực vật Việt Nam Những chứa hợp chất có hoạt tính sinh học, Tập 2, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội 10 Ratnayake, S., J.K Rupprecht, W.M Potter, and J.L McLaughlin (1993), “Evaluation of the pawpaw tree, Asimina triloba (Annonaceae), as a commercial source of the pesticidal annonaceous acetogenins”, J Janick and J.E Simon (eds.), New crops Wiley, New York , pp 644-648 11 Ahammadsahib K I., Hollingworth R M., McGovren J P., Hui Y H., McLaughlin J L., Mode of action of bullatacin: A potent antitumor and pesticidal Annonaceous acetogenin, (1993), Life Sci., 53, pp 1113-1120 87 12 Emerson F Q., Francüois R., Olivier L., Laurent S., Andre´ C., (1997), Spinencin, a New Bis-tetrahydrofuran Acetogenin from the Seeds of Annona spinescens, J Nat Prod., 60, 760-765 13 Shi E G; Alfonso D; Fatope M O; Zeng L; Gu Z M; Zhao G X; He K; MacDougal J M; McLaughlin J L J Am.Chem Soc 1995, 117, pp 1040910410 14 Shi G; Kozlowski J F; Schwedler J T; Wood K V; MacDougal J M; McLaughlin J L J Org Chem, 1996, 61, pp 7988-7989 15 Chang F R, Wu Y C, Novel Cytotoxic Annonaceous Acetogenins from Annona muricata,(2001), J Nat Prod, 64, pp 925-931 16 Gleye C, Laurens A, Laprévoete O, Serani L, Hocquemillre R, Isolation and structure elucidation of sabadelin, an acetogenin from roots of Annona muricata, (1999), Phytochemistry 52, pp 1403-1408 17 Gleye C, Laurens A, Hocquemiller Cave´ R A, Isolation of Montecristin, a Key Metabolite in Biogenesis of Acetogenins from Annona muricata and Its Structure Elucidation by Using Tandem Mass Spectrometry, (1997), J Org Chem., 62, pp 510-513 18 Gleye C, Laurens A, Hocquemiller R, Laprévote O, Serani L, Cavé A, Cohibins A and B, Acetogenins from roots of Annona muricata, (1997), Phytochemistry, Vol, 44, pp 1541-1545 19 Gleye C, Raynaud S, Fourneau C, Laurens A, Laprévote O, Serani L, Fournet A, Hocquemiller R, Cohibins C D, Two Important Metabolites in the Biogenesis of Acetogenins from Annona muricata and Annona nutans, (2000), J Nat Prod., 63, pp 1192-1196 20 Jaramillo M C, Arango G J, González M C, Robledo S M, Velez I D, Cytotoxicity and antileishmanial activity of Annona muricata pericarp, (2000), Fitoterapia 71, pp 183-186 21 Kim G S, Zeng L, Alali F, Rogers L L, Wu F E, McLaughlin J L, Sastrodihardjo S, Two New Mono-Tetrahydrofuran Ring Acetogenins, Annomuricin E and Muricapentocin, from the Leaves of Annona muricata, (1998), J Nat Prod.,61, pp 432-436 22 Li C M, Tan N H, Lu Y P, Liang H L, Mu Q, Zheng H L, Hao X J, 88 Zhou J, Annomuricatin A, a new cyclopeptide from the seeds of Annona muricata, (1995), Acta Botanica Yunnanica, 17(4), pp 459-462 23 Li C M, Tan N H, Zheng H L, Mu Q, Hao X J, He Y N, Zou J, Cyclopeptide from the seeds of Annona muricata, (1998), Phytochemistry, Vol 48, pp 555-556 24 Li D Y, Yu J G, Luo X Z, Yang S L, Muricatenol, a Linear Acetogenin from Annona muricata (Annonaceae), (2000), Chinese Chemical Letters Vol, 11, pp, 239-242 25 Liaw C C, Chang F R, Lin C Y, Chou.C.J, Chiu.H.F, Wu M J, and Wu Y C, (2002), New Cytotoxic Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins from Annona muricata, J Nat Prod., 65, pp 470-475 26 Qin Y P., Pan X P Chen R Y., Yu D Q (1996), Acta Pharm Sin, 31, 381 – 386 27 Wélé A, Zhang Y, Caux C, Brouard J.P, Pousset J.P, Bodo B, Annomuricatin C, a novel cyclohexapeptide from the seeds of Annona muricata, (2004), C R Chimie 7, pp 981–988 89 ... nghệ thực phẩm Tên đề tài: ? ?Nghiên cứu hoạt tính hợp chất acetogenin xây dựng quy trình sản xuất Thực phẩm chức từ Mãng cầu xiêm" Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần hóa học thử hoạt tính. .. Nghiên cứu thành phần hóa học thử hoạt tính hợp chất acetogenin Mãng cầu xiêm - Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm chức từ Mãng cầu xiêm Họ tên cán hƣớng dẫn : PGS.TS Trần... nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Trần Đình Thắng Cán duyệt: Ths Hoàng Văn Trung Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nghiên cứu hoạt tính hợp chất acetogenin xây dựng quy trình sản xuất Thực phẩm chức