Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết rong sagassum tenerrimum thu hoạch tại vùng biển khánh hòa

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT RONG SARGASSUM TENERRIMUM THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Thu Hà Mã số sinh viên: 57137193 Khánh Hòa, tháng 07 năm 2019 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHÂM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT RONG SARGASSUM TENERRIMUM THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Thu Hà Mã số sinh viên: 57137193 Khánh Hòa, tháng 07 năm 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu thân Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận án hồn tồn trung thực chưa có cơng bố nghiên cứu khoa học Khánh Hòa, ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực Hoàng Thị Thu Hà ii LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp thành năm học tập, trau dồi kiến thức Trường Đại Học Nha Trang Để hoàn thành đồ án này: Trước hết em xin gởi đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm, Phịng Đào Tạo niềm kính trọng, tự hào học tập trường năm vừa qua Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn chân thành biết ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Thế Hân, người trực tiếp hướng dẫn động viên em suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ thầy giáo khoa Công Nghệ Thực Phẩm tập thể cán Phịng Thí Nghiệm-Trung Tâm Thực Hành Thí Nghiêm- Trường Đại Học Nha Trang, trung tâm thơng tin- Thư viện giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian em thực đồ án Cuối em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè người ln bên cạnh động viên, khích lệ tạo động lực để em vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu vừa qua Tuy có nhiều nổ lực, cố gắng không tránh khỏi sai sót thực đồ án Em mong nhận sựu đóng góp từ thầy cơ, bạn bè để đề tài em hồn thiện với chất lượng tốt Khánh Hòa, ngày tháng năm 2019 Sinh viên thực Hoàng Thị Thu Hà iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer rong biển 1.1.1 Bệnh Alzheimer 1.1.1.1 Khái niệm bệnh Alzheimer 1.1.1.2 Các đặc điểm bệnh Alzheimer 1.1.1.3 Tình hình bệnh Alzheimer ngồi nước 1.1.1.4 Điều điều trị bệnh Alzheimer 1.1.2 Acetylcholine, enzyme acetylcholinesterase giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer .7 1.1.2.1 Acetylcholin 1.1.2.2 Enzyme acetylcholinesterase 1.1.2.3 Giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 1.1.3 Tổng quan rong biển .8 1.1.3.1 Giới thiệu rong mơ Sargassum tenerrimum .10 1.1.3.2 Thành phần hóa học rong mơ 11 1.1.3.3 Ứng dụng rong mơ 12 1.2 Cơ sở lý thuyết 12 1.2.1 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 12 1.2.1.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman .12 1.2.1.2 Phương pháp thuốc thử muối Fast Blue B 14 1.2.2 Giới thiệu trình chiết 15 1.2.2.1 Cơ sở trình chiết .15 1.2.2.2 Các phương pháp tách chiết dung môi 16 1.2.2.3 Một số phương pháp tách chiết khác 17 iv 1.2.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 18 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 20 1.3.1 Các nghiên cứu nước 20 1.3.2 Các nghiên cứu giới 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất 23 2.1.1 Nguyên liệu rong Sargassum tenerrimum .23 2.1.2 Hóa chất thuốc thử 23 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiêm tổng quát 24 2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase 26 2.2.2.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi chiết .26 2.2.2.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết 28 2.2.2.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết 29 2.2.2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian chiết .30 2.2.3 Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn dịch chiết 31 2.3 Phương pháp phân tích 32 2.3.1 Phương pháp định lượng số thành phần hóa học có rong .32 2.3.2 Phương pháp định tính số hợp chất dịch chiết methanol mẫu rong 32 2.3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase 33 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 Kết định lượng định tính số thành phần có rong Sargassum tenerrimum 35 3.1.1 Kết định lượng số thành phần hóa học có rong 35 3.1.2 Kết định tính số hợp chất có dịch chiết .36 3.2 Kết ảnh hưởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinesterase rong Sargassum tenerrimum 37 3.2.1 Kết ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi .37 3.2.2 Kết ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết 40 3.2.3 Kết ảnh hưởng nhiệt độ chiết 42 3.2.4 Kết ảnh hưởng thời gian chiết 44 v 3.3 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase dịch chiết rong điều kiện thích hợp 45 3.4 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase phân đoạn dung môi chiết rong Sargassum tenerrimum .47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .52 4.1 Kết luận .52 4.2 Kiến nghị .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC .62 Phụ lục Xác định số thành phần hoá học có rong 62 Phụ lục Cách tiến hàn đánh giá hoạt tính ức chế enzyme 65 Phụ lục Kết đo quang xác định ảnh hưởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme AChE rong Sargassum tenerrimum 67 Phụ lục Kết đo quang xác định khả ức chế enzyme AChE phân đoạn dịch chiết rong Sargassum tenerrimum .68 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Absorbance (Độ hấp thụ) ACh Acetylcholine AChE Enzym actylcholinesterase ACTI Acetylthiocholine iodid DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic DMSO Dimethyl sulfoxide NL/DM Nguyên liệu/dung môi IU International Unit (Đơn vị quốc tế) IC50 Inhibitory Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzyme) SD Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) STT Số thứ tự TLC Thin-layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) vii DANH MỤC BẢNG Bảng2 Các phương pháp định tính hợp chất tự nhiên 33 Bảng 3.1 Thành phần hóa học có rong Sargassum tenerrimum 35 Bảng 3.2 Định tính số hợp chất dịch chiết rong Sargassum tenerrimum 36 Bảng 3.3 Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase (IC50) loại rong biển khác 46 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ rong Sargassum tenerrimum 51 viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ q trình sinh tổng hợp acetylcholine Hình 1.2 Rong mơ Sargassum tenerrimum 10 Hình 1.3 Quá trình diễn phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 13 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase 27 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase 28 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase 29 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase 30 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm tách phân đoạn dịch chiết rong 31 Hình 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khả ức chế enzyme acetylcholinsterase rong Sargassum tenerrimum (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05) .38 Hình 3.2 Kết ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinsterase rong Sargassum tenerrimum (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05) .40 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinsterase rong Sargassum tenerrimum (Chữ cột khác khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 42 Hình 3.4 Kết ảnh hưởng thời gian chiết đến khả ức chế enzyme acetylcholinsterase rong Sargassum tenerrimum 44 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả ức chế acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết rong Sargassum tenerrimum 46 Hình 3.6 Khả ức chế enzyme acetylcholinesterase nồng độ khác phân đoạn dịch chiết rong Sargassum tenerrimum 49 56 brown alga Eisenia bicyclis”, Archives of Pharmacal Research, 38, 14771487 32 Cummings, J L., & Cole, G (2002), “Alzheimer disease”, Jama, 287, 23352338 33 Cuong, D X., Boi, V N., & Van, T T T (2016), “Effect of storage time on phlorotannin content and antioxidant activity of six Sargassum species from Nhatrang Bay, Vietnam”, Journal of applied phycology, 28, 567-572 34 Demirel, Z., Yilmaz-Koz, F F., Karabay-Yavasoglu, U N., Ozdemir, G., & Sukatar, A (2009), “Antimicrobial and antioxidant activity of brown algea from the Aegean Sea”, 74, 89-115 35 Di Giovanni S., Borloz A Urbain A et al (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic Acetylcholinsterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 33, 109-119 36 Ellmam G.L., Courtney K D., Andres V Et al (1961), “A new and rapid colorimetric determination of Acetylcholinsterase activity”, Biochemical pharmacology, 88-95 37 Foon, T S., Ai, L A., Kuppusamy, P., Yusoff, M M., & Govindan, N (2013) “Studies on in-vitro antioxidant activity of marine edible seaweeds from the east coastal region of Peninsular Malaysia using different extraction methods”, Journal of Coastal Life Medicine, 1, 193-198 38 Francis, P T., Palmer, A M., Snape, M., & Wilcock, G K (1999), "The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress", Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66, 137-147 39 Ganesan, P., Kumar, C S., & Bhaskar, N (2008), “Antioxidant properties of methanol extract and its solvent fractions obtained from selected Indian red seaweeds”, Bioresource technology, 99, 2717-2723 40 Ghannadi, A., Plubrukarn, A., Zandi, K., Sartavi, K., & Yegdaneh, A (2013), “Screening for antimalarial and acetylcholinesterase inhibitory activities of some Iranian seaweeds”, Research in Pharmaceutical Sciences, 8(2), 113– 118 57 41 Hardy, J A., & Higgins, G A (1992) Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis Science, 256, 184-186 42 Herodez, S S., Hadolin, M., Skerget, M., Knez, Z (2003), “Solvent extraction study of antioxidant from Balm (Melissa officinalis L.) leavcs”, Food Chemistry, 80, 275-282 43 Hifney, A F., Fawzy, M A., Abdel-Gawad, K M., & Gomaa, M (2016), “Industrial optimization of fucoidan extraction from Sargassum sp and its potential antioxidant and emulsifying activities”, Food hydrocolloids, 54, 7788 44 Houghton, P J., Ren, Y., & Howes, M J (2006), “Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi” Natural Product Report, 23, 181-199 45 Ioana, I.; Irina V and Valentin, I.P (2001), “A Critical review of methods for characterization of polyphenol compounds in fruits and vegetables”, Food Chemistry, 12, 1821-1835 46 Ismail, G A (2017), “Biochemical composition of some Egyptian seaweeds with potent nutritive and antioxidant properties”, Food Science and Technology, 37, 294-302 47 Janarthanan, M., & Kumar, M S (2013), “Qualitative and quantitative analysis of phytochemical studies on selected seaweeds acanthopora spicifera and sargassum wightii”, International Journal of Engineering Research and Development, 7, 11-5 48 Jhoo, J H., Kim, K W., Huh, Y., Lee, S B., Park, J H., Lee, J J., & Lee, D Y (2008), “Prevalence of Dementia and Its Subtypes in an Elderly Urban Korean Population: Results from the Korean Longitudinal Study on Health and Aging (KLoSHA)”, Dement Geriatr Cogn Disord, 2008; 26, 270–276 49 JI, N K., Kumar, R N., Bora, A., Amb, M K., & Chakraborthy, S (2009), “An evaluation of the pigment composition of eighteen marine macroalgae collected from Okha coast, Gulf of Kutch, India”, Our nature, 7, 48-55 50 Kanimozhi, A S., Johnson, M., & Malar, T R (2015), “Phytochemical composition of Sargassum Polycystum C Agardh and Sargassum Duplicatum J Agardh”, Int J Pharm Pharm Sci, 7, 393-7 58 51 Kannan, R R., Aderogba, M A., Ndhlala, A R., Stirk, W A., & Van Staden, J (2013), “Acetylcholinesterase inhibitory activity of phlorotannins isolated from the brown alga, Ecklonia maxima (Osbeck) Papenfuss”, Food Research International, 54, 1250-1254 52 Khadri A., Neffati M., Smiti S (2010), "Antioxidant, antiacetylcholinsterase and antimicrobial activities of Cymbopogon schoenanthus L Spreng (lemon grass) from Tunisia", LWT - Food Science and Technology, 43, 331-336 53 Khanavi, M., Nabavi, M., Sadati, N., Shams Ardekani, M., Sohrabipour, J., Nabavi, S M B., & Ostad, S N (2010), Cytotoxic activity of some marine brown algae against cancer cell lines , Biological Research, 43, 31-37 54 King, J W (2002), “Supercritical Fluid Technology for Lipid Extraction, Fractionation and Reaction”, Lipid Biotechnology, 663-687 55 Kumar, P., Senthamilselvi, S., & Govindaraju, M (2013), “GC–MS profiling and antibacterial activity of Sargassum tenerrimum”, Journal of Pharmacy Research, 6, 88-92 56 Kumar, P., Senthamil Selvi, S., Lakshmi Prabha, A., Prem Kumar, K., Ganeshkumar, R S., & Govindaraju, M (2012), “Synthesis of silver nanoparticles from Sargassum tenerrimum and screening phytochemicals for its antibacterial activity”, Nano Biomed Eng, 4, 12-16 57 Li, Y X., Wijesekara, I., Li, Y., & Kim, S K (2011), “Phlorotannins as bioactive agents from brown algae”, Process Biochemistry, 46, 2219-2224 58 Li, Y., Fu, X., Duan, D., Liu, X., Xu, J., & Gao, X (2017), “Extraction and identification of phlorotannins from the brown alga, Sargassum fusiforme (Harvey) Setchell”, Marine Drugs, 15, 49 59 Machado, L P., Carvalho, L R., Young, M C M., Cardoso-Lopes, E M., Centeno, D C., Zambotti-Villela, L., & Yokoya, N S (2015), “Evaluation of acetylcholinesterase inhibitory activity of Brazilian red macroalgae organic extracts”, Revista Brasileira de Farmacognosia, 25, 657-662 60 Mæhre, H K., Malde, M K., Eilertsen, K E., & Elvevoll, E O (2014), “Characterization of protein, lipid and mineral contents in common Norwegian 59 seaweeds and evaluation of their potential as food and feed”, Journal of the Science of Food and Agriculture, 94, 3281-3290 61 Manivannan, K., Thirumaran, G., Devi, G K., Hemalatha, A., & Anantharaman, P (2008), “Biochemical composition of seaweeds from Mandapam coastal regions along Southeast Coast of India”, AmericanEurasian Journal of Botany, 1, 32-37 62 McDermid, K J., & Stuercke, B (2003), “Nutritional composition of edible Hawaiian seaweeds”, Journal of Applied Phycology, 15, 513-524 63 McGleenon, B M., Dynan, K B., & Passmore, A P (1999), « Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer’s disease”, British journal of clinical pharmacology, 48, 471 64 Murakami, K., Yamaguchi, Y., Noda, K., Fujii, T., Shinohara, N., Ushirokawa, T., & Katayama, M (2011), “Seasonal variation in the chemical composition of a marine brown alga, Sargassum horneri (Turner) C Agardh”, Journal of Food Composition and Analysis, 24, 231-236 65 Nurjanah, N M., Anwar, E., Luthfiyana, N., & Hidayat, T (2017), “Identification of bioactive compounds of seaweed Sargassum sp and Eucheuma cottonii doty as a raw sunscreen cream”, Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences: B Life and Environmental Sciences, 54, 311318 66 Peng, L., Rong, Z., Wang, H., Shao, B., Kang, L., Qi, H., & Chen, H (2017), “A novel asay to determine Acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer’s disease”, Biomedical Chromatography, 31, 3971 67 Peng, Y., Xie, E., Zheng, K., Fredimoses, M., Yang, X., Zhou, X., & Liu, Y (2013), “Nutritional and chemical composition and antiviral activity of cultivated seaweed Sargassum naozhouense Tseng et Lu”, Marine drugs, 11, 20-32 68 Pereira, R P., Boligon, A A., Appel, A S., Fachinetto, R., Ceron, C S., Tanus-Santos, J E., & Rocha, J B T (2014), “Chemical composition, 60 antioxidant and anticholinesterase activity of Melissa officinalis”, Industrial Crops and Products, 53, 34-45 69 Renaud, S M., & Luong-Van, J T (2006), “Seasonal variation in the chemical composition of tropical Australian marine macroalgae”, In Eighteenth International Seaweed Symposium, 55-161 70 Rengasamy, K R., Amoo, S O., Aremu, A O., Stirk, W A., Gruz, J., Šubrtová, M., & Van Staden, J (2015), “Phenolic profiles, antioxidant capacity, and acetylcholinesterase inhibitory activity of eight South African seaweeds”, Journal of applied phycology, 27, 1599-1605 71 72 73 74 75 76 77 78 79 Robledo, D., Freile-Pelegrin, Y., 1997, “Chemical and mineral composition of six potentially edible seaweed species of Yucata´n”, Botanica Marina, 40, 301–306 Satheeshkumar, N., Mukherjee, P K., Bhadra, S., & Saha, B P (2010), “Acetylcholinesterase enzyme inhibitory potential of standardized extract of Trigonella foenum graecum L and its constituents”, Phytomedicine, 17, 292-295 Spigno, G., Tramelli, L., & De Faveri, D M (2007), “ Effects of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics”, Journal of Food Engineering, 8, 200-208 Suffiness, M (1989) “Development of antitumor natural products at the National Cancer Institute”, Gann Monograph on Cancer Research, 36, 21-44 Suganthy, N., Karutha Pandian, S., & Pandima Devi, K (2010), “Neuroprotective effect of seaweeds inhabiting South Indian coastal area (Hare Island, Gulf of Mannar Marine Biosphere Reserve): Cholinesterase inhibitory effect of Hypnea valentiae and Ulva reticulata”, Neuroscience Letters, 468, 216–219 Tang, Z M., Wang, Z Y., & Kang, J W (2007), “Screening of Acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophortically mediated microanalysis techique”, Electrophoresis, 360365 Thoudam, B., T., Kirithika, T., Kamala, S.K and Usha, D.K (2011), “Phytochemical screening and antioxidant activity of various extracts of Sargassum muticum”, 3, 25-30 Trigui, M., Gasmi, L., Zouari, I., & Tounsi, S (2013), “Seasonal variation in phenolic composition, antibacterial and antioxidant activities of Ulva rigida (Chlorophyta) and assessment of antiacetylcholinesterase potential”, Journal of Applied Phycology, 25, 319-328 Van Asperen, K (1962), “A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method”, Journal of Insect Physiology 8, 401-416 61 80 81 82 83 84 85 86 87 88 Vijayabaskar, P., & Vaseela, N (2012 ), “In vitro antioxidant properties of sulfated polysaccharide from brown marine algae Sargassum tenerrimum”, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2, 890-896 Vinatoru, M (2001), “An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs”, Ulrtrasonics sonochemistry, 8, 303-313 Wang, W., Wu, S., Cheng, X., Dai, H., Ross, K., Du, X., & Yin, W (2000), “Prevalence of Alzheimer’s Disease and Other Dementing Disorders in an Urban Community of Beijing, China”, Neuroepidemiology 2000;19, 194–200 Wells, M J (2003), “Principles of extraction and the extraction of semivolatile organics from liquids”, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, 37-138 Whitehouse, P J., Price, D L., Struble, R G., Clark, A W., Coyle, J T., & Delon, M R (1982), “Alzheimer's disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain”, Science, 215, 1237-1239 Wong, B Y., Tan, C P., & Ho, C W (2013), “Effect of solid-to-solvent ratio on phenolic content and antioxidant capacitics of Dukung Anak”, International Food Research Journal, 20 Yadav, M., Chatterji, S., Gupta, S K., & Watal, G (2014), “Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine”, Int J Pharm Pharm Sci, 6, 539-542 Yoon, N Y., Lee, S H., Li, Y., & Kim, S K (2009), “Phlorotannins from Ishige okamurae and their acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitory effects”, Journal of Functional Foods, 1, 331–335 Yoon, N Y., Chung, H Y., Kim, H R., & Choi, J E (2008), “Acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitory activities of sterols and phlorotannins from Ecklonia stolonifera”, Fisheries Science, 74, 200-207 62 PHỤ LỤC Phụ lục Xác định số thành phần hố học có rong Phụ lục 1.1 Kết xác định độ ẩm rong nguyên liệu Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc rửa để khô, sấy nhiệt độ 1050C khoảng 1h, lấy làm nguội bình hút ẩm đem cân, sau cho cốc vào sấy tiếp điều kiện trên, lấy làm nguội bình hút ẩm đem cân sấy khối lượng hai lần cân liên tiếp sai khác không 5.10-4g (khối lượng không đổi) Cân xác 3g rong mơ cho vào cốc sấy đến khối lượng không đổi Cho cốc vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 1050C khoảng 4h đồng hồ Lấy mẫu để nguội bình hút ẩm, cân sấy cho đến khối lượng không đổi Công thức xác định hàm lượng ẩm: W=(G1-G2)/G1-G)*100% Trong đó: W: Độ ẩm nguyên liệu (%) G: Khối lượng cốc sau sấy đến khối lượng không đổi (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc mẫu sau sấy (g) Kết cho thấy rong sau phơi khô để sử dụng cho q trình nghiên cứu có độ ẩm tương đối, tương ứng 18,52% Số lần lặp Khối lượng cốc sấy (G) 38,3611 36,2868 Khối lượng Khối lượng cốc + mẫu cốc + mẫu sau trước sấy sấy (G1) (G2) 41,3811 40,8159 39,2868 38,7368 Độ ẩm (%) Trung bình 18,72 18,33 18,52% ± 0,276 Phụ lục 1.2 Hàm lượng tro rong nguyên liệu Cho vào chén sứ 5g rong Cân tất phân tích với độ xác Cho tất vào lò nung nâng nhiệt độ từ từ 550 – 6000C Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thường khoảng Trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 HNO3 đậm đặc nung lại đến tro trắng 63 Để nguội bình hút ẩm cân Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân lượng khơng đổi Tính tốn kết quả: Hàm lượng tro theo % tính theo cơng thức X = (G2 - G)/(G1 - G)*100(%) Trong G: trọng lượng chén (g) G1: lượng chén mẫu trước nung (g) G2: lượng chén mẫu sau nung (g) Tiến hành làm thí nghiệm để xác định hàm lượng tro nguyên liệu Kết cho thấy hàm lượng tro rong chiếm 18,43% trọng lượng khô rong Số lần lặp Khối lượng cốc nung (G) Khối lượng Khối lượng Hàm cốc + mẫu cốc + mẫu sau lượng tro trước khi nung (%) nung (G2) (G1) 38,3638 41,3638 39,1524 26,29 30,2171 33,2171 31,1236 30,22 Phụ lục 1.3 Cách xác định hàm lượng lipid rong mơ khơ Trung bình 28,26% ± 2,78 Cân gam rong nghiền nhỏ cho vào cốc - Cho thêm 600 µl nước cất, 5ml methanol Ngâm mẫu dung môi khoảng 10 phút - Đồng hóa mẫu máy phút - Lọc, lấy dịch lọc - Cho thêm 5ml methanol 10ml Chloroform vào cốc đồng hóa 20 giây - Lọc, lấy dịch lọc cho vào phểu chiết - Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào dung dịch mẫu Đảo trộn ngược phểu nhiều lần giữ mẫu °C khoảng 4h để dịch mẫu phân chia thành lớp  Chiết rút dung dịch lipid - Tách lớp (chứa hàm lượng lipid hịa tan dung mơi) cho chảy vào phểu chiết 250ml Loại bỏ lớp phía (chứa phần hóa hợp gồm tạp chất loại nước, muối, protein,…) 64 - Xác định thể tích chiết (Vdm) - Cho thêm 5ml CH3OH 50% vào mẫu phểu chiết Đảo trộn ngược phểu chiết nhiều lần - Cho phân chia thành hai lớp lắng qua đêm 0C  Định lượng lipid - Lớp chiết rút chảy xuống nình cầu quay - Cơ quay chân khơng làm bay dung mơi bình cầu 370C đến cịn lại thể tích khoảng 1ml - Hịa tan mẫu lại lượng thể tích nhỏ Chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc nhỏ lượng mẫu làm khơ với khơng khí) - Chuyển qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần định mức Chloroform vừa đủ 5ml - Sau xử lý xong, dung dịch mang xác định hàm lượng lipid tổng  Xác định hàm lượng lipid tổng - Lấy xác 2ml (Vm) dung dịch mẫu xử lý, cho vào cốc sấy cân đến khối lượng không đổi - Cho vào tủ sấy đén khối lượng không đổi - Lipid tổng số (%) tính theo cơng thức: %X(g⁄g) = (m1 − m0 ) ∗ Vdm ∗ 100 m ∗ T ∗ Vm Trong đó: X: hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô mẫu m1: trọng lượng cốc mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi (g) m0: trọng lượng cốc sấy đến khối lượng không đổi (g) m: trọng lượng cân mẫu (g) Vdm: thể tích định mức sau xử lý (ml) 65 Vm: thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) T: thành phần khô mẫu, T=(100-W)/100 W: độ ẩm mẫu  Hàm lượng lipid rong nguyên liệu Lipid tổng số (%): %X(g⁄g) = (38,3714 − 38,3638) ∗ 4,25 ∗ 100 ∗ 0,82 ∗ =0,463% Trong đó: X: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô mẫu Trọng lượng cốc mẫu sau sấy đến khối lượng không đổi Trọng lượng cốc sấy đến khối lượng không đổi 38,3638 g Trọng lượng cân mẫu g Thể tích định mức sau xử lý 4,25 ml Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy ml Thành phần khô mẫu rong 0,82 Kết xác định hàm lượng lipid có rong nguyên liệu với hàm lượng ẩm 18,43% phương pháp Folch chiếm trọng lượng khô rong Phụ lục Cách tiến hàn đánh giá hoạt tính ức chế enzyme - Pha enzyme chất: + Pha dung dịch đệm: (được pha muối) 0,35gNaH2PO4 1,65g Na2HPO4 1000ml nước cất lần + Pha chất Acetylthiocholine iodid (ATCI): Pha chất nồng độ mM 𝑚 = 𝐶𝑀 ∗ 𝑉 ∗ 𝑀 Trong đó: m: khối lượng chất cần pha (g) CM: nồng độ chất ACTI (mM) V: tích cần pha chất ACTI (ml) 66 M: khối lượng mol chất ACTI (g/mol) + Pha enzyme acetylcholinesterase: Hút 10 ml dung dịch đệm cho vào ống enzyme lắc nhẹ, để enzyme hòa tan vào dung dịch thu enzyme nồng độ 10 IU/ml dạng lỏng Hút 5ml enzyme (10 IU/ml) pha 100ml nước cất lần thu enzyme nồng độ 0,5 IU/ml Hút enzyme pha cho vào ống nhỏ bảo quản + Pha chất thử DTNB: tương tự pha chất ACTI (3 mM) + Pha Na2CO3: nồng độ 0,1 mol cách pha tương tự pha chất - Cách pha dung dịch mẫu rong: + Dung dịch mẫu thử điều kiện chiết: Hút xác ml dịch chiết sau cô quay điều kiện (tỷ lệ NL/DM, nồng độ dung môi chiết, nhiệt độ chiết thời gian chiết) rong Sargassum tenerrimum pha 4ml nước cất Sau tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế AChE + Dung dịch mẫu thử phân đoạn: Cân xác 100 mg chất khơ phân đoạn dịch chiết n-hexane, ethyl acetate, butanol, nước xác định Hình 2.6 hịa tan hồn tồn 10 ml DMSO thu dung dịch có nồng độ 10 mg/ml Từ dung dịch có nồng độ 10 mg/ml pha lỗng thành dung dịch có nồng độ mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml mg/ml Sau tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme AChE - Quy trình đánh giá hoạt tính ức chế enzyme: + Mẫu rong: cho vào ống nghiệm 2,2 ml đệm photphat; 0,1 ml rong; 0,1 ml enzyme sau ủ 37 °C phút Tiếp theo hút 0,1 ml chất; 0,1 ml DTNB vào lắc đều, ủ 37 °C thời 30 phút sau cho 1,4 ml Na2CO3 Đo quang bước sóng 412nm + Mẫu control: cho vào ống nghiệm 2,2 ml đệm photphat; 0,1 ml nước; 0,1 ml enzyme đem ủ 37 °C phút Tiếp theo hút 0,1 ml chất; 0,1 ml DTNB vào lắc đều, ủ 37 °C vòng 30 phút sau cho 1,4 ml Na2CO3 Đo quang bước sóng 412nm + Mẫu blank: cho vào ống nghiệm 2,2 ml đệm photphat; 0,1 ml rong; 0,1 ml đệm photphat đem ủ 37 °C phút Tiếp theo hút 0,2 ml đệm photphat vào lắc đều, ủ 37 °C 30 phút sau cho 1,4 ml Na2CO3 Đo quang bước sóng 412nm 67 Phụ lục Kết đo quang xác định ảnh hưởng điều kiện chiết đến khả ức chế enzyme AChE rong Sargassum tenerrimum Phụ lục 3.1 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum tỷ lệ NL/DM khác Tỷ lệ DM/NL (g/ml) 1/10 Lần Lần 1/20 Lần Lần 1/30 Lần Lần 1/40 Lần Lần Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Blank Mẫu Control 0,097 0,359 0,556 0,098 0,368 0,544 0,089 0,296 0,602 0,092 0,307 0,594 0,077 0,265 0,609 0,073 0,273 0,625 0,065 0,343 0,583 0,069 0,322 0,575 Khả ức chế (%) Ức chế Trung bình 52,88 51,62± 1,775 50,37 65,61 64,71± 1,28 63,8 69,13 68,56± 0,799 68,00 52,32 54,16± 2,605 56,00 Phụ lục 3.2 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum nồng độ dung môi methanol khác Nồng độ dung môi (%) Lần Lần 25 Lần Lần 50 Lần Lần 75 Lần Lần 100 Lần Lần Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Blank Mẫu Control 0,068 0,064 0,061 0,06 0,073 0,074 0,094 0,093 0,056 0,057 0,493 0,482 0,465 0,467 0,396 0,381 0,295 0,295 0,481 0,487 0,591 0,603 0,612 0,599 0,602 0,599 0,587 0,601 0,542 0,569 Khả ức chế (%) Ức chế Trung bình 28,09 30,68 33,99 32,05 46,35 47,52 65,76 66,39 21,59 24,43 29,38± 1,833 33,02± 1,367 46,93± 0,831 66,07± 0,446 23,01± 2,01 Phụ lục 3.3 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum nhiệt độ khác Nhiệt độ (0C) 30 Lần Lần 45 Lần Lần 60 Lần Lần 75 Lần Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Blank Mẫu Control 0,043 0,432 0,578 0,044 0,437 0,592 0,065 0,414 0,599 0,063 0,407 0,571 0,095 0,294 0,603 0,092 0,303 0,614 0,087 0,385 0,622 Khả ức chế (%) Ức chế Trung bình 32,70 33,16± 0,648 33,61 41,74 40,75± 1,401 39,75 67,00 66,32± 0,964 65,64 52,09 53,61± 2,156 68 Lần Lần Lần 90 0,087 0,097 0,095 0,362 0,439 0,443 0,613 0,605 0,594 55,14 43,47 41,41 42,44± 1,454 Phụ lục 3.4 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum thời gian khác Thời gian (phút) 30 60 90 120 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Blank Mẫu Control 0,087 0,295 0,581 0,089 0,315 0,566 0,093 0,288 0,592 0,091 0,297 0,605 0,097 0,317 0,612 0,097 0,302 0,598 0,099 0,344 0,603 0,103 0,328 0,614 Khả ức chế (%) Ức chế 64,20 60,95 67,06 65,95 64,05 65,72 59,37 63,36 Trung bình 62,14± 2,92 66,51± 0,785 64,89± 1,179 61,36± 2,818 Phụ lục 3.5 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum nồng độ khác điều kiện thích hợp Nồng độ (mg/ml) Độ hấp thụ bước sóng 412 Khả ức chế (%) nm Blank Mẫu Control Ức chế Trung bình Lần 0,0095 0,542 0,612 12,99 14,08± 1,542 Lần 0,0093 0,531 0,615 15,17 2,5 Lần 0,021 0,519 0,604 17,55 19,19± 2,327 Lần 0,022 0,512 0,619 20,84 Lần 0,046 0,477 0,605 28,76 27,74± 1,449 Lần 0,047 0,486 0,599 26,71 7,5 Lần 0,062 0,436 0,578 35,29 36,55± 1,783 Lần 0,064 0,434 0,595 37,82 10 Lần 0,075 0,396 0,613 47,43 46,45± 1,681 Lần 0,072 0,401 0,601 45,26 12,5 Lần 0,089 0,357 0,611 56,14 54,28± 2,622 Lần 0,085 0,369 0,597 52,43 Phụ lục Kết đo quang xác định khả ức chế enzyme AChE phân đoạn dịch chiết rong Sargassum tenerrimum Phụ lục 4.1 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum phân đoạn n-Hexan Nồng độ (mg/ml) Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Khả ức chế (%) 69 0,5 1,5 2,5 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Blank 0,017 0,02 0,023 0,022 0,029 0,03 0,037 0,038 0,045 0,041 Mẫu 0,575 0,558 0,536 0,547 0,512 0,531 0,482 0,494 0,472 0,48 Ức chế 4,52 6,02 10,03 13,41 18,49 19,24 22,78 23,77 27,97 26,20 Control 0,581 0,575 0,578 0,589 0,591 0,608 0,597 0,591 0,615 0,603 Trung bình 5,20± 1,75 11,06± 0,269 18,07± 0,673 24,15± 1,851 28,88± 2,384 Phụ lục 4.2 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum phân đoạn ethyl acetate Nồng độ (mg/ml) 0,5 1,5 2,5 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Blank Mẫu Control 0,012 0,483 0,601 0,012 0,471 0,582 0,016 0,423 0,598 0,017 0,436 0,594 0,023 0,389 0,593 0,025 0,395 0,612 0,027 0,355 0,609 0,028 0,347 0,579 0,035 0,327 0,608 0,032 0,341 0,613 Khả ức chế (%) Ức chế 20,13 19,42 30,27 27,78 36,76 37,91 45,32 43,52 51,15 49,59 Trung bình 21,38± 0,351 30,70± 1,753 38,92± 0,423 45,52± 0,874 50,78± 1,684 Phụ lục 4.3 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum phân đoạn butanol Nồng độ (mg/ml) 0,5 1,5 2,5 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Độ hấp thụ bước sóng 412 nm Blank Mẫu Control 0,007 0,007 0,011 0,009 0,017 0,016 0,023 0,022 0,029 0,528 0,533 0,519 0,518 0,487 0,476 0,453 0,447 0,413 0,584 0,576 0,619 0,615 0,609 0,616 0,598 0,623 0,592 Khả ức chế (%) Ức chế (%) 10,79 8,68 17,93 17,24 22,82 25,32 28,09 31,78 35,14 Trung bình 9,73± 1,49 17,58± 0,492 24,07± 0,839 29,94± 2,608 35,80± 0,94 70 Lần 0,029 0,395 0,576 36,46 Phụ lục 4.4 Kết xác định khả ức chế AChE dịch chiết rong mơ Sargassum tenerrimum phân đoạn nước Nồng độ 1,5 2,5 Khả ức chế (%) Blank Mẫu Control Ức chế Trung bình Lần 0,001 0,589 0,607 3,13 2,23± 1,272 Lần 0,001 0,594 0,601 1,33 Lần 0,002 0,581 0,601 5,24 Lần 0,001 0,59 0,608 3,14 Lần 0,005 0,561 0,594 6,40 Lần 0,006 0,553 0,579 5,53 Lần 0,008 0,567 0,598 6,52 Lần 0,008 0,549 0,587 7,84 Lần 0,011 0,538 0,589 11,28 Lần 0,012 0,542 0,594 10,02 (mg/ml) 0,5 Độ hấp thụ bước sóng 412 nm 4,18± 1,494 5,96± 0,616 7,18± 0,93 10,65± 0,893 Phụ lục 4.5 kết qảu khối lượng chất khô phân đoạn dịch chiết Phân đoạn n-hexane Ethyl acetate butanol Nước Khối lượng (g) 1,4363 1,2370 1,7991 2,9390 ... THỰC PHÂM  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA DỊCH CHIẾT RONG SARGASSUM TENERRIMUM THU HOẠCH TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn... tannin Nhiều nghiên cứu rong biển thu hoạch vùng biển khác giới có hoạt tính ức chế enzyme AChE Ghannadi cộng (2013) chiết xuất chất ức chế acetylcholinesterase từ số rong biển Iran chiết xuất... dạng dịch chiết thô Trên đối tượng biển, đặc biệt rong biển hạn chế nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế enzyme AChE Do đó, nghiên cứu sử dụng rong mơ Sargassum 21 tenerrimum thu hái vùng biển