Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz )

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz )

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LOI CAM ON!

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi những lời cảm ơn chân

thành nhất đến:

TS Nguyễn Tường Vy

Người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua,

để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới 7S Nguyễn Hoài Nam, TS Nguyễn Tiến Đạt,

cùng các cán bộ nhân viên Viện Hóa Sinh Biển - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở

Tôi cũng xin gửi tới các thầy các cô giáo trong ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội những lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học vừa qua

Cuối cùng cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân, bạn bè những người đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận

Hà nội, ngày 09 tháng 05, năm 2012

Sinh viên

Lê Văn Thành

Chuong 1 TONG QUAN 00 ccc ccccceecseeeceeeseucecececceuesenseeeseueeeeaneeeas 3

1.1 Thure vat hoc cay Man tu6i eee cece eecceeeccaseeeceeeseseeeean 3 1.1.1 Tên và họ của loài mân tưới Eupaforium ƒortunei The 3

1.1.2 Mô tả về loài Mẫn tưới - che 3

1.1.3 Sự phân bố của loài Mân tưới trong tự nhiên - - 4 1.1.4 Thành phần hóa học của loài Mẫn tưới - << s7< << sec 4 1.1.4.1 Các công trình nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của cây

Chương 2 ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu về mặt hóa học l2 2.1.1 Hóa chất, dụng CỤ - c c0 n SH Y SH Y TY nu 12 2.1.2 Thiết bị và phương pháp nghiên cứu -c << << << sa: 12 2.2 Hóa chất, thiết bị và phương pháp đánh giá hoạt tinh enzyme 13 2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .- nh ch sen 13 2.2.2 Phương pháp nghiên cỨu - - 13

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ NHẬN XÉT 15

3.1 _ Chiết tách và phân lập các chất .-c Ss n1 Snn si 15 3.2 Xác định câu trúc hóa học các hợp chất phân lập được 18 3.2.1 Xác định câu trúc hợp chất Ì -c cv rào 18 3.2.2 Xác định câu trúc hợp chất 2 cv ky rèn 22 3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế Enzyme tyrosinase 5-2 5 «sẻ 27 3.4 Bàn luận QQQnnnnnn HH nh ky se 28

KET LUAN VA DE XUAT c.ccccccccccecceccccuecueececceceeceteeeeeeeseeen 29

KET LUAN 000 ccc ceccceecesesceccce cece esse eesuusesuecesaeseuneeseneevaseeaeeeaaas 29

DE XUAT 000 cccccccccceccccecccuecceucceeusecuucceuesecaecsensesusesaeseueseeneens 29

TAI LIEU THAM KHAO

PHU LUC

DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHU VIET TAT TRONG LUAN TLC

Nuclear Magnetic Resonance — Phố cộng hưởng từ hạt nhân ÌH-Nuclear Magnetic Resonance — Phố cộng hưởng từ hạt nhân proton

lắc Nuclear Magnetic Resonance— Phô cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Electron Spay Ionization Mass Spectrometry — Phé khéi luong phun mù điện tử

Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer — Phố phân loai Carbon khac nhau

Công thức phân tử Phân lập

Sắc ký pha đảo Sắc ký pha thuận Hop chat 1 Hop chat 2 Hexan-ethyl acetat Cộng sự

Reversed Phase - Pha đảo Aceton-water

Inhibition Concentration at 50%

DANH MUC CAC BANG

Bang 3-1: Dữ liệu phố NMR của hợp chất 1 Bảng 3-2: Kết quả thử hoạt tính ức chế tyrosinase

DANH MUC HINH VE, DO THI

Hình 1-1: Con đường sinh tổng hợp melanin - - 10

Hình 3-1: Sơ đồ chiết tách các chất từ dịch chiết cây Mẫn tưới 16

Hinh 3-2: Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn F5 c se 17 Hình 3-3: Phổ ESI-MS của hợp chất Ì Ă- ch 21 Hình 3-4: Phổ H-NMR của hợp chất Ï - cv crem 22 Hình 3-5: Phổ “C-NMR của hợp chất Ì TS ST vs ềi 23

Hình 3-6: Phổ DEPT của hợp chất Ì - ST SH kv va 24

Hình 3-7: Cau tric cha hop chat l c1 ren 24

Hinh 3-8: Phổ ESI-MS của hợp chất 2 Ăn nà 26

Hình 3-9: Phổ H-NMR của hợp chất 2 Ă Sen 27 Hinh 3-10: Phd C-NMR ctia hợp chất 2 c- cty 28

Hinh 3-11: Phé DEPT ctia hop Chat 2 00 cecccccceccceccecceeccuscueceuesenens 28

Hình 3-12: Cấu trúc của a-Acetylamino-phenylpropyl a-benzoylamino-

phenylpropanoaf(HC2) - ccằŸ s2 29

DAT VAN DE

Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới âm gió mùa nên có nguồn được liệu phong phú và đa dạng, cùng với đó là nền Y học dân tộc cỗ truyền phát triển mạnh mẽ, lâu đời, chiếm vị trí đặc biệt trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ nước Nhiều được liệu đã được khai thác để dùng làm thuốc, nhiều loài đùng làm nguyên liệu cung cấp tính dầu cho công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm như bạc hà, thanh hao hoa vàng, hoa hồi , có loại được dùng làm thực phẩm chức năng

đồ uống như các loại trà, các loại sâm v.v

Tuy nhiên nguồn dược liệu này được sử dụng chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian, nhiều cây thuốc quý vẫn chưa được chú ý, nghiên cứu hoặc nghiên chưa đầy đủ, chưa chuyên sâu Trong số đó có cây Mân Tưới (có tên khác là: Trạch lan, lan thảo, hương thảo, co phất phử (Thái), tên nước ngoài Eupatorie (Pháp)) có tên khoa học là Eupaforium ƒorfunei Turcz (còn có tên đồng nghĩa

la Eupatorium staechadosmum Hance — Man tudéi trắng) thuộc Họ Cúc (Asteraceae) 1a mét loai thao dugc phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới châu

Mỹ, được trồng ở Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Lào Mần tưới có vị đăng, mùi thơm, tính hơi ẫm, có tác dụng hoạt huyết, tán ứ, lợi tiểu, sát trùng được dùng chữa bế kinh, kinh nguyệt không đều, phụ nữ sau khi sinh đau bụng do ứ huyết, phù thũng, choáng váng hoa mắt, chấn thương, mụn nhọt, lở ngứa ngoài

da Ngoài ra dân gian còn dùng mần tưới để diệt chấy, rận rệp; xua đuổi các loai bo cho, bo mat, din [1], [2]

Cây Mân tưới được dùng nhiễu trong dân gian đã có từ lâu, nghiên cứu hoa thực vật cây Mân tưới chỉ mới được các nhà khoa học chú ý trong mây năm

gan đây va dic biét loai man tuéi (Eupatorium fortunei Tucz.) lại chưa được nghiên cứu tại việt nam, để góp phần làm rõ thêm thành phân hoá thực vật của cây mân tưới tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm được liệu

và nguyên liệu cho các mục đích phát triển cây thuốc quý đưa vào sử dụng khoa học và hiệu quả, đồng thời trong khuôn khổ tìm kiếm các hợp chất có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase, một enzyme quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp melanin liên quan đến các bệnh về sắc tố da, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phân hóa học và hoạt tính ức ché enzyme tyrosinase của cây Mẫn tưới (Eupatorium ƒfortunei Turcz.)” với 2 mục tiêu:

- Nghiên cứu bước đầu thành phần hóa học của cây Mần tưới

- Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Tyrosinase của các chất phân lập được và của dịch chiết cây Mần tưới

Cum hoa mọc ở ngọn thân và đầu cành thành ngù kép, mang nhiều đầu dài 7- 8 cm; lá bắc nhỏ; hoa màu tím hồng, đôi khi màu trắng: tràng hoa loe dần

về phía đầu, mào lông dài 3 mm; bao phần không có tai ở gốc

Quả bế, màu đen, có 5 cạnh lồi

Mua hoa qua: thang 9- 11[1]

1.1.3 Sự phân bố của loài Man tưới trong tự nhiên

Chi Eupatorium L có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở Việt Nam có khoảng 10 loài, Mẫn tưới là một loại cây trông, còn thấy ở cả Ân Độ, Trung Quốc và Lào

Man tưới được trồng rải rác trong nhân dân, trong các vườn gia đình để làm thuốc và làm rau ăn Cây ưa âm, ưa sáng và có thê hơi chịu bóng, nên thường được trồng xen ở vườn chuối Hiện nay cây chưa thấy trồng ở vùng núi cao Mẫn tưới ra quả nhiều hàng năm, tái sinh cây trồi mạnh sau khi cắt Cây rụng lá và phần trên mặt đất có hiện tượng tàn lụi về mùa đông [1]

1.1.4 Thành phần hóa học của loài Mần tưới

1.1.4.1 Các công trình nghiên cứu trong nước về thành phân hóa học

cia cay Man tưới

Ở Việt Nam có tất ít công trình nghiên cứu về thành phan hoá học cây Man tuwéi (Eupatorium fortune’ )

Tinh dầu của phần trên mặt đất của cây Mần tưới mọc ở Việt Nam có ơ- pinen, B- pinen, a- phelandren, a- terpinen, 1- B- cineol, camphor, terpinen- 4-

ol, methylthymol, methylchavicol, B- elemen, thymolhydroquinon (73,6%), dimethylether, B- caryophylen 8,9 %, a- humulen, B- sabinen, selina- 4,11- dien (11%, a- selinen va cryophylen oxyd (Nguyễn Xuân Dũng và cs, 1991) [1]

Ngoài tính dầu, Man tưới con chta coumarin; ayapin; 2- hydroxy- 4- methylacetophenon; 8,9- epoxy- 10- acetyl- oxy- thymolangelat; 9- isobutyryloxy- 8,10- dihydroxythymol; angeloyl- 8; 10- dihydroxythymol [5]

1.1.4.2 Các công trình nghiên cứu nước ngoài về thành phân hóa học

cia cay Man tưới

Từ lá mắn tưới, 42 chất được chiết xuất bằng phương pháp hấp phụ, trong

đó chất chủ yếu là đồng phân farnesen

Tinh dau man tưới chứa camphen, longifolen, œ- muurolen, ÿ- caryophylen, B- arnesen, caren, B- pinen, myrcen, isobornyl acetat, a- guaienen, B- guaienen, neryl acetat, a- cedren (Mo Zhenkun, 1986;CA 106, 135261p) [1]

Năm 1986, Haruna cùng các cộng sự đã xác định được cầu trúc của Eupafortunin và Eupatoriopicrin là các hợp chất thuộc khung Sesquiterpene lactone phân lập từ loài Mẫn tưới (Eupatorium ƒortunei ) Eupafortunin là một sesquiterpene lactone mới, được phân lập từ Mần tưới (Eupatorium ƒortunei ), cấu trúc và hóa học lập thể của nó được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp hóa ly [8]

Nam /992, Liu va các cộng sự đã phân lập duoc 3 alkaloid pyrolizidine từ loài man tưới gồm Supinine, Rinderine va O-7- acetylrinderine, cầu trúc của 3 hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ Một trong số chúng là chất mới và câu trúc của hợp chất này được chứng minh bằng việc phân tích phố hai chiều NMR [12]

Q HQ = -

a 2 +

Me

Supinine Rinderine

Năm 2001, Motoo Tor1 cùng các cộng sự đã phân lập và xác định được cầu trúc của 16 dẫn xuất thymol mới từ cây Mần tưới Những hợp chất này được phân loại thành 3 nhóm phụ thuộc vào mức độ oxI hóa: một nhóm chức oxI hóa ở vị trí 9, hai nhóm chức oxI hóa ở các vị trí 8 và 9, ba nhóm chức oxi hóa ở các vị trí 8, 9, 10 [16]

Nam 2005, Hai Xia Jiang va Kun Gao da phan lập được 2 monotecpen

từ loài mắn tưới (Eupaforium ƒortunei) và đã xác định được cẫu trúc của 2 hợp chất là [9] Dưới đây là cầu trúc của 2 monotecpen này:

(1R*,2S*,3R*,4R*,6S*)-1,2,3,6- (1S*,25",38",4R"6R")-1,2,3,6-

Nhóm nghiên cứu này sau đó tiếp tục nghiên cứu và đã công bố công trình phân lập các tecpenoid từ loài mân tưới (Eupaforium ƒorfunei) Theo đó,

4 tecpenoit moi co tén 1a rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6-tetrol, rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6-tetrol, 9-hydroxythymol 3-Ớ- angelate và (3ố,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yÌ palminate cùng với 14 hợp chất đã biết được phân lập từ phần AcOEt của dịch chiết MeOH của Eupatorium fortunei Thém vao do, 2 monotecpenoit khac la acetone thymol- 8,9-diyl ketal va 8-methoxy-9-hydroxythymol 3-O-angelate ciing da dugc xac dinh [10]

1.1.5 Tac dụng dược lý của loài Mân tưới

Mân tưới dùng làm thuốc chứa bế kinh, kinh nguyệt không đều, phụ nữ sau khi đẻ đau bụng do ứ huyết, phù thũng, choáng váng hoa mắt, chấn thương, mụn nhọt, lở ngứa ngoài da Ngày dùng 10- 20 g cây khô hoặc 50- 150 g cây tươi dạng thuốc sắc Dùng ngoài da, cả cây giã nát đắp

Ngoài ra nhân dân còn dùng mân tưới để diệt chấy, rận, lấy cả cây mân tưới sắc đặc với nước dùng gội đầu, giặt quân áo, chăn màn, hoặc đỗ nước sắc vào kẽ giường để trừ rệp Cho mân tưới tươi vào hũ, đậy kín chỗng mọt cho

đỗ xanh, đỗ đen, cau khô Để trừ bọ chó, mạt gà, người ta dọn sạch phân, rác bần ở ô chó, ô gà, rồi lẫy cành lá mân tưới tươi để nguyên hoặc vò nát lót vào, khoảng 3- 5 ngày thay một lần Lá mân tưới phơi khô, tán bột rắc vào hòm, tủ

đề trừ mọt, nhậy

Kiêng kị: Phụ nữ bị băng huyết và bệnh nhân đái ra máu không dùng.[ 1]

Trong y hoc Trung Quốc, Mần tưới còn được sử dụng cho việc chữa trị các

bệnh sưng phù, tiểu đường, dùng như một loại thuốc lợi tiểu, giải nhiệt hạ

sốt.[1]

1.2 Hoạt tính sinh học của cây Man tưới

Man tưới (Eupaforium ƒorfunei) là một loại thuốc truyền thống của người Trung Quốc, loài này mọc phố biến ở Trung Quốc và được sử dụng để chữa trị bệnh phủ thũng, các chứng cảm lạnh, giảm sốt, được dùng như một loại thuốc lợi tiêu Một nhóm nghiên cứu người Nhật đã tìm thấy một loạt các dẫn xuất của Thymol phân lập từ Eupaforium ƒortunei, các dẫn xuất thymol đó kháng được 8 loại vi khuẩn theo phương pháp pha loãng agar [1] Năm 2005, Hai Xia Jiang và Kun Gao có một công trình công bố 2 monotecpen có tính oxy hóa cao, được phân lập từ phần EtOAc của dịch chiết MeOH mẫu cây này Ngoài ra dịch chiết EtOAc có tác dụng gây độc tế bao ICs) = 69,5 và 86,1

ug/mL đối với các dòng tế bào HL-60 và SMMC-7721 [9]

Bốn terpenoit mới có tén mdi 1a vel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6- tetrol, rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1 ,2,3,6-tetrol, 9-hydroxythymol 3-O- angelate va (30,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl palminate, chung co hoat tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào SMMC-7721, HL-60 và LO; [10] 1.3 Hoạt tính ức ché tyrosinase

Tyrosinase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành melanin, một chất màu có mặt trong hầu hết sinh vật Melanin chính là một trong những thành phân chính của sắc tô da, có vai trò bảo vệ da khỏi tia

tử ngoại và các chất oxy hoá Tuy nhiên khi melanin được sản sinh và tích tụ quá nhiêu ở da dân đên hiện tượng da bị sạm màu Việc ức chê sự hoạt động

1n đường sinh tổng hợt: melanin [1 1]

n phẩm mỹ phẩm, dược phẩm có “ * “am trang da déu

al có khả năr ø ức ché t; rosinase \ ong cong nzhiép

: chễ sự ná~ vỏ rau củ quả trong bảo quản người

ac tác nhân ức chế tyn›sinase [1| ä đã phát hiện ra tyrosinase gdm các hoạt chất từ - cũng như tổng

y nhiên trang sản ph:m mỹ phẩm người ti ác hoạt chất có Eốc thiên nhiên do an toàn đối với con ng ủ hợp chất thiên

có tác dụn: úc chê ạnh tyrosinase có _ r hư axit kokic,

li

quercetin, kaempferol, oxyresveratrol, chloroporin, aloesin, trilinolein, axit arjunilic, physcion, lyoniresinol [11], [13], [7]

Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

Ban mỏng tráng san DC-Alufolien 60 F 54 va RP1g F254 (Merck-Ditc)

Dụng cụ: Cốc có mỏ, bình nón, đũa thủy tinh, ống nghiệm, pipet, bình định mức,

Thiết bị và Phương pháp nghiên cứu:

Sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 va RP1g F›z4 (Merck-Đức) Cac vét chat dugc phat hién bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 36§nm hoặc dùng thuốc thử

là dung dich H,SO, 10% phun đều lên bản mỏng roi sây ở nhiệt độ cao cho đên khi xuât hiện màu.

13

- - Sắc kí cột (CC) được tiễn hành với chất hấp phụ pha thường (Silica gel

240-430 mesh, Merck) hoặc đảo pha (YMC RP-18, Nhật Bản)

- _ Phố khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT

1200 LC-MSD Trap Phố cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS

- Thiét bi siéu 4m Ultrasonic 2010

- May cat quay

2.3 Hóa chất, thiết bị và phương pháp đánh gid hoat tinh enzyme

tyrosinase

2.3.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bi:

Enzyme tyrosinase, cơ chất tyrosine (Sigma Aldrich)

Đệm phosphat pH 7,0

Phiến vi lượng 96 giếng

Máy đọc ELISA kèm bộ ủ ấm (xMark, Bio-Rad)

Micropipet

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu:

Hoạt tính ức chế tyrosinase được đánh giá theo phương pháp đã được mô

tả trước đó [14] Phương pháp này sử dụng phiến 96-giếng, trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (2 uL) pha ở các nông độ khác nhau được ủ với tyrosine (80 uL) trong 3-5 phút sau đó bồ sung tyrosinase (20 uL), lắc đều rồi

ủ trong 30 phút ở 37C (hoặc nhiệt độ phòng) Đo mật độ quang của các giếng ở bước sóng 490 nm bằng máy đọc ELISA

Đối chứng đương: hydroquinone

Kết quả được tính theo công thức sau:

% ức chế = 100 - [(C - B)/(A - B) x 100]

14

Trong do:

A: Mat độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu nghiên

Cứu, có tyrosinase; trường hợp này coi nhu gia tri uc ché 0%)

B: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (không có mẫu nghiên cứu và tyrosinase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%); C, mật độ quang

trung bình của mẫu thử.