Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cây mần tưới ( eupatorium fortunei turcz )
Trang 1BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ VĂN THÀNH
NGHIÊN CỨU THANH PHAN HOA HOC VA HOAT TINH UC CHE ENZYME TYROSINASE
CUA CAY MAN TUOI
(EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1 TS.Nguyễn Tường Wy 2 TS.Nguyễn Hoài Nam Nơi thực hiện:
Viện hóa sinh biển — Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Trang 3LOI CAM ON!
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi những lời cảm ơn chân
thành nhất đến:
TS Nguyễn Tường Vy
Người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua,
để tơi có thể hồn thành khóa luận tốt nghiệp
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới 7S Nguyễn Hoài Nam, TS Nguyễn Tiến Đạt,
cùng các cán bộ nhân viên Viện Hóa Sinh Biển - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở
Tôi cũng xin gửi tới các thầy các cô giáo trong ban giám hiệu nhà trường, các phịng ban, cùng tồn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội những lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học vừa qua
Cuối cùng cho phép tôi được bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới gia đình, người thân, bạn bè những người đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành tốt khóa luận
Hà nội, ngày 09 tháng 05, năm 2012 Sinh viên
Trang 4MUC LUC
TRANG PHU BIA
LOI CAM ON MUC LUC
DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHU VIET TAT TRONG LUAN
VAN
DANH MUC CAC HINH VE, DO THI TRONG LUAN VAN
Trang
0.002.062) - aaa 1
Chuong 1 TONG QUAN 00 ccc ccccceecseeeceeeseucecececceuesenseeeseueeeeaneeeas 3
1.1 Thure vat hoc cay Man tu6i eee cece eecceeeccaseeeceeeseseeeean 3 1.1.1 Tên và họ của loài mân tưới Eupaforium ƒortunei The 3
1.1.2 Mô tả về loài Mẫn tưới .- che 3
1.1.3 Sự phân bố của loài Mân tưới trong tự nhiên - - 4 1.1.4 Thành phần hóa học của lồi Mẫn tưới . - << s7< << sec 4 1.1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của cây
b0 UP 4ã 4
1.1.4.2 Các cơng trình nghien cứu nước ngồi về thành phần hóa học của cây
P50 =a.aG 5
Trang 5Chương 2 ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1 Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu về mặt hóa học l2 2.1.1 Hóa chất, dụng CỤ - c c0 n SH Y SH Y TY nu 12 2.1.2 Thiết bị và phương pháp nghiên cứu -c << << << sa: 12 2.2 Hóa chất, thiết bị và phương pháp đánh giá hoạt tinh enzyme 13 2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .- nh ch sen 13 2.2.2 Phương pháp nghiên cỨu . - - 13
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ NHẬN XÉT . 15
3.1 _ Chiết tách và phân lập các chất .-c Ss n1 Snn si 15 3.2 Xác định câu trúc hóa học các hợp chất phân lập được 18 3.2.1 Xác định câu trúc hợp chất Ì -c cv rào 18 3.2.2 Xác định câu trúc hợp chất 2 . cv ky rèn 22 3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế Enzyme tyrosinase 5-2 5 «sẻ 27 3.4 Bàn luận QQQnnnnnn HH nh ky se 28
KET LUAN VA DE XUAT c.ccccccccccecceccccuecueececceceeceteeeeeeeseeen 29
KET LUAN 000 ccc ceccceecesesceccce cece esse eesuusesuecesaeseuneeseneevaseeaeeeaaas 29 DE XUAT 000 cccccccccceccccecccuecceucceeusecuucceuesecaecsensesusesaeseueseeneens 29
Trang 6DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHU VIET TAT TRONG LUAN TLC ESI-MS DEPT CTPT PT SKPD SKPT HCl HC2 HE CS RP AW lCso w VAN
Thin Layer Chromatography — Sac ky lép mong Colum Chromatography — Sac ky cét
Nuclear Magnetic Resonance — Phố cộng hưởng từ hạt nhân ÌH-Nuclear Magnetic Resonance — Phố cộng hưởng từ hạt nhân proton
lắc Nuclear Magnetic Resonance— Phô cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
Electron Spay Ionization Mass Spectrometry — Phé khéi luong phun mù điện tử
Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer — Phố phân loai Carbon khac nhau
Công thức phân tử Phân lập Sắc ký pha đảo Sắc ký pha thuận Hop chat 1 Hop chat 2 Hexan-ethyl acetat Cộng sự
Reversed Phase - Pha đảo Aceton-water
Trang 7DANH MUC CAC BANG
Trang 8DANH MUC HINH VE, DO THI
Hình 1-1: Con đường sinh tổng hợp melanin .- - 10
Hình 3-1: Sơ đồ chiết tách các chất từ dịch chiết cây Mẫn tưới 16
Hinh 3-2: Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn F5 c se 17 Hình 3-3: Phổ ESI-MS của hợp chất Ì Ă- ch 21 Hình 3-4: Phổ H-NMR của hợp chất Ï - cv crem 22 Hình 3-5: Phổ “C-NMR của hợp chất Ì TS ST vs ềi 23
Hình 3-6: Phổ DEPT của hợp chất Ì .- ST SH kv va 24
Hình 3-7: Cau tric cha hop chat l c1 ren 24
Hinh 3-8: Phổ ESI-MS của hợp chất 2 Ăn nà 26
Hình 3-9: Phổ H-NMR của hợp chất 2 Ă Sen 27 Hinh 3-10: Phd C-NMR ctia hợp chất 2 .c- cty 28
Hinh 3-11: Phé DEPT ctia hop Chat 2 00 cecccccceccceccecceeccuscueceuesenens 28
Hình 3-12: Cấu trúc của a-Acetylamino-phenylpropyl a-benzoylamino-
Trang 9DAT VAN DE
Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới âm gió mùa nên có nguồn được liệu phong phú và đa dạng, cùng với đó là nền Y học dân tộc cỗ truyền phát triển mạnh mẽ, lâu đời, chiếm vị trí đặc biệt trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ nước Nhiều được liệu đã được khai thác để dùng làm thuốc, nhiều loài đùng làm nguyên liệu cung cấp tính dầu cho công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm như bạc hà, thanh hao hoa vàng, hoa hồi , có loại được dùng làm thực phẩm chức năng đồ uống như các loại trà, các loại sâm v.v
Tuy nhiên nguồn dược liệu này được sử dụng chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian, nhiều cây thuốc quý vẫn chưa được chú ý, nghiên cứu hoặc nghiên chưa đầy đủ, chưa chuyên sâu Trong số đó có cây Mân Tưới (có tên khác là: Trạch lan, lan thảo, hương thảo, co phất phử (Thái), tên nước ngoài Eupatorie (Pháp)) có tên khoa học là Eupaforium ƒorfunei Turcz (cịn có tên đồng nghĩa la Eupatorium staechadosmum Hance — Man tudéi trắng) thuộc Họ Cúc (Asteraceae) 1a mét loai thao dugc phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, được trồng ở Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Lào Mần tưới có vị đăng, mùi thơm, tính hơi ẫm, có tác dụng hoạt huyết, tán ứ, lợi tiểu, sát trùng được dùng chữa bế kinh, kinh nguyệt không đều, phụ nữ sau khi sinh đau bụng do ứ huyết, phù thũng, choáng váng hoa mắt, chấn thương, mụn nhọt, lở ngứa ngoài da Ngồi ra dân gian cịn dùng mần tưới để diệt chấy, rận rệp; xua đuổi các loai bo cho, bo mat, din [1], [2]
Trang 10gan đây va dic biét loai man tuéi (Eupatorium fortunei Tucz.) lại chưa được nghiên cứu tại việt nam, để góp phần làm rõ thêm thành phân hoá thực vật của cây mân tưới tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm được liệu và nguyên liệu cho các mục đích phát triển cây thuốc quý đưa vào sử dụng khoa học và hiệu quả, đồng thời trong khn khổ tìm kiếm các hợp chất có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase, một enzyme quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp melanin liên quan đến các bệnh về sắc tố da, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phân hóa học và hoạt tính ức ché enzyme tyrosinase của cây Mẫn tưới (Eupatorium ƒfortunei Turcz.)” với 2 mục tiêu:
Trang 11Chuong
1.1.2
Trang 12
Cum hoa mọc ở ngọn thân và đầu cành thành ngù kép, mang nhiều đầu dài 7- 8 cm; lá bắc nhỏ; hoa màu tím hồng, đôi khi màu trắng: tràng hoa loe dần về phía đầu, mào lông dài 3 mm; bao phần khơng có tai ở gốc
Quả bế, màu đen, có 5 cạnh lồi Mua hoa qua: thang 9- 11[1]
1.1.3 Sự phân bố của loài Man tưới trong tự nhiên
Chi Eupatorium L có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở Việt Nam có khoảng 10 loài, Mẫn tưới là một loại cây trơng, cịn thấy ở cả Ân Độ, Trung Quốc và Lào
Man tưới được trồng rải rác trong nhân dân, trong các vườn gia đình để làm thuốc và làm rau ăn Cây ưa âm, ưa sáng và có thê hơi chịu bóng, nên thường được trồng xen ở vườn chuối Hiện nay cây chưa thấy trồng ở vùng núi cao Mẫn tưới ra quả nhiều hàng năm, tái sinh cây trồi mạnh sau khi cắt Cây rụng lá và phần trên mặt đất có hiện tượng tàn lụi về mùa đông [1]
1.1.4 Thành phần hóa học của lồi Mần tưới
1.1.4.1 Các công trình nghiên cứu trong nước về thành phân hóa học
cia cay Man tưới
Ở Việt Nam có tất ít cơng trình nghiên cứu về thành phan hoá học cây Man tuwéi (Eupatorium fortune’ )
Tinh dầu của phần trên mặt đất của cây Mần tưới mọc ở Việt Nam có ơ- pinen, B- pinen, a- phelandren, a- terpinen, 1- B- cineol, camphor, terpinen- 4- ol, methylthymol, methylchavicol, B- elemen, thymolhydroquinon (73,6%),
Trang 13Ngồi tính dầu, Man tưới con chta coumarin; ayapin; 2- hydroxy- 4- methylacetophenon; 8,9- epoxy- 10- acetyl- oxy- thymolangelat; 9- isobutyryloxy- 8,10- dihydroxythymol; angeloyl- 8; 10- dihydroxythymol [5]
1.1.4.2 Các công trình nghiên cứu nước ngồi về thành phân hóa học
cia cay Man tưới
Từ lá mắn tưới, 42 chất được chiết xuất bằng phương pháp hấp phụ, trong đó chất chủ yếu là đồng phân farnesen
Tinh dau man tưới chứa camphen, longifolen, œ- muurolen, ÿ- caryophylen, B- arnesen, caren, B- pinen, myrcen, isobornyl acetat, a- guaienen, B- guaienen, neryl acetat, a- cedren (Mo Zhenkun, 1986;CA 106,
135261p) [1]
Trang 14
Eupatofortunin Eupatoriopicrin
Nam /992, Liu va các cộng sự đã phân lập duoc 3 alkaloid pyrolizidine từ loài man tưới gồm Supinine, Rinderine va O-7- acetylrinderine, cầu trúc của 3 hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ Một trong số chúng là chất mới và câu trúc của hợp chất này được chứng minh bằng việc phân tích phố hai chiều NMR [12]
Trang 15> B O ae \ / a OAc O-7-acetylrinderine
Năm 2001, Motoo Tor1 cùng các cộng sự đã phân lập và xác định được cầu trúc của 16 dẫn xuất thymol mới từ cây Mần tưới Những hợp chất này được phân loại thành 3 nhóm phụ thuộc vào mức độ oxI hóa: một nhóm chức oxI hóa ở vị trí 9, hai nhóm chức oxI hóa ở các vị trí 8 và 9, ba nhóm chức oxi hóa ở các vị trí 8, 9, 10 [16]
Nam 2005, Hai Xia Jiang va Kun Gao da phan lập được 2 monotecpen từ loài mắn tưới (Eupaforium ƒortunei) và đã xác định được cẫu trúc của 2 hợp chất là [9] Dưới đây là cầu trúc của 2 monotecpen này:
“uc
(1R*,2S*,3R*,4R*,6S*)-1,2,3,6- (1S*,25",38",4R"6R")-1,2,3,6-
Trang 16Nhóm nghiên cứu này sau đó tiếp tục nghiên cứu và đã cơng bố cơng trình phân lập các tecpenoid từ loài mân tưới (Eupaforium ƒorfunei) Theo đó, 4 tecpenoit moi co tén 1a rel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6-tetrol, rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1,2,3,6-tetrol, 9-hydroxythymol 3-Ớ- angelate và (3ố,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yÌ palminate cùng với 14 hợp chất đã biết được phân lập từ phần AcOEt của dịch chiết MeOH của Eupatorium fortunei Thém vao do, 2 monotecpenoit khac la acetone thymol- 8,9-diyl ketal va 8-methoxy-9-hydroxythymol 3-O-angelate ciing da dugc xac dinh [10]
1.1.5 Tac dụng dược lý của loài Mân tưới
Mân tưới dùng làm thuốc chứa bế kinh, kinh nguyệt không đều, phụ nữ sau khi đẻ đau bụng do ứ huyết, phù thũng, choáng váng hoa mắt, chấn thương, mụn nhọt, lở ngứa ngoài da Ngày dùng 10- 20 g cây khô hoặc 50- 150 g cây tươi dạng thuốc sắc Dùng ngoài da, cả cây giã nát đắp
Ngoài ra nhân dân còn dùng mân tưới để diệt chấy, rận, lấy cả cây mân tưới sắc đặc với nước dùng gội đầu, giặt quân áo, chăn màn, hoặc đỗ nước sắc vào kẽ giường để trừ rệp Cho mân tưới tươi vào hũ, đậy kín chỗng mọt cho đỗ xanh, đỗ đen, cau khô Để trừ bọ chó, mạt gà, người ta dọn sạch phân, rác bần ở ơ chó, ơ gà, rồi lẫy cành lá mân tưới tươi để nguyên hoặc vị nát lót vào, khoảng 3- 5 ngày thay một lần Lá mân tưới phơi khô, tán bột rắc vào hòm, tủ
đề trừ mọt, nhậy
Trang 17Trong y hoc Trung Quốc, Mần tưới còn được sử dụng cho việc chữa trị các
bệnh sưng phù, tiểu đường, dùng như một loại thuốc lợi tiểu, giải nhiệt hạ
sốt.[1]
1.2 Hoạt tính sinh học của cây Man tưới
Man tưới (Eupaforium ƒorfunei) là một loại thuốc truyền thống của người Trung Quốc, loài này mọc phố biến ở Trung Quốc và được sử dụng để chữa trị bệnh phủ thũng, các chứng cảm lạnh, giảm sốt, được dùng như một loại thuốc lợi tiêu Một nhóm nghiên cứu người Nhật đã tìm thấy một loạt các dẫn xuất của Thymol phân lập từ Eupaforium ƒortunei, các dẫn xuất thymol đó kháng được 8 loại vi khuẩn theo phương pháp pha loãng agar [1] Năm 2005, Hai Xia Jiang và Kun Gao có một cơng trình cơng bố 2 monotecpen có tính oxy hóa cao, được phân lập từ phần EtOAc của dịch chiết MeOH mẫu cây này Ngoài ra dịch chiết EtOAc có tác dụng gây độc tế bao ICs) = 69,5 và 86,1
ug/mL đối với các dòng tế bào HL-60 và SMMC-7721 [9]
Bốn terpenoit mới có tén mdi 1a vel-(1R,2S,3R,4R,6S)-p-menthane-1,2,3,6- tetrol, rel-(1R,2R,3R,4S,6S)-p-menthane-1 ,2,3,6-tetrol, 9-hydroxythymol 3-O- angelate va (30,20R)-20-hydroxylanost-25-en-3-yl palminate, chung co hoat tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào SMMC-7721, HL-60 và LO; [10] 1.3 Hoạt tính ức ché tyrosinase
Trang 1810
ase la đi: mâu chôt đê ngăn n i au da
Tyroriese Tynnsnase
jMonoplenotase) (Diphenctase)
Cio a = = ooo | „CCK1d : l ¬ COOH
al Xi : “ate sy 4 “%% poe a ! = a, ~
= w ze al sử & ; al X 5
ao oe Oo" —»-“ TÊN LầNI|äITIGMG pac” ae a
Tybee L-D0A, Dapaaunce ` : ï
*, “ Cýsiere J/
“= -—— "3 H;— LH
HỒ lơ : he 2+ Ÿ ị Cysterrylo£ia
ue = ckị o
HO” “NT ‘Oo =" Wr’ “COOH HOT Oy OOH
H H H
rill [xmœehrnme LaUkcwxloptarlromse wh ¬~ ~- 84w
| Tyrosing a Taulomerspe } |
4” fe i
OO Se oT ~+ HO "vn ts, Gandest \ QL + \ tạ TH : ` hư : ị
kí ah J I a J bil too Sere ne HÀ ig 14-Benrolhuervrgtwanine |
oS “HN HO” OS ON” “OOOH oo “nN "toon ¡ : :
_ H H H
end obo «SC eure DeICA Indcfe.5 ÊÉ-tuinane
carboxylic acid :
ii ———Ăă———ă—ĂĂ.-— enenereseyoordy ——_——————_-~k-T-——rs=v=e —_—_—————— sử a 2 Oe ee
———————————— | Eumebnin >= Pheonmelanin 255 'Mlxed-mdanins | ^ ˆ
1n đường sinh tổng hợt: melanin [1 1]
Trang 19li
Trang 2012
Chuong2 POILTUONG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu là Phần trên mặt đất của cây mân tưới được thu hái tại Hoà Bình vào tháng 6 năm 2010 và được TS Trần Huy Thái, Viện Sĩnh thái và Tài nguyên Sinh vật giám định tên khoa học
Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam
2.2 2.2.1
2.2.2
Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu về mặt hóa học: Hóa chất, dụng cụ:
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Dung mơi: Nước cất, Ethanol, n-hexan, Methanol, Cloroform, Ethyl
acetat, aceton
Thuốc thử: H;SO¿ 10%
Ban mỏng tráng san DC-Alufolien 60 F 54 va RP1g F254 (Merck-Ditc)
Dụng cụ: Cốc có mỏ, bình nón, đũa thủy tinh, ống nghiệm, pipet, bình định mức,
Thiết bị và Phương pháp nghiên cứu:
Trang 2113
- - Sắc kí cột (CC) được tiễn hành với chất hấp phụ pha thường (Silica gel
240-430 mesh, Merck) hoặc đảo pha (YMC RP-18, Nhật Bản)
- _ Phố khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1200 LC-MSD Trap Phố cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS
- Thiét bi siéu 4m Ultrasonic 2010 - May cat quay
2.3 Hóa chất, thiết bị và phương pháp đánh gid hoat tinh enzyme tyrosinase
2.3.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bi:
Enzyme tyrosinase, cơ chất tyrosine (Sigma Aldrich) Đệm phosphat pH 7,0
Phiến vi lượng 96 giếng
Máy đọc ELISA kèm bộ ủ ấm (xMark, Bio-Rad) Micropipet
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu:
Hoạt tính ức chế tyrosinase được đánh giá theo phương pháp đã được mơ tả trước đó [14] Phương pháp này sử dụng phiến 96-giếng, trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (2 uL) pha ở các nông độ khác nhau được ủ với tyrosine (80 uL) trong 3-5 phút sau đó bồ sung tyrosinase (20 uL), lắc đều rồi ủ trong 30 phút ở 37C (hoặc nhiệt độ phòng) Đo mật độ quang của các giếng ở bước sóng 490 nm bằng máy đọc ELISA
Đối chứng đương: hydroquinone Kết quả được tính theo công thức sau:
Trang 2214
Trong do:
A: Mat độ quang trung bình của mẫu chứng dương (khơng có mẫu nghiên
Cứu, có tyrosinase; trường hợp này coi nhu gia tri uc ché 0%)
B: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (khơng có mẫu nghiên cứu và tyrosinase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%); C, mật độ quang
Trang 2315
Chương 3: THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN
3.1 Thực nghiệm
3.1.1 Chiết tách và phân lập các chất
Trang 24
Phân trên mặt đât cây mân tưới a
Y
Phơi khô, xay nhỏ (3,5Kg)
+ Ngâm chiết với methanol (10L x 3 lần)
Dịch chiết
r
+ Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm
Can (300g)
¥
Trộn cao với nước
¥
+ Chiét phan doan véi n-hexan, ethyl acetat
Can chiét n-hexan (60g)
ý Sắc ký cột silicagel
Rửa giải bằng hệ gradien n-hexan- aceton (100:1 v/v — 100% aceton)
Fl ¥ F2 F3 F4 F5 1 PL= SKPT 2 PL=SKPD
Hình 3- 1: Sơ đơ chiết tách các chất từ dịch chiết cây Mần tưới
Trang 2517 F5 (10 g) + Silicagel CC (HE 1/1) FSA + Silicagel CC (HE 2/1) + RP18 (AW 1/1,5) (40 mg)
Hình 3- 2 : Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn F5
Trang 2618
* au tric ho hoc cac hop chat ph* 'ˆ^ ~ ợ
c được dạng chất rắn mảu vàng nh: a ic
5.4 [M+H]” tương ứng với công HạO;
|
ESI-MS cua hop chat 1
MR xuat hién cac tín hiệu của 4 p |, J= 1,5; 7,5 Hz, H-3), 7,24 (1H
H, d, J = 8,0 Hz, H-5) va 7,59 (1H, dd, J= ¢ ca 1 cé Vong benzel thế 2 vị trí ortho Tre ¿n của hai proton nối đơi CH=CH cấu hìn _
ai hang s6 trong tac J= 16,0 Hz
` _s thơm tại tắc vị
5; 2,0 Hz, H -4),
Trang 2719
a1 1U " = 7
Hình 3-4: Phố 'H-NMR c
Trên phố °C-NMR ciing | của một vịng thơm có độ
chuyển dịch õc nằm trong vi 4 ppm Độ chuyển dịch õc tăng lên 157,4 ppm là do Cv ở vị trí này được gắn với một nhóm - OH Ngồi ra trên phố '?C-M ô DEPT cho thấy sự xuất hiện tủa 6 nhóm CH và 3 nguyên tử car trong đó có một tín F iệu của COH với õc ữ vị trí 168,3 ppm Ké đữ kiện phổ thu được, ta có thể khắng
Trang 2820 x HH nt | | | ({ NỈ | Ut 1z9 200 160 140 430 4100 BO an 40 ao Hình 3-5: Phổ '°C-NMR của hợp chất 1 | | | i | DEIr415 7 caer | | | | | ¬
simian ea 113 Loo 345 lea I4% LM 3 Lis t1 350 Te
=a | I | 3 | | i | si
Hình 3- 6: Phố DEPT của hợp chất 1
Trang 2921
Kết quả: Hợp chất 1 được xác định là acid o-coumaric
Hình 3- 7: Câu trúc của hợp chất 1
Trang 3022 Bảng 2-1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1: dy (J= Hz) dc 1 - _ 1574 2 - 1224 3 6,87 (1H, dd, 1,5 7,5) 118,8 4 7,24 (1H, dd, 1,5, 2,0) 132,2 5 6,96 (1H, d, 8,0) 120,8 6 7,59 (1H dd, 1,5, 7,5) 129,6 1? - 168,3 œ 6,59 (1H, d, 16) 117,0 8,02 (1H, d, 16) 141,0
3.2.2 Xác dinh cau tric hop chat 2:
Hợp chất 2 thu được đưới dạng chất bột màu trăng Phố khối lượng ESI-MS
xuất hiện một tín hiệu với cường độ mạnh tại m/z 444.8 [M+H]” cho phép dự
Trang 3224 1a a
Phé °C-NMR * ˆ 1 hiéu cua 27 nguyér 4% cechon, trong s6 18 tin hiéu c’ 1 vong the 6-136,7) |i cé 6 tin ‘ong dd gif doi chứng › hợp ch ủng thơm mỗi vòng mot lan N goai ra còn xuất hiện t f mot nhd™ acetyl (5, _ 0,1 và 171,7), 3
Trang 33' 20g 18n 18g 1 a 11n 25 ~n #0 6m
Hinh 3- 10: Pho !'C-NMR của hợp chất 2
40 pDErrso i ~ a ee > tủ mH DĐỌỤO tl ĐC Sẽ CC le Bờ: ' "nh An HERET135 H&CH3 | | | [ : : 7 it H2
180 nu ar as láo 139 int iba 1 bà ™ % ee » “ Ae lẻ om
E13r-en
11 | | | | Ì
1 mm=——————— ”—————————m 7 nae L?E Lan aa mac tao xo tia nee ao ao = sẽ sạ lộ xạ ae —
Trang 3426
Kết quả: Từ các số liệu phổ đã phân tích và so sánh với tài liệu đã công
bố có thể kết luận cấu trúc của 2 là œ-acetylamino-phenylpropyl œ- benzoylamino-phenylpropanoat, một hợp chất đã được phân lập trước đó từ cây Fissistigma capitatum [3]
Hình 3-12: Câu trúc của œ-Acetylamino-phenylpropyl œ-benzoylamino- phenylpropanoat (2)
Trang 3527
(C-7), 54,9 (C8), 170,4 (C-9), 136,7 (C-1'), 129.0 (C-2', 6'), 128.5 (C-3', 5'), 126.6 (C-4'), 37.4 (C-7'), 49.4 (C-8'), 64.5 (C-9"), 133,7 (C-1"), 127,0 (C-2", 6"), 128,5 (C-3", 5"), 131,9 (C4"), 167,1 (C-7"), 170,8 (CH3CO), 20,1 (CH3CO)
3.2.3 Đánh giá hoạt tính ức chế tyrosinase
Hoạt tính ức chế tyrosinase được xác định thông qua khả năng chuyển hoá tyrosine nhờ men tyrosinase Kết quả chỉ ra trong bảng 1-2 cho thấy dịch chiết methanol và hexan của cây mân tưới có hoạt tính tốt Nghiên cứu hoá học đã cho phép phân lập được hai hợp chất acid o-coumaric (1) va œ- acetylamino-phenylpropyl œ-benzoylamino-phenylpropanoat (2) Hợp chất 1 có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh hơn so với đôi chứng đương hydroquinon là một hoạt chất sử dụng rất nhiều trong các dược phẩm, mỹ phẩm làm trắng đa
Bảng 2- 2: Kết quả thử hoạt tính ức chế tyrosinase *
TT Mẫu ICso
1 | Dich chiét methanol 315,8 + 13,7 (ug/ml)
2 | Dich chiét hexan 237,5+8,6 (ug/ml)
3 | Acid o-coumaric (1) 2,8+0,15 (mM)
- (459,2 + 24,6 ug/ml) 4 | a-acetylamino-phenylpropyl-a- >10 (mM)
| benzoylamino-phenylpropanoat (2) | (4440 ug/ml) 5 | Hydroquinon (d6i chimg đương) 3,1+0,18 (mM)
(341 + 19,8 ug/ml)
Trang 36
28
3.3 BẢN LUẬN:
Cây mần tưới từ lâu đã được sử dụng trong y học cô truyền nhưng hầu như chưa được nghiên cứu về hóa học ở Việt Nam, băng phương pháp sắc ký và các phương pháp phố chúng tôi đã phân lập và xác đinh được cẫu trúc của 2 hop chất là Acid o-coumaric (1) va a-acetylamino-phenylpropyl œ- benzoylamino-phenylpropanoat (2) từ dịch chiết hexan của cay Man tudi (Eupatorium fortunei Turcz.)
Đây cũng là lần đầu tiên đề tài đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase được thực hiện tại Việt Nam cụ thể là trên cây mần tưới Kết qua chi ra acid o- coumaric có tác dụng ức chế mạnh hơn cả đối chứng đương hydroquinon Két quả này có thể định hướng sử dụng cây mẫn tưới ứng dụng trong lĩnh vực được phẩm, mỹ phẩm làm trắng da, chống nám da, chữa ung thư da
Trang 3729
KET LUAN VA DE XUAT
KET LUAN:
- Từ dịch chiết hexan của cây mân tưới, hai hợp chất đã được phân lập bằng các phương pháp sắc ký Bằng các phương pháp phổ bao gồm phố khối ESI-MS và phố cộng hưởng từ hạt nhân một chiều cấu trúc của các hợp chất này được xác định là acid o-coumaric (1)và œ-acetylamino-phenylpropyl œ- benzoylamino-phenylpropanoat (2)
- Khoá luận đã đánh giá được hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các dịch chiết cũng như hợp chất phân lập được Kết quả cho thấy dịch chiết hexan và dịch chiết methanol có tác dụng tốt và hợp chất acid o-coumaric (1) có tác dụng với giá trị [C59 14 2,8 mM
ĐÈ XUẤT:
Dựa trên kết quả nghiên cứu đã đạt được, tôi xin đề xuất như sau:
Trang 38TAI LIEU THAM KHAO Tai liéu tiéng viét:
1 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung và các cs, Cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam, Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, (2004), II, 246-
247
2 Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, (1997) Nguyễn Thị Hoàng Anh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Lê Thị Hồng Nhung,
Trần Văn Sung “Nghiên cứu thành phân hóa học cây Lanh Cong Hinh Dau (Fissistigma capitatum Mertr.ex.Li)”, ho na (Annonaceae) Tap chi Hoa hoc, (2005), T.43 (4), 475 — 478
Lê Văn Hạc, Nguyễn Văn Sơn, Tran Dinh Thăng, Nguyễn Xuân Dũng, “Xác định thành phẩn hóa hoc cu tinh dau cây Mẫn tưới trắng (Eupatorium staechadosmum Hance.)” & Thanh Hóa, Tạp chí Dược học,
(2004), 342, 6-7
Tài liệu tiếng anh:
5 Nguyen Thi Diem Trang, Wanner MJ, Koomen GJ, Nguyen Xuan Dung “New acetophenone and thymol derivatives from Eupatorium stoechadosmum”, Planta Medica 1993, 59, 480-481
Aldrich/ACD library of FT-NMR spectra standard, Vol 2, 1046B (2002)
Trang 398 Haruna M., Y.Sakakibara, and K.Ito, “Structure and conformation of eupafortunin, a new germacrane-type sesquiterpene lactone from Eupatortum fortune: Turcz”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, (1986), 34(12), 5157-5160
9 Jiang Hai Xia, Kun Gao, “Highly Oxygenated Monoterpenes from Eupatorium fortunei”, Chinese Chemical Latters, (2005), 16, 1217-
1219
10 Jiang Hai-Xia, Ya Li, Jing Pan, Kun Gao, “Terpenoids from Eupatorium fortunei Turcz.”, Helvetica Chimica Acta, (2006), 89, 258-266
11.Kim YJ and Uyama “H Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future”, Cell Mol Life Sci (2005), 62, 1707-1723
12.Liu K, Roeder E, Chen HL, Xiu XJ, “Pyrrolizidine Alkaloids from Eupatorium fortunei.”, Phytochemistry, (1992), 31(7), 2573-2574
13.Magid AA, Voutquenne-Nazabadioko L, Bontemps G, Litaudon M, Lavaud C “Tyrosinase inhibitors and sesquiterpene diglycosides from Guioa villosa.”, Planta Med (2008), 74, 55-60
14.Masuda, T.; Yamashita, D.; Takeda, Y.; Yonemori, “S Screening for tyrosinase inhibitors among extracts of seashore plants and identification of potent inhibitors from Garcinia subelliptica.” Biosci Biotechnol Biochem (2005), 69, 197-201