Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây côm (elaeocarpus griffithi)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-O0O -TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệmMã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH Phạm Văn Cường

Hà Nội, Năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắcđến TSKH Phạm Văn Cường người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bảnluận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ tại phòng Tổng hợp Hữucơ -Viện Hóa sinh biển và ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã động viên và giúpđỡ tôi rất nhiều trong việc hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dự án Pháp – Việt, đặc biệt là Viện Hóa học cácHợp chất Tự nhiên tại Gif-sur-Yvette (Cộng hòa Pháp) đã đo mẫu và thử hoạt tínhgây độc tế bào các cặn chiết và các chất phân lập được để tôi có thể hoàn thànhbản luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và cácthầy cô giáo Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQG Hà Nộiđã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và bạn bè luôn động viên và ởbên cạnh giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong cuộc sống để tôi có thể làm việctốt và hoàn thành tốt luận văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013Trần Thu Trang

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AMEM Advanced Minimum Essential MediumATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ

CC Column Chromatography (Sắc ký cột)13C-NMR Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)

dd Dublet của dubletdt Dublet của tripletdq Dublet của quartetDMSO Dimethyl sulfoxyd

DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT)ED50 Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử.

ESI-MS Electron Spray Impact Mas Spectroscopy (Phổ khối va chạm phun mù điện tử)

HSQC Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence(Phổ tương tác dị hạt nhân)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác liên kết dị hạtnhân)

1H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

1H-1H-COSY 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

IC50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứuKB Tế bào ung thư biểu mô

MCF-7 Tế bào ung thư vú

MS Mass spectrometry

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)NMR Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cây Côm ( Elaeocarpus griffithi ) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) .3

Hình 2 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandisHình 3 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides 5

Hình 4 Một số hợp chất phân lập từ loài E parvifolius và E mastersi 6

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis 6

Hình 6: Chu kỳ tế bào 8

Hình 7: Các tác nhân alkylants 9

Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất 10

Hình 9: Ức chế tổng hợp protein 11

Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN 11

Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II 12

Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1 13

Hình 13: Cấu trúc hóa học của chất F2 26

Hình 14: Cấu trúc hóa học của chất F3 27

Hình 15: Cấu trúc hóa học của chất F4 29

Hình 16: Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú của chất F2 30

Hình 17: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB 32

Hình 18: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 32

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F1trong DMSO

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F2trong DMSO

Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F3trong DMSO

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F4trong DMSO

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khỏe banđầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới.Do vậy, nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y,đặc biệt là ung thư ngày càng cao Hiện nay, một trong những hướng chính để phòngngừa và chữa trị bệnh ung thư là nghiên cứu tìm các hợp chất có nguồn gốc từ thiênnhiên Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giớivẫn tin dùng các loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn60% các tác nhân hóa trị liệu dùng trong điều trị ung thư có nguồn gốc từ các hợp chấttự nhiên.[9,15,20].

Nước ta có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo các số liệuthống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thì thảm thực vật ViệtNam có trên 12.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài được sử dụng trong dân gianlàm thuốc mới có hoạt tính cao, đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh [34].Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine và Vincristine

từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19]và Taxol từ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], cùng với các

dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần đây hoạt chấtVinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhânung thư Tuy nhiên, còn phần lớn các cây thuốc dân gian vẫn chưa được nghiên cứumột cách hệ thống Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh họckhông những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn phânlập được các hoạt chất để từ đó tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp ra các hoạt chấtmới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị.

Mô hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm những chất có hoạt

tính sinh học là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có định hướng cao, nhằm làm sáng tỏ bảnchất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên, góp phần đưa nhanh các kết quảnghiên cứu vào áp dụng thực tiễn Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí củadân tộc đặt ra trong lúc này vừa là vận hội và cũng là thách thức đối với những nhà

khoa học nói chung và cho những nhà nghiên cứu phát triển công nghiệp được nóiriêng Với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của các thảo dược dân tộc, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm (Elaeocarpus griffithi).

với nội dung nghiên cứu như sau:

Nội dung

- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất trong dịch chiết etylaxetat

của cây Côm (Elaeocarpus griffithi), thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae).

- Khảo sát hoạt tính độc tế bào của dịch chiết etylaxetat tổng cũng như các chấtphân lập được.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu chung về cây Côm

1.1.1Mô tả về thực vật

Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây đại mộc cao khoảng 10-25m, thân

thẳng, gốc có bạnh bè thấp, cành non màu nâu nhạt, nhánh non có lông mịn Lá cóphiến mỏng hình mác dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm, đầu có mũi nhọn, mép lượnsóng, có răng cưa mềm, hoa mọc thành từng chùm ở nách hay đầu cành, đài hoa cónăm lá đài hình tam giác, nhị nhiều Quả hình thận dài 1,5 cm, đường kính 0,8 – 1cm,khi chín có màu đen Gỗ cây màu trắng vàng có thể dựng làm nhà, đóng đồ mộcthông thường xẻ ván Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ cây này để mục trong rừngđể gây trồng nấm hương [1,2].

Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae)

1.1.2 Phân bố sinh thái

Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, với một

ít là cây ôn đới Phần lớn các loài cây thường xanh Cây mọc rải rác trong rừngthứ sinh ở độ cao từ 400 m trở xuống Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất

sét pha Tái sinh hạt tốt, ra hoa vào tháng 8-9, có quả chín tháng 12 đến tháng 1năm sau [1,2]

Chúng được tìm thấy ở Madagascar, Đông Nam Á, Malaysia, miền đôngAustralia, New Zealand, Tây Ấn và Chile Họ này chứa khoảng 605 loài cây thân gỗ vàcây bụi trong 12 chi Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc.

Các loài trong họ Elaeocarpaceae phần lớn loài cây này có hoa lưỡng tính hoặckhác gốc và chúng mọc thành cụm [1,2].

1.2 Những nghiên cứu trước đây về cây Côm (Elaeocarpus griffithii)

Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tínhsinh học nào được công bố về loài thực vật này.

Các nghiên cứu về các loài khác thuộc chi này cho thấy thành phần hóa học của

các hợp chất của chi Elaeocarpus rất đa dạng Nổi bật về thành phần hóa học của các

loài trong chi này là các hợp chất alkaloid Các chất đã được phân lập từ loài

Elaeocarpus grandis là rudrakine (1), grandisines A (2), Isoelaeocarpiline (3),

grandisines C, D, E, F, and G (4-8) cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ

quan thụ cảm δ-opioid của người với giá trị IC50 nằm trong khoảng 9,9 - 75,4µg/ml.

Các nhà khoa học đã chứng minh rằng cơ quan thụ cảm δ-opioid có liên quan chặt

chẽ tới các triệu chứng đau kinh niên [6,23].

Hình 2 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis

Trong một nghiên cứu khác về loài Elaeocarpus fuscoides, Anthony R.

Carroll và cộng sự cũng đó phân lập được các alkaloid là elaeocarpenine (9),isoelaeocarpicine (10), isoelaeocarpine (11) và elaeocarpine (12) Kết quả khảo sát

hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất này có khả năng liên kết mạnh với cơ quan

thụ cảm δ-opioid Đặc biệt hợp chất 9 cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan

thụ cảm δ-opioid với IC50 là 2,7 µg/ml [22]

Hình 3 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides

Ngoài ra, các dẫn xuất của axit ellagic cũng được tìm thấy trong một số loài

của chi Elaeocarpus Khi nghiên cứu về loài Elaeocarpus parvifolius, K Nabeta và

cộng sự đã phân lập được các hợp chất là 4-O-methylellagic acid 3 0-(200,300

-di-O-acetyl)-a-rhamnoside(13), methylellagic acid 3 0 -a-rhamnoside (14), methylellagic acid 3 0 -(300 -O-acetyl)-a-rhamnoside (15), and 4-O-methylellagicacid 3 0 -(400 -O-acetyl)-a-rhamnoside (16)[10] Trong đó, hợp chất 13 và 15 cho

4-O-hoạt tính kháng ký sinh trùng babesia rất đáng quan tâm Các dẫn xuất của axitellagic cũng được tìm thấy trong loài Elaeocarpus mastersii như hợp chất 4,40-O-

dimethylellagic acid 3-(200,300-di-O-acetyl)-a-l-rhamnoside (17)

Mặt khác, cũng từ loài này, các nhà khoa học đã phân lập được hai hợp chất

triterpen cucurbitacin D (18) và cucurbitacin F (19) có hoạt tính gây độc tế bào rất

khả quan trên các dạng tế bào ung thư khác nhau với các giá trị ED50 trong khoảng0,01 – 1,9 µg/ml [5]

Hình 4 Một số hợp chất phân lập từ loài E parvifolius và E mastersi

Từ dịch chiết vỏ cây của loài Elaeocarpus habbemensis, thu thập ở phía

nam tỉnh Papua New Guinea, tháng 01 năm 1999 Peter L Katavic và các cộng sự

đã phân lập được hai hợp chất alkaloid pyrrolidine mới đó là habbemines A (20)and B (21) như là một đồng phân quang học của nhau hỗn hợp đồng phân

habbemines A and B cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan thụ cảm

δ-opioid của người với IC50 là 32,1 µM [24]

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis

1.3 Tổng quan về bệnh ung thư

1.3.1 Cơ sở khoa học của bệnh ung thư

Ung thư là một tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khácnhau về nguồn gốc của tế bào, căn nguyên, tiên lượng và cách thức điều trị nhưngcó những đặc điểm chung, đó là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào, khảnăng tồn tại và phát triển của các cơ quan và tổ chức lạ.

Các khối u thường được sinh ra từ một tế bào ban đầu và phải mất nhiều nămcho tới khi có một kích thước đủ lớn để có thể nhận thấy được Quá trình phát triểntừ một tế bào duy nhất thành một khối u trải qua nhiều giai đoạn Thông thường, các

tế bào lành có một tuổi nhất định và tuân thủ theo một quy luật chung là “phát triển– già – chết” Các tế bào chết đi lại được thay thế bằng các tế bào mới Cơ thể có

một cơ chế kiểm soát quy luật này một cách chặt chẽ và duy trì số lượng tế bào ởmỗi cơ quan, tổ chức ở mức ổn định.

Bệnh ung thư bắt đầu khi có một tế bào vượt qua cơ chế kiểm soát này củacơ thể, phát triển và sinh sôi không ngừng, hình thành một đám tế bào có chung mộtđặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan và tổ chứcxung quanh Các tế bào ung thư có liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ,theo mạch máu và mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và các cơ quan mới, bám

lại và tiếp tục sinh sôi nảy nở (quá trình này gọi là di căn) Các ung thư chèn ép

hoặc di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống của cơ thể bệnh nhân như não,phổi, tim, gan và dẫn đến tử vong.

Ung thư thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thưngực và ung thư ruột Theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế(International Agency for Research on Cancer, IARC) thì năm 2002, trên toàn thếgiới ước tính có khoảng 10,9 triệu người mới mắc bệnh ung thư Nhìn chung sốbệnh nhân ung thư ngày càng tăng.

1.3 2 Chu kỳ tế bào

Các tế bào của sinh vật Eukaryotae trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau vàkết thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới Toàn bộ quá trình tế bào đến tế bàothế hệ kế tiếp được gọi là chu trình tế bào, gồm 4 giai đoạn: M, G1, S và G2. Nếu tế

bào có chu kỳ bị tạm thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như lâm vàomột trạng thái tĩnh lặng gọi là pha G0 [3]

Hình 6: Chu kỳ tế bào

Pha G0 (hay là thời kỳ sau nguyên phân) trong pha này tế bào không tham gia vàochu kỳ và ngừng phân chia

Pha G1: Kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến bắt đầu sao chép vật chất di

truyền Sự tích lũy vật chất nội bào đến một điểm nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bàobắt đầu tổng hợp ADN.

Pha S: là giai đoạn tổng hợp ADN

Pha G2: Trong suốt giai đoạn này số lượng ADN tăng gấp đôi cho đến khi tế bào

phân chia.

Pha M: là giai đoạn nguyên phân

Các thuốc chống ung thư thường được phân loại theo phương thức hoạt độngcủa chúng Nhiều tác nhân chống ung thư hoạt động theo cách thức phụ thuộc vàochu kỳ tế bào.

 Tác nhân alkyl hóa (alkylants)

 Tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất

 Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme ADN Gây độc trong quá trình phân bào

 Vacxin và kháng thể

1.3.2.1 Các tác nhân alkyl hóa (alkylants)

Electrophiles là những chất có khả năng liên kết cộng hóa trị với ADN tại mộtđiểm Chúng tạo ra liên kết giữa hai điểm trên cùng một sợi ADN (cầu nối sợi đơn)hoặc trên sợi đôi ADN (cầu nối liên sợi) gây phá vỡ ADN Trong nhóm này, các vídụ điển hình là cyclophosphamide (Endoxan), carmustine, cis-plantin (Neoplatine),melphalan (Alkeran) và chlorambucil (Leukeran) Các chất trong lớp này hoạt độngtrên pha sinh trưởng (G1) của chu kỳ tế bào.

Hình 7: Các tác nhân alkylants

1.3.2.2 Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất (ức chế quá trình tổnghợp acid nucleic).

Cytosine arabinoside là chất can thiệp vào quá trình tổng hợp ADN và chuyển đổi

nhanh chóng vào triphosphate arabinoside cytosine gây tổn thương ADN trongpha S Cytosine arabinoside ức chế enzyme ADN, ARN polymerase và enzymenucleotide reductase cần thiết để tổng hợp ADN Khi được sử dụng như là một chứcnăng kháng virus thì cytarabine sẽ ức chế deoxycytidine [16].

Methotrexate có khả năng ức chế dihydrofolate reductase (DHFR), một loại enzyme

tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit fonic.[25] Ái lực của methotrexate với

DHFR gấp 1000 lần so với folate DHFR xúc tác chuyển đổi dihydrofolate đếnhoạt động tetrahydrofolate Axit folic là cần thiết cho tái tổng hợp nucleosidethymidine và tổng hợp ADN Ngoài ra, folate là cần thiết để tổng hợp purine Dođó, tất cả tổng hợp purine sẽ bị ức chế Methotrexate ức chế sự tổng hợp của DNA,RNAs, và proteins.

5-flourouracile là một trong những chất điển hình của lớp chất chống ung thư loại

này Hoạt tính chống ung thư của fluorouracile nhờ chuyển hóa thành fluorodesoxyuridine monophosphate Hợp chất này chính là chất ức chế đặc hiệuđối với thymidilate-synthetase – chất chịu trách nhiệm xúc tác quá trình methyl hóaaxit desoxyuridilique thành axit thymidilic.

5-Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất1.3.2.3 Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome

Girolline là một dẫn xuất 2-aminoimidazole Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng

girolline có tác dụng ức chế tổng hợp protein và làm ngừng chu kỳ tế bào ở giaiđoạn G2

Homoharringtonine là một alkaloid được phân lập từ cây Cephalotaxus

harringtonia, thuộc họ (Cephalotaxaceae) Hợp chất này có khả năng ức chế tổng

hợp protein bằng cách tác động sớm vào giai đoạn kéo dài peptide [30]

Hình 9: Ức chế tổng hợp protein

1.3.2.4 Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme topoisomerase I và IITác nhân đan xen vào chuỗi AND

Doxorubicin tương tác với ADN bằng cách đan xen và ức chế sinh tổng hợp đại

phân tử [11] [18] Nhờ vào cấu trúc phẳng, doxorubicine có khả năng xen vào giữacác vòng xoắn được tạo thành giữa các bazơ của chuỗi ADN và như vậy ngăn chặnquá trình sao mã.

Với cơ chế hoạt động tương tự, trong lớp chất này còn có actinomycin D [27] Đây

là một cyclopeptid có chứa phần cấu trúc phẳng được hình thành từ các vòng thơm.

Hình 10: Các chất đan xen chuỗi AND

Ức chế enzyme topoisomerase I và II

Topotecan là một dẫn xuất bán tổng hợp của camptothecin Camptothecin là một

sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ vỏ cây của loài Camptotheca acuminata.

Topoisomerase-I là một enzyme có chức năng tháo xoắn một mạch Khitopoisomerase-I tháo xoắn sợi đơn, topotecan xen giữa các bazơ của ADN Sự đanxen này sẽ phá vỡ quá trình sao chép ADN và cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào.Các tế bào động vật có vú không thể sửa chữa những sợi đôi bị phá vỡ này.[26]

Trong nhóm ức chế enzyme topoisomerase-I, Irinotecan cũng là một trong những

chất điển hình của nhóm này.

Etoposide tạo thành một phức hợp với ADN và enzyme topoisomerase II, ngăn

ngừa sự co xoắn của sợi ADN và dẫn đến phá vỡ sợi ADN.[13,12].

Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II1.3.2.5 Gây độc trong quá trình phân bào

Colchicine ức chế vi ống trên thoi gián phân bằng cách liên kết với tubulin, một

trong những thành phần chính của vi ống Tubulin là cần thiết để điều khiển quátrình phân bào và do đó colchicine có chức năng như một “chất độc phân bào hoặc chất độc của thoi” [36].

Vincristine và Vinblastine là alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn Catharanthus

roseus (L.)G.Don Chúng ngăn chặn nhưng có thể phục hồi được sự phân chia gián

phân ở giai đoạn trung kỳ Nhờ sự liên kết của thuốc với các vi cấu trúc hình ốngkhi gián phân, vincristine ức chế được sự tạo thành thoi gián phân Trong tế bào ungthư, vincristine ức chế một cách chọn lọc cơ chế sửa đổi ADN ; và bằng cách ức chếARN-polymerase phụ thuộc ADN, vincristine ức chế được sự tổng hợp ARN Ởnồng độ cao vinblastine có thể hiện nhiều tác dụng phức tạp tổng hợp acid nucleicvà protein [37].

Hình 12: Các tác nhân chống lại quá trình phân bào1.3.2.6 Vacxin và kháng thể

Một cách tiếp cận trong cuộc chiến chống lại ung thư là nghiên cứu vaccinhoặc các kháng thể đặc hiệu cho các thụ thể của tế bào ung thư Phát triển trong lĩnhvực sinh học và công nghệ sinh học để xác định các yếu tố chịu trách nhiệm cho sựgia tăng của các tế bào khối u và sản xuất kháng thể đặc hiệu.

Vaccin CDX-110 phòng chống các bệnh u thần kinh đệm, một loại u não áctính và thường gặp nhất Vaccin nhắm vào khối u, gây ra một phản ứng miễn dịchđặc hiệu để chống lại một loại protein ở trên bề mặt của các tế bào ung thư não,protein này là dạng thụ thể màng tế bào đột biến, có tên gọi là EGFRvIII, liên quanđến sự tăng trưởng của ung thư.

Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Gorgia Mỹ vừa nghiên cứu một loại

ung thư có tỷ lệ tử vong cao như hiện nay: ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ungthư đường ruột và ung thư buồng trứng…Vaccin này có chứa một lượng nhỏ cácprotein có tên là MUC1, có tác dụng luyện tập cho hệ miễn dịch cơ thể, từ đó hệmiễn dịch có thể nhận biết sự xuất hiện của tế bào ung thư và hệ miễn dịch có thểchủ động tấn công [38].

Cevac là một loại vắc-xin chống lại bệnh ung thư đại tràng, là một kháng

thể đơn dòng gây ra một phản ứng miễn dịch với CEA (Carcino EmbryonicAntigen) Kháng nguyên CEA này hiện diện trong ung thư ruột.

Mặt khác, việc điều trị kết hợp các loại vaccin với thuốc hóa trị liệu làm tăngtỷ lệ sống sót: Herceptin thường gắn liền với taxol và ceavac được dùng cho bệnhnhân kết hợp với fluorouracil-5 và leucovorin.

Đề kháng với các chất chống ung thư là một trong những thách thức lớn củahóa trị liệu Sự đề kháng này được gây ra bởi nhiều yếu tố và cơ chế vẫn chưa đượchiểu rõ Yếu tố có thể là do:

- Gây ra từ sự sửa chữa ADN giống như polymerase-β.

- Giảm sự xâm nhập của thuốc vào trong tế bào (làm giảm nồng độ của thuốc trongcác tế bào).

- Sự gia tăng từ trong ra ngoài của các khối u tế bào đa kháng

- Hấp thụ thuốc trong tế bào ngăn, ngăn cản tiếp xúc của thuốc với tế bào mangbệnh

- Sự biến đổi hoặc thay đổi enzyme đích.

Điều trị ung thư bằng vaccin cũng có nhiều tác dụng phụ và đôi khi còn gâychết người Với những thách thức này, việc tìm kiếm các loại thuốc mới chống ungthư là cần thiết và các phân tử từ tự nhiên luôn là nguồn tài nguyên quý giá.

1.3.3 Ứng dụng của các hợp chất tự nhiênt trong điều trị ung thư

Hiện nay, ung thư vẫn là bài toán khó đối với y học và là căn bệnh đáng sợ nhất của con người do chưa có thuốc đặc trị Vì thế, các nhà khoa học vẫn không ngừng

kiếm tìm các hợp chất mới để tiêu diệt căn bệnh của thời đại, nhất là khi các phươngpháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật đều để lại tác dụng xấu, nhiềubệnh nhân Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư

Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học và trên cơ sở đã bán tổng hợp và tổng hợp ra rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển và diệt tế bào ung thư như

Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Y khoa Sanford-Burnham, đứng đầulà Kristiina Vuori, MD, Ph.D., đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên là sceptrin được tìm thấy trong các loài bọt biển, làm giảm sự di chuyển của các tế bào ung thưvà có độc tính rất thấp.

Những nghiên cứu lâm sàng bước đầu đã chỉ ra rằng Curcumin có tác dụng tốt với một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư da, ung thưtrực tràng…

Một nghiên cứu của Đại học Missouri, Mỹ cho thấy, resveratrol-một hợp chất được tìm thấy trong quả nho và rượu vang đỏ có thể khiến một số tế bào ung thư như nhạy cảm hơn với xạ trị.

Ngày nay, các nhà khoa học vẫn đang miệt mài nghiên cứu nhằm tìm đượcnhững hợp chất có hoạt tính cao trong điều trị ung thư

1.4 Các phương pháp nghiên cứu độ độc tế bào

Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào

ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương

pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.

1.4.1 Phương pháp MTT

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổbiến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí

Immunological Methods năm 1983 [1] Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng

để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triểncủa tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thểcủa tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT

biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chínhxác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng pháttriển và hoạt động của tế bào.

1.4.2 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giáđộc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sànglọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRBlên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bàokhông bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm Phương phápSRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượngamino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kếtvới các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằngtrichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mậtđộ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.

1.5 Phân loại các hợp chất thứ cấp trong thực v tậ   

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ giathực phẩm có giá trị Nhữn sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp,thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chấtchưa được viết đầy đủ Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa họccủa thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động

vật Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triểntừ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong banhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.

Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý

trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm:codein, caffeine và morphine Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: câythuốc phiện (họ Papaveraceate; cây canh kin a (họ Rubiaceae); cây cà độc dược,thuốc lá và khoai tây Người ta thường gặp trong một cây tập hợp alkaloid có cấutrúc hóa học gần giống nhau Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, đôi khi chỉ tập trungtrong lá Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệthần kinh (caffeine, atropine, strychnine…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin,atropine…), một số tác dụng lên mạch máu, một số khác tác dụng lên bộ máy hôhấp Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng đượcsử dụng làm thuốc chữa bệnh.

Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và

dung môi Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước Terpênđược xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene,ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene.

Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các

cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùithực phẩm và dược phẩm.

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Cây Côm (E griffithii) được thu hái vào ngày 5 tháng 2 năm 2004 tại Qùy

Châu, Nghệ An và được ThS Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên – Viện Hànlâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên Mẫu tiêu bản số VN 1249 đượclưu trữ tại Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam.

Vỏ cây tươi sau khi sấy khô, xay nhỏ thu được 1,4 kg nguyên liệu.

2.1.2 Các dạng tế bào

Các dạng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB (Human

epidermic carcinoma) – ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các

phép thử độ độc tế bào; và MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.2.1.3 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật

Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 Merk, độ dày 0,2mm.

Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của việnHóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance 500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.

2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào: AMEM và AMEM có bổ sung 1% insulin,trypsin-EDTA (Gibco, Hoa kỳ)

Dung môi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO

Tủ ấm CO2 (Innova CO-170); Tủ cấy vô trùng cấp I ( Labcaire), cấp II(SterilGard II);

Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL)Tủ lạnh sâu -25oC, - 800C

Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ)Máy quang phổ (GENios Tecan)

Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thôngthường khác.

2.2 Phương pháp nghiên cứu2.2.1 Các phương pháp hóa học

2.2.1.1 Phương pháp chiết dịch etylaxetat tổng

Dựa vào nguyên lý chiết và tài liệu tham khảo chúng tôi thực hiện ngâmchiết với dung môi có độ phân cực tăng dần Thực hiện ngâm chiết mẫu lần lượtvới các dung môi etylaxetat và MeOH ở nhiệt độ thường Mỗi loại dung môi tiếnhành ngâm chiết 3 lần, mỗi lần trong vòng 24h.

2.2.1.2 Sắc ký cột (Colum chromatography - CC)

Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chấtdựa vào độ phân cực của chúng hoặc tùy theo kích thước phân tử Trong nghiêncứu này, việc phân lập các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang làsilica gel (hệ dung môi rửa giải với độ phân cực tăng dần) hoặc gel LH-20.

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck loại 40 63m với dung môi rửa giải thích hợp.

-2.2.1.3 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer Chromatography – TLC)

S¾c ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xácđịnh số lượng các nhóm chất khác nhau có trong thành phần dịch chiết thực vật

hoặc các phân đoạn tách ra từ đó Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độdịch chuyển khác nhau nên tách ra ở vị trí khác nhau Đây là phương pháp vi lượng,hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày0,25 mm Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng (λ = 254 nm và λ = 366nm ) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2.

Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi cho độphân tách tốt là quan trọng nhất Cụ thể với các yêu cầu khảo sát thì chọn hệ dungmôi sao cho các vệt phân tách nhau tốt nhất.

2.2.1.4 Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)

Khối phổ là một trong các phương pháp được sử dụng để xác định khốilượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát triển ra ion phân tử, từ đó giúpxây dựng công thức phân tử.

Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectra)được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hóa học, ViệnKhoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Nuclear magnetic resonance spectrometry - NMR)

Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợpchất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tửkhi được đặt trong một từ trường Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liênquan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số

tương tác spin – spin J Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép

xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMRSpectrometer, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Namvới TMS là chất chuẩn nội.

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ

(NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chấtcó khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trườngnuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh bê (FBS) và các thành phầncần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37 oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệtđối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyểncũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử hoạt độc tính.Mẫu thô có IC50  50 g/ml; chất sạch có IC50  30 g/ml được đánh giá là cóhoạt tính gây độc tế bào, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.

Thử độc tế bào:

- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml;2g/ml; 0,5g/ml Bổ xung 200l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tếbào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào3x104 tế bào/ml Ủ ở 370C/ 5% CO2 trong 72h.

- Sau 72h thêm 50 l MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyếtthanh) và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọckết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

GI %= OD đ i ều khiể n−ODm ẫuOD đ iề ukhi ể nx 100

GI: Phần trăm kìm hãm sự phát triển

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.

Thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.3 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm 2.3.1 Thành phần hóa học

2.3.1.1 Phân lập cặn chiết etylaxetat

Vỏ cây được thu hái, phơi khô trong bóng mát, sấy khô ở 40-50oC cho đến khiđộ ẩm đạt ≤ 13% và nghiền nhỏ cân được 1,44 kg Nguyên liệu này được ngâmchiết lần lượt với etylaxetat (3 lần, mỗi lần 24 giờ), sau đó là MeOH (3 lần, mỗi lần

Vỏ cây Côm (1,44 kg)

Ngâm chiết trong Et (3 lần, mỗi lần 24h ) Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

24 giờ), thu được các dịch chiết tương ứng là etylaxetat và MeOH Các dịchchiết này được cất loại dung môi dưới áp suất thấp, kết quả thu được 52g cặn chiếtetylaxetat và 172,8 g cặn chiết MeOH Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi chỉ tậptrung nghiên cứu phần cặn chiết EtOAC Quy trình tách chiết dịch etylaxetat đượctrình bày theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tách chiết dịch etylaxetat từ vỏ cây Côm2.3.1.2 Phân lập các chất có trong cặn chiết etylaxetat

Cặn chiết etylaxetat được phân tách bằng sắc ký cột trên cột silica gel, hệdung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần từ 0 - 30 %, thu được5 phân đoạn được ký hiệu từ E1 – E5 Phân đoạn E1 được phân tách trên cột silicagel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 50- 70%thu được 24 phân đoạn ký hiệu là E1.1-E1.24 Phân đoạn E1.7 được tinh chế trêncột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dầntừ 2- 40% thu được 2 phân đoạn ký hiệu là E1.7.1 và E1.7.2 Phân đoạn E1.7.1 tiếptục được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/CH2Cl2 gradient (95:5)và giải hấp cột với hệ dung môi CH2Cl2 / MeOH gradient cho hợp chất F1 (12 mg).

Phân đoạn E1.12 được kết tinh lại trong hệ n-Hexan:diclometan (3:7) thu được 103

mg tinh thể hình kim, màu trắng Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol dựa

vào việc so sánh điểm nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (TLC) với hợp chất

β-sitosterol chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm

Phân đoạn E2 xuất hiện chất rắn màu trắng, chất rắn được lọc và rửa lạinhiều lần với hệ CH2Cl2/MeOH, thu được 45 mg hợp chất F2 Ngoài ra, dịch lọc

được quay khô rồi tinh chế trên cột silica gel với dung môi rửa giải là CH2Cl2 /MeOH gradient thu được 30 mg chất bột màu trắng Hợp chất này được nhận dạng

là β-sitosterol glucoside dựa vào việc so sánh nóng chảy và sắc ký lớp mỏng (TLC)

với hợp chất β-sitosterol glucoside chuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm.

Phân đoạn E5 được phân tách trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/HCOOH (80:15:5) gradient thu được 11 phân đoạn ký hiệu là E5.1-E5.11.Tinh thể của phân đoạn E5.4 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 cho hợp chất

F3 (7 mg) Tinh thể của phân đoạn E5.9 tiếp tục được tinh chế lại trên cột sephadexLH-20 thu được hợp chất F4 (5 mg).

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất của dịch EtoAc từ vỏ cây Côm

2.3.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được từ dịchchiết etylaxetat

Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các phương pháp đãnêu trong phần 2.2.2

Cân 3mg chất cần thử, hòa tan bằng DMSO (150μl) có giếng chất nồng độđầu là 20mg/ml Tiến hành pha loãng tiếp theo tỉ lệ ¼ để được các nồng độ chất thửtiếp theo Chất sau khi hòa tan trong DMSO được pha loãng về các nồng độ thấphơn bằng nước cất cho các nồng độ lần lượt là 2,56 mg/ml; 0,64 mg/ml;0,16 mg/ml;0,04 mg/ml; 0,01 mg/ml Sử dụng 10 μl chất thử đã pha loãng cho mỗi giếng thửnghiệm để được các nồng độ 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml; 2g/ml; 0,5g/ml.

Tiến hành thử theo các phương pháp đã nêu.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong khuôn khổ dự án Pháp – Việt về “Nghiên cứu hóa thực vật thảm thực

dịch chiết etylaxetat của vỏ cây Côm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tếbào KB (ức chế 89,45 % ở nồng độ 1 µg/ml) Chính vì vậy vỏ cây Côm được tiếnhành tách chiết và phân lập các chất theo các phương pháp đã trình bày ở mục

2.3.1.1 và mục 2.3.1.2

3.1 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết etylaxetat

Từ cặn chiết EtoAc chúng tôi tiến hành phân lập các hoạt chất theo sơ đồ 2.2.

Kết quả thu được 4 chất sạch kí hiệu là F1-F4 Các chất này được xác định cấu trúc

hóa học bằng cách kết hợp các phương pháp phổ và so sánh số liệu phổ của chúngvới các dữ liệu phổ đã được công bố.

3.1.1 Chất F1 (pentacosyl ferulate)

Trên phổ EI-MS của F1 cho thấy sự xuất hiện của pic ion phân tử [M]+ tạim/z 544 Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl ở trường caoδH 0,88 (t, J = 7 Hz, CH3-25’) và một nhóm methoxy (OCH3) ở δH 3,915 Ở vùngtrường thấp thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton đặc trưng cho vòng thơm bị thế hệABX, ở δH 6,86 (d, J = 8 Hz, H-5), 7,05 (dd, J = 2 Hz và 8 Hz, H-6) và 7,08 (d, J =2 Hz, H-2) Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 proton alken có cấu hình trans (E) ở δH

6,39 (d, J = 16 Hz, H-8) và 7,61 (d, J = 16 Hz, H-7) Ngoài ra còn có tín hiệu của 24

nhóm methylen, trong đó nhóm methylen có tín hiệu proton ở δH 4,10 (t, J = 6,5 Hz,

CH2-1’) cho thấy nhóm này liên kết với dị tố oxy.

Trên phổ 13C NMR và DEPT của F1, ngoài các tín hiệu tương ứng với các

nhóm đã được quan sát trên phổ 1H NMR, còn xuất hiện tín hiệu của nhómcacbonyl cacboxylate tại δC 167,8 và 3 cacbon thơm bão hòa ở δC 126,1, 147,4 và148,5 Các cacbon ở δC 147,4 và 148,5 cho thấy chúng được liên kết vớinguyên tử oxy.

Kết hợp pic ion phân tử trên phổ khối lượng với các tín hiệu 1D NMR,công thức phân tử của chất F1 được xác định là C35H60O4 Phân tich phổ 2DNMR cho thấy sự có mặt của 2 mảng cấu trúc của hợp chất F1: A) axit ferulic,B) pentacosan-1-ol Việc kết nối giữa 2 phần cấu trúc này được thực hiện nhờphân tích phổ HMBC Trong đó tương tác giữa cacbon cacboxylate ở với proton

của nhóm CH2-1’ ở được quan sát thấy trên phổ HMBC của F1 Điều này chothấy hợp chất F1 là ester của axit ferulic và pentacosan-1-ol Như vậy hợp chấtF1 được xác định là pentacosyl ferulate Hợp chất này đã được phân lập trước

đây từ loài Bauhainia manca.

Hình 13: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F1trong DMSO

δC Độ chuyển dịch hóa học của C

δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

3.1.2 Chất F2 (Axit 3,3’,4’-tri-O-metyl-4-[O-β-D-(2”-acetyl)-glucopyranoside]-ellagic)Hợp chất F2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS

cho pic ion giả phân tử [M+Na]+ ở m/z 571 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất F1, cho

tín hiệu của 3 nhóm metoxy ở δH 3,91 (s, 3H); 3,97 (s, 3H); 3,99 (s, 3H) và tín hiệu của

2 proton vòng thơm ở δH 7,32 (s, 1H) và 7,71 (s, 1H) Ngoài ra, còn có tín hiệu của 1

nhóm axetyl ở δH 2,10 và các proton của đường nằm trong khoảng δH 3,39-5,36 trong

đó proton anome H-1” ở δH 5,36 (d, J=8,0 Hz, 1H) Phổ 13C-NMR và DEPT xác nhận

sự có mặt của các tín hiệu của 25 cacbon trong đó có nhóm đường [δC 60,4 (CH2-6”),69,6 (C-5”), 73,5 (C-3”), 73,7 (C-2”), 77,4 (C-4”), 98,9 (C-1”)], 3 nhóm metoxy, 1nhóm axetyl và 14 cacbon sp2 Độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu tại δC 157,6(C-7’) và 157,8 (C-7) cho thấy nhiều khả năng đây là các tín hiệu của nhóm cacbonyl

lacton Các dữ kiện thu được cho phép giả thiết F2 là dẫn xuất của axit ellagic Điều

này được khẳng định nhờ phân tích phổ HMBC (Hình 14) Ngoài ra, trên phổ HMBCcho thấy H-1” của nhóm đường tương tác với C-4 của khung axit ellagic chứng tỏnhóm đường gắn kết ở vị trí C-4 Tương tác giữa H-2’’ của nhóm đường với nhómcacbonyl của axetyl chứng tỏ nhóm axetyl gắn với đường ở vị trí C-2’’ Tương tự, 3nhóm OCH3 tạiδH 3,99, 3,97 và 3,91 đượcxác định tương ứng tại vị trí C-3, C-3’ và C-4’ nhờ tương tác giữa chúng trên phổ HMBC Kết hợp các phương pháp phổ 1D và

2D-NMR và so sánh với tài liệu đã công bố [32] Cho phép xác định hợp chất F2 là

axit 3,3’,4’-tri-O-metyl-4-[O-β-D-(2”-acetyl)-glucopyranoside]-ellagic

Hình 14: Cấu trúc hóa học của chất F2

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F2trong DMSO

δCδH m (J, đơn vị

CnoδCδH m (J, đơn vị Hz)

δC Độ chuyển dịch hóa học của C

δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

3.1.3 Chất F3 (axit 3,3’-di-O-metyl-4-O- -rhamnoside-ellagic)α

Hợp chất F3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy

186-187oC Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử [M+H]+ ở m/z 477 So sánh tín

hiệu phổ 1D NMR của F3 và F2 cho thấy có các sự khác biệt sau: thiếu tín hiệu của1 nhóm metoxy và tín hiệu của của phần glucopyranose của F2 được thay thế bằng

tín hiệu của đường rhamnopyranose [δC 17,9 (CH3-6”), 70,0 (C-2”), 70,3 (C-4”),70,4 (C-5”); 71,5 (C-3”), 99,8 (C-1”)] Phân tích phổ HMBC cho phép xác định liênkết của nhóm rhamnopyranose tại C-4 và 2 nhóm metoxy tại C-3 và C-3’ củakhung axit ellagic Phân tích chi tiết phổ 1D và 2D NMR và so sánh với tài liệu đã

được công bố [27]cho phép xác định hợp chất F3 là axit

3,3’-di-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic.

Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F3trong DMSO

δC Độ chuyển dịch hóa học của C

δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

Hình 15: Cấu trúc hóa học của chất F3

3.1.4 Chất F4 (Axit 3-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic)

Hợp chất F4 được phân lập dưới dạng chất bột trắng Phổ ESI-MS cho pic

ion phân tử [M+H]+ ở m/z 463 Phổ 1D NMR của F4 cho các tín hiệu gần giống với

3, ngoại trừ sự thiếu vắng tín hiệu của 1 nhóm metoxy Phân tích phổ 2D NMR và

so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất F4 được xác định là axit

3-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic [28]

Hình 16: Cấu trúc hóa học của chất F4

Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất F4trong DMSO

3’ 141,3 OMe-3 60,9 4,06 s

δC Độ chuyển dịch hóa học của C ; δHm Độ chuyển dịch hóa học của H multiplet

3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được từdịch EtOAc.

Các tế bào ung thư là những tế bào kém biệt hóa do sự phân chia quá nhanhchóng và diễn ra liên tục Chúng có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễndịch của cơ thể và tăng cường xâm lấn vào các tổ chức sống lân cận Những chất cókhả năng phòng chống và điều trị ung thư là những chất có khả năng ngăn ngừa sựhoạt động và bắt giữ các tác nhân gây ung thư, ức chế quá trình tiến triển bệnhthông qua sự ức chế hoạt động của một số enzyme hay tác động gây biệt hóa tế bào.Phép thử sinh học để sàng lọc và tìm kiếm các hoạt chất chữa trị bệnh ung thư sửdụng chính tế bào ung thư làm đối tượng nghiên cứu.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các dịch chiết thô của cây Côm cũng đượckiểm tra hoạt tính ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư thông qua phép thửđộc tế bào với 02 dòng tế bào ung thư đặc trưng được lựa chọn là KB (ung thư biểumô), MCF-7 (ung thư vú) Kết quả thử độc tế bào được trình bày ở bảng 3.5.

Bảg 3.5: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các chất phân lập được từ cây Côm

Hợp chất F4 và F1 không thể hiện hoạt tính trên cả 2 dòng tế bào ung thư thử

nghiệm với giá trị IC50>128 μg/ml Chất đối chứng dương Elipticine thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả hai dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng từ 0,31μg/ml- 0,53 μg/ml, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây Mặt khác,

hợp chất F3 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB với giá trị

IC50 là 28,3 μg/ml, trong khi đó hợp chất này hầu như không thể hiện hoạt tính trên

dòng MCF-7 So sánh cấu trúc hợp chất F3 và F4 cho thấy 2 hợp chất này chỉ khácnhau về sự có xuất hiện của nhóm methoxy trong hợp chất F3 Hợp chất F3 thể hiệnhoạt tính gây độc tế bào trên dòng KB cao hơn so với hợp chất F4 Như vậy nhóm

chức methoxy có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính ức chế dòng tế bào

KB của chất F3 Chất F2 có hoạt tính ức chế khá cao trên 2 dòng tế bào KB và

MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 7,04 μg/ml và 24,8 μg/ml Như vậy, chất F2 đượcđánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào khá mạnh Các kết quả thử nghiệm gây độctế bào đối với các dòng tế bào ung thư thực nghiệm trên đây cho phép sử dụng F2như một hoạt chất có nguồn gốc thảo dược trong việc phòng và điều trị ung thư , cókhả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư biểu mô và ung thư vú.

Hình 17: Kết quả ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB

Hình 18: Kết quả ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7

Cặn chiết tổng ban đầu etylaxetat có hoạt tính ức chế rất cao trên dòng tế bàoKB với giá trị IC50 <1,0 μg/ml Trong khi đó các hợp chất sạch phân lập được từ cặnchiết EtOAc của cây Côm có hoạt tính gây độc tế bào ung thư yếu hơn so với kếtquả thu được đối với cặn tổng ban đầu Điều này có thể giải thích là hợp chất cóhoạt tính mạnh có hàm lượng thấp, nên chưa phân lập được hoặc có thể xẩy ra hiệntượng hiệp đồng giữa các chất có trong cặn chiết ban đầu.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận:

1 Loài Côm Elaeocarpus griffithi đã được nghiên cứu hóa học theo định hướng

hoạt tính sinh học Lần đầu tiên từ cây này đã phân lập và xác định cấu trúc hóahọc của 4 chất, đó là:

(1) Chất F1: Pentacosyl ferulate

(2) Chất F2: Axit

(3) Chất F3: Axit 3,3’-di-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic(4) Chất F4: Axit 3-O-metyl-4-O-α-rhamnoside-ellagic

2 Kết quả khảo sát hoạt tính của 4 chất phân lập được là F1, F2, F3, F4 cho thấy:  Chất F2 có hoạt tính độc trên 2 dòng tế bào là KB và MCF7 với giá trị IC50 lần

lượt là 7,04 μg/ml và 24,8 μg/ml là hoạt chất có tiềm năng trong việc nghiên cứusử dụng làm thuốc hỗ trợ và phòng chống ung thư vì có tác dụng gây độc tế bàotrên 2 dòng tế bào ung thư là ung thư biểu mô và ung thư vú Đặc biệt là tínhgây độc cao ở tế bào ung thư biểu mô Vì vậy, cần nghiên cứu sâu hơn về hoạttính hướng đích trong chữa trị ung thư của hoạt chất này.

 Chất F3 thể hiện hoạt tính gây độc trên dòng ung thư biểu mô KB với giá trị IC50là 28,3 g/ml.

 Chất F4 và F1 không có hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào thử nghiệm với giá

trị IC50>128 μg/ml.

Kiến nghị:

Như đã trình bày trên đây, do các hợp chất sạch phân lập được từ cặn chiếtEtOAc của cây Côm thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư KB yếu hơn nhiều sovới kết quả thu được đối với cặn tổng ban đầu Như vậy cần tiếp tục nghiên cứuphân lập và xác định cấu trúc hóa học của cặn chiết EtOAc của cây Côm, nhằm xác