NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI HẢI MIÊN Haliclona varia (Bowerbank, 1875)

Biển và đại dương chiếm khoảng 71% diện tích bề mặt trái đất, là nguồn tài nguyên vô cùng đáng quý do ở đó có tới 34 trong số 36 ngành sinh vật trên trái đất sinh sống. Ước tính có trên 25 triệu loài sống ở đại dương, bao gồm động thực vật như rong biển, ruột khoang, rêu biển, thân mềm, các loài vi khuẩn biển. Biển cung cấp cho con người những thực phẩm đáng kể, chủ yếu là các loài cá, động vật giáp xác, động vật có vú và rong biển.v.v. Ngoài vai trò to lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm, những sản phẩm của đại dương cũng đang dần được nghiên cứu và sử dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm. Ban đầu là những dược phẩm từ cá như viên dầu cá hồi omega3, viên sụn cá mập, tiếp sau đó là các sản phẩm từ rong tảo. Trong những năm gần đây, với sự hỗ trợ của các kỹ thuật tiên tiến, nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loài hải miên, san hô mềm, sao biển, hải sâm đã được phân lập, xác định cấu trúc, mô tả rõ đặc điểm của hợp chất, đánh giá hoạt tính sinh học. Nhiều hợp chất trong số đó đã được nghiên cứu phát hiện và đang được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh ung thư như: cytarabine (araC), variabilin, và agosterol A.... Việt Nam là quốc gia có ba mặt tiếp giáp biển với bờ biển dài 3.260 km chạy dọc từ Bắc vào Nam, hàng nghìn hòn đảo lớn nhỏ. Thêm vào đó, Việt Nam là nước nhiệt đới với bốn miền khí hậu chủ yếu. Các điều kiện này đã tạo ra nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú với 12.000 loài đã biết bao gồm 2.038 loài cá, 6.000 loài động vật đáy, 635 loài rong biển và hàng ngàn loài động thực vật phù du... Việc nghiên cứu về nguồn hợp chất tự nhiên biển của nước ta bắt đầu từ những năm 70 của thế kỷ 20 nhưng từ đó đến năm 2010 cũng chưa có nhiều công trình liên quan được công bố. Việc khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển nói chung, các loài hải miên nói riêng đang là vấn đề quan tâm hiện nay. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới đã chỉ ra các loài Hải miên có cấu trúc hóa học đa dạng và phong phú, nhiều hợp chất đã được phát hiện có hoạt tính sinh học lí thú. Xuất phát từ điểm đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài hải miên Haliclona varia (Bowerbank, 1875)”. Đề tài bao gồm các nội dung sau: 1. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên Haliclona varia. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài hải miên Haliclona varia. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được trên một số dòng tế bào ung thư ở người.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -

DƯƠNG THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ

LOÀI HẢI MIÊN Haliclona varia (Bowerbank, 1875)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -

DƯƠNG THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI

HẢI MIÊN Haliclona varia(Bowerbank, 1875)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCChuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số: 60440114

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS HOÀNG LÊ TUẤN ANH2 PGS TS PHAN MINH GIANG

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài trọng điểm cấp Viện Hànlâm: “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập các chất có hoạt tínhkháng ung thư của một số loài Hải miên Việt Nam”.

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bảnthân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phan Minh Giang – KhoaHóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và TS Hoàng LêTuấn Anh - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,những người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu vàhoàn thành luận văn Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp thuộc phòngNghiên cứu cấu trúc, Viện Hoá sinh biển đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôitrong suốt thời gian làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Trường Đại học Khoa họcTự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gianhọc tập tại trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn học viên lớp Cao học Hoá học K24,Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã động viên vàgiúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.

Tôi trân trọng và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã động viên và giúpđỡ tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn này

Hà Nội, 12/2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này làtrung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận văn đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Hà Nội, 12/2015

Dương Thị Hải Yến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các loài hải miên 3

1.1.1 Giới thiệu chung về hải miên[5] 3

1.1.2 Giới thiệu chung về chi Haliclona 4

1.1.3 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Haliclona 5

1.3.3.1 Trên thế giới 5

1.3.3.2 Ở Việt Nam 15

1.1.4 Vài nét về bệnh ung thư 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 19

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 20

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 20

Chương 3 THỰC NGHIỆM 23

3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu 23

3.2 Phân lập các hợp chất 23

3.3 Các thông số vật lí của các hợp chất đã phân lập 25

3.3.1 Hợp chất 1: 3β-hydroxycholest-5-en-7-one 25

3.3.2 Hợp chất 2: 22(E)-3β-hydroxycholesta-5,22-dien-7-one 25

3.3.3 Hợp chất 3: 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene 26

3.3.4 Hợp chất 4: 3β,7β-dihydroxycholest-5-ene 26

3.3.5 Hợp chất 5: 5α,8α-epidioxycholesta-6,9(11)-dien-3β-ol 26

3.3.6 Hợp chất 6: 5α,8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol 26

3.3.7 Hợp chất 7: solomonsterol A 27

3.4 Đánh giá khả năng diệt tế bào ung thư in vitro của các hợp chất 27

4.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 28

4.1.1 Hợp chất 1: 3β-hydroxycholest-5-en-7-one 28

4.1.2 Hợp chất 2: 3β-hydroxycholest-5,22-dien-7-one 33

4.1.3 Hợp chất 3: 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene 38

4.1.4 Hợp chất 4: 3β,7β-dihydroxycholest-5-ene 43

4.1.5 Hợp chất 5: 5α,8α-epidioxycholesta-6,9(11)-dien-3β-ol 46

4.1.6 Hợp chất 6: 5α,8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol 51

4.1.7 Hợp chất 7: solomonsterol A 55

4.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất đã phân lập 61

Kết luận 63

Tài liệu tham khảo 64

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất tham khảo 29Bảng 2 Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất tham khảo 34Bảng 3 Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 39

Bảng 4 Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và chất tham khảo 43

Bảng 5 Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và chất tham khảo 48

Bảng 6 Số liệu phổ NMR của 6 và hợp chất tham khảo 52

Bảng 7 Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 56

Bảng 8 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 2, 3,4, 5và 7 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh một số loài hải miên thuộc chi Haliclona 4

Hình 2 Hình thái tổ chức của mô từ dạng bình thường đến khi phát triểnthành khối u[2] 16

Hình 3 Mẫu hải miên Haliclona varia thu thập tại Cô Tô 23

Hình 4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên H varia 25

Hình 5 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 28

Hình 6 Phổ khốilượng của hợp chất 1 30

Hình 7 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 30

Hình 8 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 31

Hình 9 Phổ DEPT của hợp chất 1 31

Hình 10 Phổ HSQC của hợp chất 1 32

Hình 11 Phổ HMBC của hợp chất 1 32

Hình 12 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 33

Hình 13 Phổ khốilượng của hợp chất 2 35

Hình 14 Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 35

Hình 15 Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 36

Hình 16 Phổ DEPT của hợp chất 2 36

Hình 17 Phổ HSQC của hợp chất 2 37

Hình 18 Phổ HMBC của hợp chất 2 37

Hình 19.Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 3 38

Hình 20 Phổ khối lượng của hợp chất 3 40

Hình 21 Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 40

Hình 22 Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 41

Hình 23 Phổ DEPT của hợp chất 3 41

Hình 24 Phổ HSQC của hợp chất 3 42

Hình 26 Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 43

Hình 27 Phổ khốilượng của hợp chất 4 44

Hình 28 Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 45

Hình 29 Phổ 13C-NMR của hợp chất 4 45

Hình 30 Phổ DEPT của hợp chất 4 46

Hình 31 Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 và chất tham khảo 46

Hình 32 Các tương tác HMBC chính của hợp chất 5 47

Hình 33 Phổ 1H-NMR của hợp chất 5 49

Hình 34 Phổ 13C-NMR của hợp chất 5 49

Hình 35 Phổ DEPT của hợp chất 5 50

Hình 36 Phổ HSQC của hợp chất 5 50

Hình 37 Phổ HMBC của hợp chất 5 51

Hình 38 Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 51

Hình 39 Phổ khốilượng của hợp chất 6 53

Hình 40 Phổ 1H-NMR của hợp chất 6 54

Hình 41 Phổ 13C-NMR của hợp chất 6 54

Hình 42 Phổ DEPT của hợp chất 6 55

Hình 43 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC, COSY của hợp chất 7.55Hình 44 Phổ khốilượng của hợp chất 7 57

Hình 45 Phổ 1H-NMR của hợp chất 7 58

Hình 46 Phổ 13C-NMR của hợp chất 7 58

Hình 47 Phổ DEPT của hợp chất 7 59

Hình 48 Phổ HSQC của hợp chất 7 59

Hình 49 Phổ HMBC của hợp chất 7 60

Hình 50 Phổ COSY của hợp chất 7 60

Hình 51 Cấu trúc các chất được phân lập từ loài Haliclona varia 61

MỞ ĐẦU

Biển và đại dương chiếm khoảng 71% diện tích bề mặt trái đất, là nguồn tàinguyên vô cùng đáng quý do ở đó có tới 34 trong số 36 ngành sinh vật trên trái đấtsinh sống Ước tính có trên 25 triệu loài sống ở đại dương, bao gồm động thực vậtnhư rong biển, ruột khoang, rêu biển, thân mềm, các loài vi khuẩn biển Biển cungcấp cho con người những thực phẩm đáng kể, chủ yếu là các loài cá, động vật giápxác, động vật có vú và rong biển.v.v Ngoài vai trò to lớn trong ngành công nghiệpthực phẩm, những sản phẩm của đại dương cũng đang dần được nghiên cứu và sửdụng trong ngành công nghiệp dược phẩm Ban đầu là những dược phẩm từ cá nhưviên dầu cá hồi omega-3, viên sụn cá mập, tiếp sau đó là các sản phẩm từ rong tảo.Trong những năm gần đây, với sự hỗ trợ của các kỹ thuật tiên tiến, nhiều hợp chấtcó hoạt tính sinh học từ các loài hải miên, san hô mềm, sao biển, hải sâm đã đượcphân lập, xác định cấu trúc, mô tả rõ đặc điểm của hợp chất, đánh giá hoạt tính sinhhọc Nhiều hợp chất trong số đó đã được nghiên cứu phát hiện và đang được sửdụng làm thuốc điều trị bệnh ung thư như: cytarabine (ara-C), variabilin, vàagosterol A

Việt Nam là quốc gia có ba mặt tiếp giáp biển với bờ biển dài 3.260 km chạydọc từ Bắc vào Nam, hàng nghìn hòn đảo lớn nhỏ Thêm vào đó, Việt Nam là nướcnhiệt đới với bốn miền khí hậu chủ yếu Các điều kiện này đã tạo ra nguồn tàinguyên sinh vật biển phong phú với 12.000 loài đã biết bao gồm 2.038 loài cá, 6.000loài động vật đáy, 635 loài rong biển và hàng ngàn loài động thực vật phù du Việcnghiên cứu về nguồn hợp chất tự nhiên biển của nước ta bắt đầu từ những năm 70của thế kỷ 20 nhưng từ đó đến năm 2010 cũng chưa có nhiều công trình liên quanđược công bố.

Việc khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vậtbiển nói chung, các loài hải miên nói riêng đang là vấn đề quan tâm hiện nay Cácnghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới đã chỉ ra các loàiHải miên có cấu trúc hóa học đa dạng và phong phú, nhiều hợp chất đã được phát

hiện có hoạt tính sinh học lí thú Xuất phát từ điểm đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất

phân lập từ loài hải miên Haliclona varia (Bowerbank, 1875)” Đề tài bao gồm

các nội dung sau:

1 Phân lập các hợp chất từ loài hải miên Haliclona varia.

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài hải miênHaliclona varia.

3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được trên một

số dòng tế bào ung thư ở người.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về các loài hải miên

1.1.1 Giới thiệu chung về hải miên[7]

Hải miên là các loài động vật thuộc ngành Porifera (động vật ăn lọc – pore

bearer) Cơ thể của chúng bao gồm một lớp trung mô dạng thạch được kẹp giữa hai

màng tế bào mỏng Trong khi tất cả các loài động vật khác có các tế bào chưa biệthóa có thể chuyển thành các dạng tế bào chuyên biệt khác nhau thì duy nhất các loàihải miên có một số tế bào đã được biệt hóa mà vẫn có thể chuyển thành các dạng tếbào khác, thông thường chúng di chuyển giữa các màng tế bào cơ bản và lớp trungmô Hải miên không có hệ thần kinh, hệ tiêu hóa hoặc hệ tuần hoàn Thay vào đó,hầu hết chúng dựa vào việc duy trì một dòng nước ổn định chảy qua cơ thể để thunhận thức ăn và oxy cũng như thải các chất cặn bã và hình dáng cơ thể của chúngthích nghi tối đa với việc duy trì hiệu quả của dòng nước chảy qua cơ thể Tuy cómột số loài hải miên nước ngọt, còn lại đa phần hải miên là các loài động vật biển,phân bố rộng khắp từ các vùng triều cho tới tận độ sâu hơn 8800 m Trong khi hầuhết trong số khoảng từ 5.000 đến 10.000 loài hải miên đó được biết đến sống dựavào nguồn thức ăn là các vi khuẩn và các mảnh vụn trong nước, một số vi khuẩnchủ tổng hợp quang năng thường sản xuất thức ăn và oxy nhiều hơn số chúng tiêuthụ Một số loài hải miên sống trong các môi trường nghèo dinh dưỡng và trở thànhđộng vật ăn thịt sống dựa vào các loài giáp xác nhỏ.

Hải miên được chia thành ba lớp chính, dựa trên thành phần cấu tạo bộkhung cơ thể của chúng:

- Lớp Hexactinellida (hải miên đá – glass sponges) có các nhánh silicat, nhánh

lớn nhất có sáu cánh có thể tách rời hoặc đính với nhau Thành phần cơ thể chính của

chúng là hợp bào (syncytia) trong đó phần lớn các tế bào có chung một màng ngoài đơn - Lớp Calcarea có bộ khung cơ thể tạo bởi canxi, một dạng canxi cacbonat,

có thể tạo thành các nhánh riêng biệt hoặc thành mạng lưới lớn Tất cả các tế bào có

- Lớp Demospongiae: Hầu hết có các nhánh silicat hoặc sợi xốp hoặc hỗn hợp cả

hai trong các mô mềm của chúng Tuy nhiên, một số loài có chứa cơ quan ngoài đặc tạonên bởi aragnoit, một dạng canxi cacbonat khác Tất cả các tế bào có một nhân và màng.

- Ngoài ra, còn có lớp Archeocyatha chỉ được biết đến qua các hóa thạch từ

thời Cambri.

1.1.2 Giới thiệu chung về chi Haliclona

Hải miên thuộc chi Haliclona thuộc họ Chalinidae, bộ Haploscleria,phân lớp Haplosclerida, lớp Demospongiae Chi Haliclona bao gồm khoảng500 loài, điển hình như: H subarmigera, H oculata, H caerulea, H varia,

H.crassiloba, H viscosa, H simulans, H aquarius, H fulva và H viridis …

Chúng sinh sống phổ biến tại các vùng biển trên thế giới nói chung và ở Việt

Nam nói riêng Cũng như các loài hải miên khác, chi Haliclona chứa hàm

lượng cao các hợp chất steroid, và các hợp chất trao đổi thứ cấp này giữ vaitrò quan trọng cho sự sống sót của hải miên với các chức năng bảo vệ, cạnhtranh, sinh sản Dưới đây là hình ảnh một số loài hải miên thuộc chi

Haliclona:

Hình 1 Hình ảnh một số loài hải miên thuộc chi Haliclona1.1.3 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Haliclona

1.1.3.1 Trên thế giới

Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học các loài thuộc chi Haliclona Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiệnđược trên 100 hợp chất thuộc chi Haliclona Thành phần chủ yếu của chi này là các

nhóm chất thuộc nhóm terpenoid, các alkaloid, các polyene, các hợp chất chứabrom, và một số các hợp chất khác có cấu trúc phức tạp

• Các hợp chất terpenoid

Hai hợp chất mới có tên là acid halicloic A (1) và B (2), được phân lập từ

loài hải miên Haliclona sp thu thập ở vùng biển của Philippine Trong thử nghiệm

in vitro ức chế IDO chúng có nồng độ thấp và được dùng như một sản phẩm thiên

nhiên mới định hướng việc thiết kế tổng hợp chất ức chế IDO dioxygenase) [37].

HH

Một loạt các hợp chất adociasulfate 1- 6 (3-8) đã được Christine và cộng sự

phân lập từ một loài hải miên thuộc chi Haliclona thu tại vùng biển Palau Trong

đó, hai hợp chất 4 và 8 được phát hiện là chất có khả năng kìm hãm đặc hiệuenzyme ATPase [8] Hai hợp chất steroid, haliclostanone sulfate (9) là hợp chất mới

và halistanol sulfate (10) được phân lập từ loài hải miên Haliclona sp [34].

Tám hợp chất mới đã được Yu và cộng sự phân lập từ loài H oculata,

oculatol (11), oculatolide (12), 5,24(28)-dien-4-one (13), 2-ethoxycarbonyl-24-ethyl-2β-hydroxy-A-nor-cholesta-5-en-4-one (14), 2-ethoxycarbonyl-24-ethyl-2β,7β-dihydroxy-A-nor-ergosta-5,24(28)-dien-4-one (15), 2-ethoxycarbonyl-24-ethyl-2β,7β-dihydroxy-A-nor-cholesta-5-en-4-one (16), 2-ethoxycarbonyl-2β,7β-dihydroxy-24-methyl-A-nor-cholesta-5,22(E)-dien-4-one (17) và 2-ethoxycarbonyl-2β,7β-dihydroxy-A-nor-cholesta-5,22(E)-

2-ethoxycacbonyl-2β-hydroxy-A-nor-ergosta-dien-4-one (18) Kết quả thử hoạt tính cho thấy hợp chất 13 có hiệu quả diệt các

dòng tế bào ung thư người HL-60 (IC50 = 0,32 µg/mL), A-549 (IC50 = 0,47 µg/mL),và BEL-7402 (IC50 = 0,73 µg/mL) [39].

OO

Từ một loài hải miên Haliclona sp được thu hái ở phía bắc Queensland,

Lyndon và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất, trong đó có 3 hợp chất

hydroquinone mới là: adociaquinol (19), adociasulfate 11 (20) và adociasulfate 12(21) và 3 hợp chất đã biết: adociasulfate 2 (4), adociasulfate 4 (6), adociasulfate 6(8) [36].

19 R=H20 R=SO3H

• Các hợp chất alkaloid

Hai hợp chất densanin A (22) và B (23) được phân lập từ loài hải miên H.

densaspicula (Hàn Quốc) Hai hợp chất này được phát hiện có khả năng ức chế mạnh

sự sản sinh NO trên đại thực bào với giá trị IC50 = 1,05 và 2,14 μM [18].

9'9'' 11

25

Một nghiên cứu khác cho biết hai hợp chất papuamine (24) và

haliclonadiamine (25), được phân lập từ một loài hải miên Haliclona sp thuộc vùng

biển Indonesia Hợp chất (24) và (25) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển các

dòng tế bào ung thư người: ung thư vú (MCF-7), ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP),ung thư đại trực tràng (Caco-7) với giá trị IC50 trong khoảng 0,93~4,44 µM [38].

Haliclonacyclamine A (26) được phân lập từ loài hải miên Haliclona sp (thu tại

quần đảo Solomon) thể hiện hoạt tính kháng chủng vi trùng sốt rét Plasmodium

falciparum FCB1 Và trong thử nghiệm in vivo, hợp chất này có khả năng chống lại

chủng sốt rét Plasmodium vinckei petteri trên chuột [23] Từ mẫu hải miên H.

vicosa được thu thập ở vùng biển Spitsbergen, Na Uy, Christoph và cộng sự đã

phân lập được 7 hợp chất mới: viscosamine (27), haliclamine C-F (28-31), cyclic

monome (32), trime vicosamine (33) và một chất đã biết cyclostellettamine C (34).

Kết quả sàng lọc cho thấy dịch chiết metanol từ loài H vicosa có hoạt tính kháng

sinh mạnh [35] Trong các hợp chất alkaloid được phân lập từ một loài hải miên

Haliclona sp thu ở biển Thái Bình Dương, có 2 hợp chất mới là dimeric

3-alkylpyridinium alkaloid (35) và trimeric 3-3-alkylpyridinium alkaloid (36) [11].

40 R1=H, R2=OH

37 R1=OH, R2=H

Hagit và cộng sự thông báo ba hợp chất alkaloid mới: isohalitulin (37),

haliclorensin B (38) và C (39) được phân lập từ loài hải miên H tulearensis thu ở

vịnh Salary Các hợp chất 37, 38 và 39 thể hiện độc tính trung bình đối với ấu trùng

tôm biển (Artemia salina) Trong đó, hợp chất 37 cho thấy một tiềm năng lớn hơn,

với giá trị LD50 0,9 µM, trong khi 38 và 39 có giá trị LD50 là 2,2 và 2,1 µM [33].Cũng từ loài này thu ở vịnh Sodwana, Durban, nhóm nghiên cứu trên đã phân lập

được ba hợp chất halitulin (40), haliclorensin (41) và isohaclirensin (42)

Từ loài Haliclona sp., Masayoshi và các cộng sự đã phân lập được ba

ankaloid, trong đó có một hợp chất mới là 22-hydroxyhaliclonacyclamine B (43) vàhai hợp chất đã biết, haliclonacyclamine A (44) và haliclonacyclamine B (45) Cáchợp chất 44 và 45 cho thấy khả năng kháng vi trùng lao rất mạnh với hai chủng

Mycobacterium smegmatis và BCG [25].

43 R=OH, 

44 R=H, 

45 R=H, 

47 48 17Z

Một hợp chất mới có tên là haliclonin A (46) thuộc khung diamine

macrocylic được Kyoung và cộng sự phân lập từ loài hải miên thuộc chi Haliclona.

Hợp chất này được thông báo có hoạt tính gây độc tế bào trung bình và kháng sinh

mạnh đối với các chủng vi khuẩn khác nhau [20] Salicylihalamide A (47) và B (48)

được Karen và cộng sự được phân lập từ loài hải miên Haliclona sp Lớp chất này

được đánh giá có hoạt tính gây độc tế bào cực mạnh và có tiềm năng phát triểnthành thuốc chống ung thư [15] Blaine và Phillip đã thông báo và xác định một hợp

chất thuộc khung sesquiterpene dị vòng, helianane (49), từ loài H fascigera Hợp

chất này lần đầu được phân lập từ thiên nhiên Trong thử nghiệm hoạt tính gây độc

tế bào, hợp chất 49 có khả năng kháng lại dòng tế bào bạch cầu ở chuột P-388, tế

bào ung thư phổi người A-549, dòng tế bào ung thư đại tràng người HCT-8, ung thưvú người MCF-7 và nhiều dòng tế bào khác [16].

Từ loài hải miên H nigra (vùng biển Papua New Guinea), Mohamad và cộng

sự đã phân lập được hai hợp chất mới có tên là haligramide A (50) và B (51) Cả hai

hợp chất này đều được thông báo là có hoạt tính gây độc tế bào đối với một số dòngtế bào ung thư người (A-549, HCT-15, SF-539 và SNB-19) Giá trị IC50 của hợp

chất 50 trong khoảng 5,17-15,62 (µg/mL) và của hợp chất 51 trong khoảng 8,82 mg/mL [31] Hợp chất mới haliclorensin (52) được Gainit và cộng sự phân lập

3,89-từ loài hải miên H tulearensis thu ở vùng vịnh Sodwana, Durban, Nam Phi ở độ sâu

15 m Trước đó, dịch chiết thô của loài hải miên này được đánh giá là có hoạt tínhgây độc tế bào mạnh với dòng tế bào ung thư bạch cầu chuột P-388 với giá trị IC50

Hai alkaloid isoquinolin được phân lập từ một loài hải miên thuộc chi

Haliclona (Philippine) Trong đó, một hợp chất mới là

1-hydroxymethyl-7-methoxyisoquinolin-6-ol (53) và một hợp chất đã biết là mimosamycin (54) Trongthử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào, hợp chất 54 thể hiện hoạt tính kháng u đối vớikhối u ác tính LOX và các dòng tế bào khối u buồng trứng người OVCAR-3 [32].

• Các hợp chất polyene

Từ loài Haliclona tubifera thu ở vùng biển Brazil, Taduesz và cộng sự đã phân

lập được 2 hợp chất sphingoid có tên là halisphingosine A (55) và B (56) [27] Từ loài

hải miên Haliclona cyemaformis thu tại vùng biển Hàn Quốc, một loạt các hợp chất

1-glyceryl ete được phân lập (57-62) Các hợp chất này được thông báo là có khả năng

gây độc tế bào yếu với dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela [5] Một axit béo không no

chứa brom được phân lập từ một loài hải miên thuộc chi Haliclona và được xác định là

mới có tên là 6-bromoicosa-3Z,5E,8Z,13E,15E-pentaene-11,19-diynoic acid (63) [6].

Từ loài hải miên Haliclona sp thu ở vịnh Eilat, một polyacetylen mới đã

được phân lập, đó là haliclonyne (64) [12] Một hợp chất ceramide mới

N-docosanoyl-D-erythro-(2S,3R)-16-methyl-heptadecasphing-4(E)-enine (65) được

phân lập từ loài hải miên Haliclona koremella được thông báo là có hoạt tính chống

gỉ và chống nấm tảo [17] Richard và cộng sự đã công bố khả năng kháng nấm của

các rượu ankyl amino (66-80) được phân lập từ một loài hải miên thuộc chi

Haliclona thu ở vùng biển nhiệt đới Các hợp chất thu được đều là những hợp chất

mới Các hợp chất này đều có khả năng hoạt động như một tác nhân chống nấm và

ức chế sự phát triển của ấu trùng Herdmania curvata [13].

Một loạt các chất mới cerebroside (81-88) đã được phân lập từ một loài hải

miên Haliclona sp [24] Trước đó, lớp chất này đã được thông báo có khả năngkháng u, gây độc tế bào, kháng nấm, chống gỉ Từ loài hải miên Haliclona

lunisimilis thu tại Point Loma, California, mười hai hợp chất polyacetylene chứa clo

đã được phân lập 89-100 [14] Trong đó, các hợp chất 1,3-diene-5,7-diyne-14-ol (98), (1Z,3E,9Z)-15-acetoxy-1-chlorohexadeca-5,7-diyne-1,3,9-triene (99) và (1Z,3E)-14-acetoxy-1-chlorohexadeca-1,3-diene-5,7-

(1Z,3Z)-1-chlorohexadeca-diyne (100) là những chất mới.

89 (3E)90 (3Z)

91 (3E) R=H92 (3Z) R=H98 (3E) R=Ac

1.1.3.2 Ở Việt Nam

Cho đến nay, có rất ít các nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học cũng

như hoạt tính sinh học của chi Haliclona Năm 2012, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Phan Văn Kiệm đã công bố phân lập được 5 hợp chất từ loài Haliclona

Năm 2015, cũng nhóm nghiên cứu này đã công bố phân lập năm hợp chất

steroid (106-110) và hai hợp chất brominate lipid (111-112) từ loài hải miên

Haliclona oculata, trong đó hợp chất 107 thể hiện hoạt tính khá mạnh trên các dòng

tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư phổi LU-1 với giá trị IC50 trong khoảng 9,32 μM[29].

112111

1.1.4 Vài nét về bệnh ung thư

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào mộtcách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cáchphát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn) Mọi sinh vậtđều được cấu tạo bằng tế bào, các tế bào họp thành các mô, các mô họp thành cáccơ quan và các cơ quan họp thành cơ thể Vì vậy, bất cứ cơ quan nào và cơ thể sinhvật nào cũng có thể bị ung thư Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 6 triệu người chết

vì ung thư Hiện nay, ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai ở Mỹ (chỉ

đứng sau bệnh tim mạch) Trong 30 năm trước, 50% dân Mỹ được chẩn đoán mắcbệnh ung thư đều tử vong trong vòng 5 năm Ngày nay, tỷ lệ sống sót trong vòng 5năm đạt 65%

Hình 2 Hình thái tổ chức của mô từ dạng bình thường đến khi phát triển thành

khối u[2]

Nguyên nhân gây ung thư là sự sai hỏng của ADN, tạo nên các đột biến ởcác gen thiết yếu điều khiển quá trình phân bào cũng như các cơ chế quan trọngkhác Một hoặc nhiều đột biến được tích lũy lại sẽ gây ra sự tăng sinh không kiểmsoát và tạo thành khối u Khối u là một khối mô bất thường, có thể ác tính, tức ungthư hoặc lành tính, tức không ung thư Chỉ những khối u ác tính thì mới xâm lấn môkhác và di căn Ung thư có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau phụ thuộc vào vịtrí, đặc điểm và khả năng di căn của khối u Chẩn đoán xác định ung thư thường đòihỏi phải sinh thiết rồi quan sát trên kính hiển vi Người bị ung thư có thể được chữatrị bằng phẫu thuật, hóa trị liệu hoặc xạ trị liệu.

Nếu không được chữa trị sớm, hầu hết các loại ung thư có thể gây tử vong,đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong chính trong những nước pháttriển Hầu hết các bệnh ung thư có thể chữa trị và nhiều bệnh có thể chữa lành, nếuđược phát hiện và điều trị sớm Nhiều dạng ung thư có liên quan đến các yếu tố môitrường mà có thể tránh khỏi Hút thuốc lá là một trong những yếu tố gây nguy cơung thư nhiều nhất.

Ung thư có thể được phân loại dựa theo tính chất giải phẫu bệnh hoặc theocơ quan bị tổn thương Các tế bào ung thư trong một khối u (bao gồm cả tế bào đãdi căn) đều xuất phát từ một tế bào duy nhất phân chia mà thành Do đó một bệnhung thư có thể được phân loại theo loại tế bào khởi phát và theo vị trí của tế bào đó.Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, người ta không xác định được khối u nguyênphát.

* Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ như ởống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hoá).

* Bệnh lý huyết học ác tính (hematological malignancy), như bệnh bạchcầu (leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xuất phát từ máu và tủy xương.

* Ung thư mô liên kết (sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết,xương hay cơ.

* U hắc tố do rối loạn của tế bào sắc tố * U ác bắt nguồn từ các tế bào mầm.

Báo cáo thống kê bệnh ung thư hàng năm của Hiệp hội Ung thư Hoa Kì nhậnthấy tỷ lệ tử vong do bệnh ung thư trong vòng hai thập kỷ qua giảm hơn 20 phầntrăm trong tổng số nguy cơ tử vong do bệnh ung thư trong cùng khoảng thời gianđó Báo cáo Thống kê bệnh ung thư năm 2014 nhận thấy: tỷ lệ tử vong do bệnh ungthư ở đàn ông da đen giảm nhiều nhất, khoảng 50 phần trăm, tuy nhiên tỷ lệ mắcbệnh ung thư và tử vong của đàn ông da đen có tỉ lệ cao nhất, người Mỹ gốc Á có tỉlệ mắc và tử vong do bệnh ung thư thấp nhất.

Báo cáo cũng ước tính có 1.665.540 trường hợp ung thư mới mắc và 585.720ca tử vong do bệnh ung thư ở Hoa Kỳ vào năm 2014 Ở nam giới: ung thư tuyếntiền liệt, ung thư phổi và ung thư đại tràng sẽ chiếm khoảng một nửa trong tổng sốcác bệnh ung thư được chẩn đoán mới, trong đó ung thư tuyến tiền liệt đứng hàngđầu trong 4 loại ung thư trên Ba bệnh ung thư phổ biến nhất trong năm 2014 ở nữgiới là: ung thư vú, ung thư phổi và ung thư đại tràng, chiếm khoảng 50% Ung thưvú dự kiến chiếm 29% trong tổng số tất cả các bệnh ung thư mới mắc ở nữ giới.

Ước tính 585.720 ca tử vong do ung thư vào năm 2014, tương ứng khoảng1.600 trường hợp tử vong mỗi ngày Ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư tuyếntiền liệt và ung thư vú tiếp tục là nguyên nhân gây tử vong phổ biến nhất, chiếm gầnmột nửa trong tổng số các trường hợp tử vong do ung thư ở nam giới và nữ giới.Ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng đầu trong bốn bệnh ung thưtrên.

John R Seffrin, tiến sĩ, giám đốc điều hành của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳcho biết: “Sự tiến bộ của chúng ta là rất tốt, đáng chú ý, nhưng chúng ta cần phảilàm tốt hơn Giảm một nửa nguy cơ tử vong do ung thư ở đàn ông da đen trung niênchỉ trong hai thập kỷ qua là bất thường, nhưng ngay lập tức nó được làm giảm đibởi tỷ lệ tử vong của đàn ông da đen vẫn cao hơn đàn ông da trắng trong hầu hết cácbệnh ung thư chính và các bệnh ung thư nói chung”[1].

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu: Mẫu hải miên Haliclona varia được thu thập tại Cô Tô – Quảng

Ninh vào tháng 3 năm 2014 Tên khoa học được giám định bởi PGS.TS Đỗ CôngThung, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Tài nguyên Môi trường biển.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở haibước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đượcphun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60GF254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nmvà 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơnóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đócạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dungmôi thích hợp.

 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chấthấp phụ pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430mesh) Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50 m,

FuJisilisa Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem Ind.Co., Ltd.)

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kếthợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của

Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn làTMS (Tetrametyl silan)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC và COSY Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD hoặc CDCl3.

nồng độ bằng DMSO 10% Các dòng tế bào ung thư bao gồm: KB, LU-1, SK-Mel2,

P388, HepG-2, LNCaP, MCF-7, SW-480 do GS TS J M Pezzuto, Trường Đạihọc Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.

 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trườngnuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L natribicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngoài ra bổsung 10% huyết thanh phôi bò FBS (GIBCO) Riêng môi trường nuôi cấy tế bàoMCF-7 được bổ sung Insulin ở nồng độ 40 µg/L

Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2

ở điều kiện 37oC, 5% CO2.

 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằmsàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung

thư ở điều kiện in vitro Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng

số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phầnprotein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đođược tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càngnhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiệntrong điều kiện cụ thể như sau:

Chất thử (10 μl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96giếng để có nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml; 50 μg/ml; 25 μg/ml; 12,5 μg/ml; 6,25μg/ml.

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm đểđiều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp 3x104 tế bào/giếng(trong 190 μl môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-4 ngày

Một khay 96 giếng khỏc khụng cú chất thử nhưng cú tế bào ung thư (190μl)sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cốđịnh tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.

Sau giai đoạn phỏt triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đỏy giếngbằng TCA trong 30 phỳt, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở nhiệt độ 37°C Đụ̉bỏ SRB và cỏc giếng thớ nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khụtrong khụng khớ ở nhiệt độ phũng

Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered base Tris để hũa tan lượng SRB đóbỏm và nhuộm cỏc phõn tử protein, đưa lờn mỏy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phỳt và sửdụng mỏy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu củachất nhuộm SRB qua phụ̉ hấp phụ ở bước súng 515 nm Khả năng sống sút của tếbào khi cú mặt chất thử sẽ được xỏc định thụng qua cụng thức sau:

OD(chất thử) - OD(ngày 0) 100% sống sót =

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

Cỏc phộp thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tớnh chớnh xỏc Ellipticine(Sigma) được sử dụng là chất đối chứng dương DMSO 10% luụn được sử dụng đốichứng õm Giỏ trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phỏt triển) sẽ được xỏc định nhờ vàophần mềm mỏy tớnh TableCurve

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM3.1 Xử lý mẫu nghiên cứu

Nguyên liệu: Mẫu hải miên H varia được thu thập tại Cô Tô - Quảng Ninh

vào tháng 3 năm 2014

Mẫu hải miên H varia sau khi thu thập được rửa sạch nhiều lần bằng nước

để loại muối và tạp bẩn, được thái nhỏ sau đó ngâm chiết trong metanol.

Hình 3 Mẫu hải miên Haliclona varia thu thập tại Cô Tô

3.2 Phân lập các hợp chất

Mẫu Haliclona varia (1,5 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối sau đó thái nhỏ

(3 cm/đoạn) và ngâm chiết kết hợp siêu âm bằng metanol (5 L×3, 3h) Dịch chiết

được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi thu được cặn metanol (HV, 53

g) Cặn này được hòa tan vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố với

diclometan thu được cặn diclometan (HV1, 18 g) và dịch nước HV2 (30 g) Phầncặn diclometan HV1 được hòa tan với một lượng tối thiểu diclometan sau đó tẩm

với silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô Tiến hành phân tách hỗn hợp này

phân cực tăng dần (n-hexan/axeton, 100/0→0/1, v/v) thu được 3 phân đoạn HV1A

(3,5 g), HV1B (5 g) và HV1C (2 g) Phân đoạn HV1A sử dụng sắc ký cột silica gel

kết hợp với hệ dung môi rửa giải n-hexan/axeton (2,5/1, v/v) thu được 2 phân đoạn

HV1A1 (900 mg) và HV1A2 (450 mg)

Phân đoạn HV1A1 tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha đảo, hệ dung môirửa giải metanol/nước (1,5/1, v/v) thu được chất sạch 1 (14 mg), 3 (8 mg) và 4 (17

Hợp chất 5 (15 mg) thu được khi chạy sắc ký cột silica gel phân đoạn

HV1A2, hệ dung môi rửa giải n-hexan/etyl axetat (1/1, v/v)

Phần HV1B sử dụng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giảiaxeton/nước (2/1, v/v) thu được 2 phân đoạn HV1B1 (900 mg) và HV1B2 (500mg) Tiếp tục phân tách HV1B2 bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằnghỗn hợp diclometan/axeton (6/1, v/v) thu được hợp chất 2 (14 mg) và hợp chất 6 (10

mg)

Hợp chất 7 (15 mg) thu được khi chạy phân đoạn HV1B1 trên cột sắc kí pha

đảo, hệ dung môi rửa giải metanol/nước (1,5/1, v/v).

Hình 4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên H varia

3.3 Các thông số vật lí của các hợp chất đã phân lập

3.3.1 Hợp chất 1: 3β-hydroxycholest-5-en-7-one

Bột vô định hình màu trắng;

[α]D25:−78,0 (c 0,3, CHCl3);Công thức phân tử: C27H44O2;

ESI-MS: m/z 401 [M+H]+;

1H-NMR (CDCl3), 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 1.

3.3.2 Hợp chất 2: 22(E)-3β-hydroxycholesta-5,22-dien-7-one

Bột vô định hình màu trắng;

[α ]25D :[α]D25: −93,0 (c 0,2, CHCl3);Công thức phân tử: C27H42O2;

ESI-MS: m/z 399 [M+H]+ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz);

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): xem Bảng 2.

3.3.3 Hợp chất 3: 3β,7α-dihydroxycholest-5-ene

Bột vô định hình màu trắng;[α ]25D: -130,2 (c 0,2, CHCl3);Công thức phân tử: C27H46O2;

APCI-MS: m/z 367 [M+H-2H2O]+;

1H-NMR (CDCl3) và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 3.

3.3.4 Hợp chất 4: 3β,7β-dihydroxycholest-5-ene

Bột vô định hình màu trắng;[α ]25D : +30,0 (c 0,1, CHCl3);

1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 5.

3.3.6 Hợp chất 6: 5α,8α-epidioxycholest-6-en-3β-ol

Tinh thể hình kim, màu trắng; Tnc: 102-103°C

[α ]25D -31o (c 0.5, CH2Cl2)Công thức phân tử: C27H44O3;

3.4 Đánh giá khả năng diệt tế bào ung thư in vitro của các hợp chất

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho 5 hợp chất với phương pháp nêu

trong mục 2.2.3.Tiến hành kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với 5 mẫu

là 2, 3, 4, 5 và 7 trên 8 dòng tế bào ung thư người:

 Ung thư gan (HepG-2) Ung thư biểu mô (KB) Ung thư phổi (LU-1)

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Hình 5 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 1

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng Công thức

phân tử được dự đoán là C27H44O2 dựa trên phổ ESI-MS với pic ion m/z 401 [M+H]+

kết hợp dữ liệu phổ 13C-NMR Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 cho tín hiệu của 5 nhóm

metyl: δH 0,68 (3H, s, H-18), 1,21 (3H, s, H-19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21) và0,87 (6H, d, J = 6,5 Hz, H-26, H-27), một proton oximetin tại δH 3,63 (1H, m, H-3)và một proton olefin tại δH 5,67 (1H, s, H-6) Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1

xuất hiện 27 tín hiệu cacbon, trong đó có 1 nhóm cacbonyl, 3 cacbon bậc bốn, 8cacbon metin, 10 cacbon metilen và 5 cacbon metyl Các dữ kiện phổ 1H- và 13C-

NMR của hợp chất 1 đề xuất về một khung cholestan có chứa nhóm cacbonyl và

liên kết đôi Dựa trên các tài liệu tham khảo về các hợp chất sterol thuộc chi

Haliclona, hợp chất 1 được dự đoán là 3β-hydroxycholest-5-en-7-one [28] Các

tương tác H-26/H-27 (δH 0,87) và C-24 (δC 39,47)/C-25 (δC 27,98); H-21 (δH 0,92) vàC-20 (δC 35,69); H-18 (δH 0,68) và C-12 (δC 38,71)/C-13 (δC 41,82)/C-14 (δC 49,95)/C-17 (δC 54,81); H-19 (δH 1,21) và C-1 (δC 36,36)/C-5 (δC 165,23)/C-9 (δC 49,97)/C-10 (δC 38,38) cho phép gắn nhóm metyl ở các vị trí C-10, C-13, C-20 và C-25/C-25.Các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,63)/ C-5 (δC 165,23); H-8 (δH 2,22)/H-9 (δH

1,52)/C-7 (δC 202,34) khẳng định nối đôi và nhóm cacbonyl lần lượt ở các vị trí 5/C-6 và C-7 tương ứng Nhóm hiđroxi ở C-3 được gán dựa vào tương tác HMBC

C-giữa H-4 (δH 2,42/2,52) và C-3 (δC 70,46) Do đó, hợp chất 1 được khẳng định là

3β-hydroxycholest-5-en-7-one Hợp chất này đã được phân lập từ loài Haliclona sp.

bởi Li và các cộng sự [22].

Bảng 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất tham khảo

C#δCδCa,bδHa,c (mult., J = Hz) HMBC (H→C)

Hình 6 Phổ khốilượng của hợp chất 1

Hình 7 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1