Phân đoạn butanol của cúc hoa vàng có khả năng chống viêm, ức chế miễn dịch dịch thể và tế bào, đồng thời còn có hoạt tính của bạch cầu đcfn nhân[15].- Theo Jiang H và cộng sự, c.indicum
Trang 1B ộ Y T ẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẨN HOÁ HỌC
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC s ĩ KHOÁ 2001-2006)
PGS.TS Trần Lưu Vân Hỉền
Bệnh viện YHCT trung ương
Thời gian thực hiện : 02/2005 - 05/2006
Hà Nội, 5 -2 0 0 6
Trang 2CKPti triỂft khed ÌÍtẮÌỀ kiỀtt íu ậtt vAn, tò i ỉuLấn tthậrt
đ ư ợ ^ »jự ạ iú ft đj^ <ịầẩẠ (m u c ủ a tvtô^L ^ ư đ e JẼẰỀMt^ fihjờ*tjg
^ ồ ề u ạ tj th ự ia v tụ h iỀ m - Q Ì Ề tih < ĩ)Ỉ Ề n t m n ạ , ư t ỉn ạ ,f
^Qí ^ h ạ n t C7ífittf/#/t 'JCÍLf rthữrtg nạiứu đă ạiúệi tê i trmiạ {ặuA trình thựe kiỀềt đề' tài* ^ ồ i xin đjtỂơe lừựỊ tẢ lề^ưẬ, b iâ ờn Ể«Ể íhẦự ũă Í9Á eắn Ị% Ậ nhân tùêir hẠ ễt'Lỗn
Trang 4MỤC LỤC É •
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ể 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 2
1.1.Cúc hoa vàn g 2
1.1.1.Tên khoa h ọ c 2
1.1.2 Đặc điểm thực v ậ t 2
1.1.3 Phân bố và sinh thái 2
1.1.4 Bộ phận dùng và thu hái 3
1.1.5 Thành phần hoá học 3
1.1.6 Tác dụng và cồng dụng 3
1.1.6.1 Tác dụng 3
1.1.6.2 Công dụng 5
1.2 Cúc hoa trắng 6
1.2.1 Tên khoa học 6
1.2.2 Đặc điểm thực vật 6
1.2.3 Phân bố và sinh thái 6
1.2.4 Bộ phận dùng và thu h á i 7
1.2.5 Thành phần hoá học 7
1.2.6.Tác dụng và công dụng 8
1.2.6.1.Tác dụng 8
1.2.6.2 Công dụng 11
PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u .12
2.1 Nguyên liệ u 1 2 2.2 Phương pháp nghiên c ứ u 12
PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 15
Trang 53-l.Nghién cứu thành phần hoá học 15
3.1.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cúc hoa bằng phản ứng hoá h ọc 15
3.1.2 Định tính phán đoạn etylacetat của cúc hoa bằng SKLM 21
3.1.3 Phân tích thành phần dịch chiết cồn và etylacetat bằng HPLC 23
3.1.4 Phân tích thành phần tinh dầu của cúc hoa bằng GC-MS 26
3.1.5 Định lượng phân đoạn etylacetat của cúc hoa 28
3.1.6 Phân lập và nhận dạng các chất 29
3.2 Nghiên cứu môt số tác dụng sinh học của cúc h o a 31
3.2.1 Xác định hoạt tính dọn gốc Superoxid 31
3.2.2 Xác định hoạt tính dọn gốc DPPH 34
3.2.3 Tác dụng chống peroxy hoá lipid trong dịch đồng thể tế bào gan chuột nhắt thí nghiêm 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ X U Ấ T 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 6ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay, y học hiện đại đang rất quan tâm đến các dược liệu có tác dụng chống oxy hoá, đặc biệt là ỉoại có nhóm chất Flavonoid như kim ngân, đậu xanh, hoa hoè, tầm gửi, cúc h oa
Cúc hoa có hai loại là cúc hoa trắng và cúc hoa vàng Các tài liệu y vãn của Trung Quốc và Việt Nam thường nói đến tác dụng điều trị của cúc hoa
trắng Chrysanthemum morifolium Trong ngân hàng dữ liệu PubMed cho đến
nay có khoảng 67 tài liệu khoa học có liên quan đến c morifoUum Tài liệu về
cúc hoa vàng Chrysanthemum indìcum ít hcfn so với cúc hoa trắng Từ xưa,
YHCT dùng cúc hoa với tác dụng thanh nhiệt giải độc, Chúng được coi là có tác dụng và công dụng như nhau, có thể dùng thay thế nhau Điều đó có đúng không?
Để góp phần trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học và một sớ tác dụng sinh học mà chủ yếu là tác dụng chống oxy hoá, chống gốc tự do của cúc hoa trắng và cúc hoa vàng.
Trang 7PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.1 c ú c HOA VÀNG ;
1.1.1.Tên cây:
Tên khoa học : Chrysanthemum indỉcum L.
Tên đồng nghĩa : Chrysanthemum procumbens Lour.
Tên khác : Kim cúc, hoàng cúc, cúc vàng
Cây thảo, sống hàng năm, hay sống dai, cao 20-50cm Thân mọc thẳng, nhẵn , có khía dọc Lá chia làm nhiều thuỳ sâu, mép có răng cưa nhọn, không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dưới nhạt; cuống lá ngắn, có tai ở gốc Cụm hoa mọc thành đầu trên một cuống dài ở ngọn thân hoặc ở kẽ lá, đường kính 1,5-2,5 cm , tổng bao lá bắc là những vẩy thuôn dài, mép khô; hoa
ở ngoài hình lưỡi nhỏ màu vàng; hoa ở giữa hình ống, tràng dài 2mm, không
có mào lông; tràng hoa hình ống ngắn hcfn tràng hình lưỡi, có thuỳ tam giác nhọn và cũng có màu vàng.
Quả bế.
Mùa hoa quả tháng 10-12 cho đến tháng 5 năm sau.
1.1.3 Phân bố và sinh thái: [5], [6 ], [7], [8 ],[9],[11], [12]:
Cúc hoa vàng có nguồn gốc ở vùng Đông Á: Trung Quốc, Nhật Bản,
được trồng làm thuốc và làm cảnh ở Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật, Việt Nam,
Lào, Thái Lan và Ấn Độ ở Việt Nam, cúc hoa vàng được trồng từ lâu đời
Hiện nay, cây có nhiều ở Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hà Nội và một số tỉnh ở phía Bắc Cây ưa sáng và ưa ẩm, thường được trồng ở vườn, công viên, hoặc trên cánh đồng với mục đích sản xuất dược liệu, Cây ra hoa nhiều hàng năm, hiếm có hạt Mùa đông có hiện tượng rụng lá hoặc hơi tàn l ụ i Chính lúc
Trang 8này, người ta thường cắt bỏ phần thân cành, giữ lại gốc để tái sinh hoặc làm giống trồng vào mùa xuân năm sau.
Cúc hoa vàng hiện được trồng ở nhiều nơi, nhất là ở các làng hoa gần các thành phố lớn như Hải Phòng, Nam Định, Hà Nội.
1.1.4 Bộ phận dùng- thu hái: theo tài liệu [1], [5], [6 ], [7], [8 ], [9], [10]
Hoa thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau Hoa hái về đem
đồ rồi phcfi khô Nếu trời râm, sấy than hoặc lửa nhẹ.
- Acid amin: adenin, cholin, Stachydrin.
- Thành phần khác: indicumenon, ß-silosterol, a-amyrin, friedelin, sesamin, vitamin A
Hạt chứa 15,8% dầu béo
1 1 6 Tác dụng, công dụng :
L L ó L T á c đụng:
Cúc hoa vàng có các tác dụng dược lý như tác dụng chống viêm, chống oxy hoá, chống gốc tự do, kháng khuẩn, hạ áp, và có hoạt tính gây phản vệ :
Trang 9- Cúc hoa vàng có tác dụng chống viêm thực nghiệm trên chuột cống trắng [12] Phân đoạn butanol của cúc hoa vàng có khả năng chống viêm, ức chế miễn dịch dịch thể và tế bào, đồng thời còn có hoạt tính của bạch cầu đcfn nhân[15].
- Theo Jiang H và cộng sự, c.indicum có khả năng ức chế quá trình
peroxy hoá lipid, và có thể tác dụng này liên quan với chức năng bảo vệ gan
của c.indicum [20] Ngoài ra, trong 122 dược thảo Trung Quốc dùng điều trị
gut, dịch chiết metanol của cúc hoa vàng có hoạt tính ức chế xanthin oxidase mạnh thứ hai Như vậy, tác dụng điều trị gut phần nào là do hoạt tính ức chế Xanthin oxidase [23
- Hai Flavanon glycosid mới ((2S)- & (2R)-eriodictyol-7-0-ò-D- glucopỵranosiduronic) trong cúc hoa vàng có hoạt tính ức chế aldose reductase ở thuỷ tinh thể chuột nhắt trắng [26].
- Tinh dầu cất từ nụ cúc hoa vàng, đã được thử trên các chủng vi khuẩn Diplococcus pneumoniae, Streptococcus haemolyticus, Streptococcus faecalis, staphylococcus aureus 209P, Shigella shigae, s.flexneri, Bacillus subtilis Bacillus pyocyaneus, E.coli, Klebsiella pneumoniae Kết quả cho thấy tinh dầu này có tác dụng kháng khuẩn khá mạnh [12J.
- Cúc hoa vàng có tác dụng tốt trên động vật thí nghiệm (chó) tăng huyết
áp cũng như có tác dụng tốt đối với bệnh nhân tăng huyết áp Hoạt tính của cúc hoa vàng làm hạ huyết áp có thể là hiệu quả của tác dụng ức chế phản xạ vận mạch có nguồn gốc trung tâm và tác dụng ức chế adrenalin Lưu lượng tim và sự dẫn truyền thần kinh ở hạch không bị ảnh hưởng Cao lỏng của cúc
hoa vàng gây hạ huyết áp ở thỏ, nhưng không có tác dụng làm tăng độ bền
mao mạch của thỏ [12],
- Phân đoạn etylacetat (của dịch chiết metanol) có tác dụng ức chế sản xuất NO trong đại thực bào bị hoạt hoá bởi lipopolysaccharid [32
Trang 10- C.indicum gây dị ứng tiếp xúc trên chuột lang [17], có thể do sự có mặt
của các hợp chất terpenic[28] Arteglasin A có trong cúc hoa vàng có hoạt tính gây phản vệ trên da chuột lang và gây viêm da dị ứng tiếp xúc ở người[12].
Cũng đã có những nghiên cứu về cúc hoa vàng được áp dụng trên lâm sàng Một số bài thuốc gồm cúc hoa vàng, và 5 vị thuốc khác đã được thử lâm sàng trên những bệnh nhân bị cảm phong hàn Thuốc đã có tác dụng làm hếl
sốt ở 80% số bệnh nhân sau ngày điều trị thứ nhất, làm giảm bệnh ờ 12% số
bệnh nhân, và không có tác dụng ở 8% sô' bệnh nhân còn lại [12] Bài thuốc chứa cúc hoa vàng cũng được dùng để điều trị cho bệnh nhân suy nhược thần kinh loại hưng phấn tăng, đa số có có nguyên nhân do sang chấn tinh thần Phưcỉng pháp chữa là hạ hưng phấn, an thần [12].
u 6 2 C ông dụng'.
Thường dùng chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não; viêm mủ da, viêm vú; chóng mặt, nhức đầu, cao huyết áp; đau mắt đỏ, chảy nhiều nước mắt; viêm gan, kiết lỵ Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rắn cắn, chấn thương bầm dập [7].
Theo tài liệu nước ngoài, ở Ẩ i Độ, hoa cúc vàng được coi như có tác dụng làm dễ tiêu và nhuận tràng [1 2
Một nhóm bệnh nhân bị viêm thoái hoá hoàng điểm, thị lực còn 1/10 tới 3/10, đã được điều trị bằng bài thuốc gồm cúc hoa vàng, thục địa, chi tử, hoàng cầm, kỷ tử, đại táo, long nhãn, viễn chí, hạt thảo quyết minh, thưcỉng truật, xác ve sầu Sau thời gian điều trị từ 1-2 tháng, các bệnh nhân không còn các triệu chứng đau đầu, mất ngủ, thị lực tăng từ từ, có bệnh nhân trở lại bình thường, đa số có thị lực từ 5/10 đến 7/10 Sau 6 năm, trên một số bệnh nhân có điều kiện theo dõi thấy vẫn tốt, thị lực ổn định [12].
Trang 111.2 CÚC HOA TRẮNG.
1.2.1 Tên cây.
Tên khoa học : Chrysanthemum morifolium Ramat
Tên đồng nghĩa : c.sinense Sabine
Dendranthema sinense (Sabine) Des Moul Tên khác : Bạch cúc, cúc trắng
Cây sống một năm hay lâu năm Thân đứng, có rãnh Lá mọc so le, hình trứng hoặc trái xoan, có 3-5 thuỳ, gốc thuôn, đầu tròn, hoặc hơi nhọn, mép khía răng không đều, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới phủ lông màu trắng, cuống lá có tai ở gốc.
Cụm hoa mọc ỏ ngọn thân hoặc đầu cành thành đầu to, đường kính 3-6
cm, tổng bao lá bắc gồm các lá phía ngoài hình chỉ, có lông trắng, các lá bên trong thuôn hình trái xoan; hoa 1-2 vòng ở phía ngoài hình ỉưỡi màu trắng, hoa ở giữa hình ống màu vàng nhạt, tràng dài 3mm, tràng của hoa hình ống có
5 thuỳ nhỏ, có tuyến, không có mào lông, nhị 5, bầu nhẵn.
Quả bế, gần hình trái xoan.
1.2.3 Phân bố, sinh thái [5], [6 ], [7], [8 ],[9], [11], [12;
Chi Chrysanthemum L phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm và cận
nhiệt đới Bắc bán cầu Nhiều loài được trồng làm cảnh, vì có hoa đẹp ở Việt Nam, chi này có 5’ 6 loài, đều là cây trồng, trong đó có cúc hoa trắng được nhập từ lâu, hiện có nhiều giống Cúc hoa trắng là cây ưa ẩm, ưa sáng Cây ra hoa nhiều, nhưng không thấy kết hạt, tái sinh vô tính khoẻ, nhân giống chủ yếu bằng cành.
Trang 121.2.4 Bộ phận dùng - thu hái: theo tài liệu [1], [5], [6], [7], [9], [12], hoa được thu hái sau khi mới nỏ, đem phơi trong râm hoặc phơi nắng sau khi đồ 1.2.5 Thành phần hoá học.
Tinh dầu, Flavonoid (luteolin, acacetin, apigenin ), vitamin A, acid amin, acid phenol
-Tinh dầu: chrysanthemol, camphor, monobomylphtalat [12].
-Acid p h e n o l:
+ 2 acid dicaffeol quinic mới (3,5- dicaffeoyl-epi-quinic; 1,3-dicaffeoyl-
quinic), cùng 6 dẫn xuất của acid này [22]
+ Acid chlorogenic (từ phân đoạn metanol của dịch chiết lá) [14]
-T riterp en o id:
*Akihisa T và cộng sự đã phân lập được hai mươi chín 3-hydroxy
Triterpenoid từ phân đoạn lipid không xà phòng hoá được :[13^
+ 2 lupan : calenduladiol, heliantriol B2
+ 2 cycloartan: 24(S)-25-methoxycylcoartan-3beta, 24“ diol và
24(S) -25-methoxycylcoartan-3beta, 24,28- triol.
Trang 13+ Apigenin, Acacetin, Luteolin 7-0-beta-D-glucosid [25]
+Từ phân đoạn etylacetat dịch chiết metanol cúc hoa trắng, phân lập, xác định được 4 Flavonoid dạng aglycon: acacetin, api geni n, quercetin, và luteolin [27]
■4- Theo ‘Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam’, còn có Flavonoid khác: acaciin, baicalin [12]
+ Từ lá và hoa của c.morifolium, Tsao R và cộng sự phân lập đuợc 3
isobutylamid của các acid béo chưa no [29'
N-isobutyl-2E, 4E, lOE, 12Z'tetradecatetraen-8-ynamid N-isobutyl-2E, 4E, 12Z-tetradecitrien-8, 10-dynamid N-isobutyl“2E, 4E, 12E-tetradecatrien-8, 10-dynamid + Trong phân đoạn n-hexan, Ukiya M và cộng sự xác định có các ester 3-
o của acid béo và triterpenoid diol, triol: 26 ester mới và 6 ester đã biết [30]
Trang 14Liên quan đến tác dụng làm sáng mắt của cúc hoa trắng có các nghiên cứu về tác dụng của cúc hoa trắng với enzym aldose reductase:
- Cao chiết nước nóng của cúc hoa có hoạt tính ức chế mạnh enzỵm aldose reductase ở thuỷ tinh thể chuột nhắt trắng [12].
- Acid elganic có ở cúc hoa trắng là chất có hoạt tính ức chế mạnh aldose reductase [12
Cúc hoa trắng có tác dụng chống viêm, chống gốc tự do, kháng khuẩn, kháng virus, kháng ký sinh trùng:
- Các Triterpendiol và triol còn có tác dụng chống viêm do TPA ( 12-0- tetradecanoylphorbol-13-acetat) trên chuột (với ID^O = 0,03- 1,0 mg/tai) mạnh hcfn quercetin( ID50=1,6 mg/tai) [14
- Hai Acid dicaffeoỵl-quinic có khả năng dọn gốc DPPH và anion superoxid mạnh (Hoạt tính dọn gốc O2* trong hệ Xathin/Xanthin oxidase tưcíng đưcmg với quercetin) [22].
- Tinh dầu cất từ nụ hoa cúc hoa trắng có tác dụng ức chế khá mạnh (invitro) các chủng vi khuẩn như phế cầu, liên cầu khuẩn tan máu, tràng cầu khuẩn, tụ cầu vàng 209P, các trực khuẩn lỵ Shiga, Sonne, Plexner, trực khuẩn
mủ xanh, trực khuẩn E.coli, subtilis và trực khuẩn phổi [12J.
- Triterpenoid trong cúc hoa trắng có tác dụng chống lao (ức chế Mycobacterium tuberculois strain H37 Rv trong thí nghiệm MABA), trong đó, maniladiol và 3-epilupenol có hoạt tính mạnh nhất (Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 4 mg/ml) [13]
- Trong những năm gần đây đã có những công trình nghiên cứu tìm hiểu tác dụng kháng virus của cúc hoa trắng: Acacetin -7-O-beta-galactopyranosid
có tác dụng ức chế sự sao chép của HIV trong tế bào H9 [19]; Apigenin 7 -0 -
beta-D-(4' -caffeoyl) glucuronid trong c.m ori/oỉìm có hoạt tính ức chế HIV-1
integrase mạnh 7,2 ± 3 ,4 mg/ml), đồng thời hoạt tính kháng HIV còn
Trang 15thể hiện trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào (EC^O^ 41,86 ± l,43m g/m l) có sử dụng HIV-I (lĩIB) bị nhiễm các tế bào MT-4 [24], [31].
- Dịch chiết cồn c morifolium có tác dụng đối với Plasmodium
falciparum in vitro [34], và ức chế sự phát triển của p.yoelii ở giai đoạn ngoài hồng cầu, thí nghiệm được Akihisa T và cộng sự tiến hành trên loài gặm nhấm (chuột) [33^.
Không những thế, cúc hoa trắng còn có tác dụng kháng u, chống đột biến
và tác dụng trên hệ tim mạch:
- 15 Triterpendiol và triol pentacyclic trong cúc hoa trắng ức chế sự phát triển khối u, với hoạt tính tương đương hoặc mạnh hơn acid glycyrrhetic-chất kháng u tự nhiên Amidiol là chất có tiềm năng gây độc với một số dòng tế
bào ung thư ở người [30].
- Hoạt tính kháng đột biến gen trên Samonella typhimurium TA1535/pSk
1002 của flavonoid trong dịch chiết metanol hoa c morifolium: 4 Flavanoid
(Acacetin, Apigenin, Luteolin, Quercetin) phân lập từ phân đoạn etylacetat có khả năng chống lại các tác nhân gây đột biến gen như furylfuramid (trong đó mạnh nhất là luteolin với IDjo (liều ức chế 50%) = 0,44mmol/ml); 4- nitroquinolinl-oxid, N-methỵl-N - nitro-N-nitrosoguanidin (không cần enzym chuyển hoá ở gan); aflatoxin B l, và 3-amino-l,4-'dimethyl-5H- pỵrido [4,3-b] indol (cần enzym chuyển hoá ở gan và bức xạ ƯV) [27].
- c morifolium còn có tác dụng bảo vệ tim trong quá trình gây thiếu máu
cục bộ và tái tưới máu trên tim chuột phân lập và tế bào cơ tâm thất [21],
Giống như với cúc hoa vàng, cũng đã có một số nghiên cứu thử nghiêm lâm sàng chế phẩm thuốc từ cúc hoa trắng Trong một thử nghiệm lâm sàng trên 54 bệnh nhân có tăng huyết áp, 31 bệnh nhân được điều trị với glycosid cúc hoa trắng và 23 bệnh nhân còn lại được cho placebo để đối chứng Liều dùng là 0,5 g glycosid đóng nang, ngày ba lần; đợt điều trị 30 ngày; chẩn đoán tăng huyết áp theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới; đo huyết áp và đánh
Trang 16giá hiệu quả điều trị theo tiêu chuẩn quốc gia thống nhất Kết quả: 18 ca có hiệu quả tốt (58,1%), 8 ca có hiệu quả khá (25,8%), 5 ca không có hiệu quả
(16,1%) Hiệu quả toàn bộ là 83,9% ở nhóm điều trị với glycosiđ và 8,6 % ồ
nhóm placebo Sự khác biệt ở hai nhóm có ý nghĩa thống kê Trước và sau khi dùng thuốc, điện tâm đồ của bệnh nhân không có sự tốt lên hay xấu đi rõ rệt
Có sự giảm nhẹ về trị số trung bình cholesterol và beta-lipoprotein máu Những tác dụng không mong muốn như ợ chua, chướng bụng nhẹ, buồn nôn
và nhức đầu xảy ra ở vài bệnh nhân Tuy vây, không cần ngừng thuốc hoặc
dùng biện pháp khác Những triệu chứng trên tự mất đi Sau một tuần dùng thuốc, lượng nước tiểu tăng lên và huyết áp giảm rõ rệt Có thể tác dụng hạ huyết áp có liên quan với sự tăng tiết niệu [3].
Tóm lại, c.m oñfolium có nhiều tác dụng: chống viêm, chống đột biến,
ức chế sự phát triển của khối U, hay nhiều loại vi khuẩn (Mycobacterium tuberculosis, Staphyloccocus aureus, ) (invitro), virus (đặc biệt là HIV), ký sinh trùng sốt sét Trong đó, tiềm năng chống oxy hoá và kháng HIV của cúc hoa đang được quan tâm.
1.2.6.2, C ông dụng.
Hoa dùng để pha với trà hay ngâm rượu uống.Thường dùng chữa: phong nhiệt cảm mạo, đau đầu, tăng huyết áp; chóng mặt nhức đầu; mắt đỏ sưng đau, chảy nước mắt Dùng riêng hoặc phối hợp với các vị thuốc khác Dùng ngoài rửa, giã tươi, đắp mụn nhọt, sưng lơ [7].
Trang 17PHẦN 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN LIỆU.
Cúc hoa vàng, cúc hoa trắng được mua tại hiệu thuốc của bệnh viện YHCT trung ương Tên khoa học của chúng được giáo sư Trần Công Khánh xác định theo tài liệu [4]:
- Cúc hoa trắng: Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel Asteraceae.
- Cúc hoa vàng: Dendranthema indicum (L.) Des Moul Asteraceae.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2 .2 .1 Nghiên cứu thành phần hoá học của cúc trắng, cúc vàng.
a Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng bằng phản ứng hoá học.
b Định tính phân đoạn etylacetat bằng sắc kỹ lớp mỏng.
c Phân tích thành phần dịch chiết cồn và phân đoạn etylacetat của cúc hoa vàng, cúc hoa trắng bằng HPLC.
d Phân tích thành phần tình dầu trong cúc hoa trắng, CÜC hoa vàng bằng GC-MS.
e Định lượng phân đoạn etylacetat của cúc hoa trắng, cúc hoa vàng theo phưcmg pháp cân.
f Chiết xuất, phân lập một số chất hoặc hỗn hợp vài chất:
- Chiết xuất bằng các dung môi khác nhau, chiết phân đoạn lừ dịch chiết cồn 70^, đun hồi lưu.
- Sắc ký cột silicagel để phân lập một số chất hoặc hỗn hợp vài chất.
Trang 182 .2 .2 .Nghiên cứu một sô tác dụng sinh học của cúc trắng, cúc vàng.
Nguyên tắc: Hoạt tính dọn gốc tự do anion superoxid : được xác định theo phưcỉng pháp của Imara và cộng sự, bằng cách xác định phức tạo thành giữa anion superoxid trong hệ Xanthin/Xanthin oxydase (XOD) và Nitro Blue Tetrazilium(N BT).
Hỗn hợp được trộn kỹ trong 10 phút ở nhiệt độ phồng Sau dó, thêm 50
ịú dung dịch XOD 0,14 mg Protein/ml, lắc kỹ và giữ 20 phút ở nhiệt độ
phòng Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm 50|xl dungdịch CuClj 6mM Dung dịch sẽ có màu xanh tím do phản ứng giữa NBT và anion Đo quang ở
bước sóng 570 nm Tác dụng dọn gốc tự do (theo %) được tính bằng cách so
sánh độ hấp thụ quang học của dung dịch thử với độ hấp ihụ quang học của dung dịch không chứa mẫu thử.
Trang 19và dung dịch thử có chứa dịch chiết được giữ trong bóng tối trong 30 phút Sau
đó, đo độ hấp thụ quang học trên máy đo quang 800 (Mỹ) ở 517 nm.
c Tác dụng chông peroxy hoá lỉpỉd trong dịch đổng th ể t ế bào gan chuột nhắt th í nghiệm.
Việc đánh giá tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào được thực hiện qua việc xác định hàm lượng Malonyl diadehyd (MDA), một sản phẩm của quá trình này dựa theo phưcmg pháp đã được miêu tả bởi Hiroshi Ohkawa [18] với một số thay đổi nhỏ.
Nguyên lý của phương pháp:
MDA là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid, có thể phản ứng với acid thiobacbituric để tạo phức Trimethin có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở 503-532 nm Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA được tính theo đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết nồng độ từ 2,00 nmol đến 15,2 nmol.
Tất cả các mẫu thử được đo độ hấp thụ ở bước sóng 532 nm trên máy đo quang EL^ 800 (Mỹ).
Trang 20PHẦN 3. THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẨN HOÁ HỌC.
3.1.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cúc hoa vàng, cúc hoa trắng bằng phản ứng hóa học.
Tiến hành: Theo tài liệu [2], [3].
3 Ỉ.L 1 Đ ịnh tín h /lavon oid.
Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50 ml cồn 90“, đun cách thuỷ 1 phút, lọc nóng, dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Cyanidin: cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết cồn, thêm một
ít bột Mg kim loại, thêm tiếp vài giọt HCl đặc, đun cách thuỷ thấy dịch chiết chuyển từ màu vàng sang màu đỏ=> phản ứng dương tính.
- Phản ứng với PeCỉị 5%: cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết cồn, thêm
vài giọt dung dịch FeCl 5%, thấy xuất hiện màu xanh đen => phản ứng dưcfng tính.
- Tác dụng với kiềm:
+ Với dung dịch NaOH: cho Iml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm
vài giọt NaOH 10%, thấy màu vàng của dung dịch đậm lên :=> phản ứng dương tính-
+ Hơi NH3 : nhỏ một giọt dịch chiết cồn lên một miếng giấy lọc, hơ khô rồi đặt lên miệng lọ amoniac đã mở nút Quan sát thấy màu vàng của dịch chiết đậm lên => phản ứng dưcíng tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng có ílavonoiđ.
Cho khoảng 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thấm ẩm bằng NH OH 0,5N 30 phút sau thêm 15ml CHCI vào đậy kín 12giờ sau gạn
Trang 21dịch chiết CHCl^, lắc dịch chiết với dung dịch acid sulfuric IN hai lần, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết acid lại với nhau đem làm phản ứng : + Ống nghiệm 1: Iml dịch chiết thêm 2-3 giọt TT Mayer
+ Ống nghiệm 2: Iml dịch chiết thêm 2-3 giọt TT Dragendoff
+ Ống nghiệm 3: Iml dịch chiết thêm 2-3 giọt TT Bouchardat
K ết quả: Cả 3 ống nghiệm đều không thấy xuất hiện tủa => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng không có alcaloid.
3.1.1.3, Đ ịnh tính Saponin.
- Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm Ig dược liệu cùng 5ml nước, đun sôi nhẹ, ỉọc nóng Dịch lọc thu được hoà loãng với lOml nước lắc mạnh trong 1 phút, rồi
để yên trong 15 phút Quan sát thấy cột bọt bền vững.
- Phản ứng phân biệt saponin steroid và saponin trỉterpenoid:
Lấy khoảng Ig dược liệu, chiết bằng cồn 90® trên nồi cách thuỷ trong
10 phút, lọc nóng, được dịch chiết cồn Cho dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm, mỗi Ống 5 giọt.
+ Ống 1: thêm 5ml NaOH 0,1N.
+ Ống 2: thêm 5ml HCl 0,1N.
Lắc mạnh đồng thời hai ống trong 5 phút Quan sát thấy cột bọt trong ống 2 cao hcfn trong ống 1 Kết luận Saponin trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng là loại triterpenoid.
Cho Ig bột dược liệu vào lOml dung dịch NaCl 0,9%, đun cách thuỷ trong 30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc Nhỏ 1 giọt máu bò 2% đã loại fibrin lên lam kính, đậy lamen Nhỏ 1 giọt dịch lọc ở trên vào 1 cạnh lamen, Quan sát dưới kính hiển vi thấy hồng cầu bị vỡ ra khi dịch chiết thấm vào.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng có Saponin tri terpenoid,
Trang 22- Phản ứng Lihermann:
Hoà tan cắn trong ống nghiệm thứ nhất bằng 0,5 ml anhydric acetic Đặt nghiêng ống nghiêm 4 5 ", thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiêm để dịch lỏng trong ống chia làm 2 lớp Mặt tiếp xúc giữa lớp chất lỏng không xuất hiện vòng tím đỏ => phăn ứng âm tính.
- Phản ứng Legal:
Cắn trong ống nghiệm thứ 2 đem hoà tan bằng 0,5 ml cồn 90*^ Thêm 5 giọt Nitroprussiat 1% và 5 giọt dung dịch NaOH 10%, không thấy xuất hiện màu hồng trong ống nghiệm => phản ứng âm tinh.
- Phản ứng Baljet:
Cắn trong ống nghiệm thứ 3 được hoà tan bằng 0,5 ml cồn 90" Thêm thuốc thử Baljet mới pha vào (một phần dung dịch acid picric 1 % và chín phần dung dịch NaOH 10%), khồng xuất hiện màu vàng cam => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng không có glycosid tim 3.1.1.5 Định tính coumarin,
Lấy lOg bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90", đun cách thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau;
~ Phản ứng mở, đóng vòng ỉacton:
Cho vào hai ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml dịch chiết, ố n g 1: thêm 0,5
ml dung dịch NaOH 10%, ống 2: để nguyên Đun cả 2 ống nghiêm trên nồi cách thuỷ đến sôi Quan sát thấy:
Trang 23+ ố n g 1 : dịch chiết có tủa đục màu đỏ, + Ống 2: dịch chiết vẫn trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiêm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát thấy;
- Vi thăng hoa:
Cho Img bột dược iiệu vào 1 nắp chai bằng nhôm Hơ trên đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên trên miệng nắp nhôm một lam kính, trên đó có để một miếng bông ướt Đặt nắp nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi dưới kính hiển vi Không thấy
có tinh thể hình kim nào xuất hiện => phản ứng âm tính.
- Quan sát huỳnh quang:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH 5%,
sấy nhẹ Che i/2 vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút sau đó cất đồng xu đi, nửa hình tròn không che và nửa có che sáng như nhau => phản ứng am tính.
> Kết luận; trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng không có coumarin.
3,1.1.6 Định tinh tanin,
Cho khoảng 5g dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 20ml nước Đun sôi trực tiếp trong 5 phút, lọc qua giấy lọc Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ mỗi ống Iml dịch lọc đem làm phản ứng định tính :
+ Ống 1 : thêm 1 giọt dung dịch PeClg, thấy xuất hiện màu xanh đen => phản ứng dưcíng tính.
Trang 24+ ố n g 2 : thêm Iml dung dịch gelatin 2 %, không thấy xuất hiện tủa bông trắng => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng không có tanin.
3 1 1 J , Đ ịnh tính anthranoid.
Lấy khoảng Ig bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất đun sôi trực tiếp trong 10 phút Để nguội, lọc lấy dịch lọc, thêm 5ml ether ethylic lắc nhẹ, gạn lấy dịch chiết ether ethylic đem làm phản ứng Borntraeger Cho Iml dịch chiết ether vào ống nghiệm sạch, thêm Iml dung dịch NaOH10%, không thấy xuất hiện màu hồng => phản ứng âm tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng không có anthranoid.
3.ỉ ỉ , 8 Định tính chát béo, caroten, sterol.
Ngâm lOg bột dược liệu trong bình nón bằng ether dầu hoả, để qua đêm Lọc lấy dịch, đem dịch làm các phản ứng;
- Định tính chất béo: nhỏ 1 giọt dịch chiết này lên 1 miếng giấy lọc để
khô rồi quan sát: không thấy có vết đục mờ trên miếng giấy lọc => phản ứng
âm tính.
- Định tính caroten: lấy 2ml dịch chiết ether dầu cho vào ống nghiêm
nhỏ, bốc hơi cách thuỷ tới cắn Cho thêm 2 giọt acid sulfuric đặc vào thấy màu dung dịch chuyển sang xanh da trời => phản ứng dưcíng tính.
- Định tính sterol: lấy Iml dịch chiết ether dầu hoả bốc hơi tới cắn, cho
thêm Iml anhydrit acetic lắc kỹ Đặt nghiêng ống nghiệm 45” rồi thêm từ từ 0,5ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Quan săt thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng có vòng tím đỏ => phản ứng dưcmg tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng có sterol, caroten, không
có chất béo.
Trang 253,1,1,9, Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin,
Cho 5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm lOml nước, đun cách thuỷ trong 10 phút Lọc lấy dịch lọc đem định tính:
TT Fehling A và 3 giọt TT Fehling B Đun cách thuỷ 5 phút, thấy trong ống nghiệm có tủa đỏ gạch => phản ứng dưcíng tính.
> Kết luận; trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng có đường khử.
- Định tính acỉd hữu cơ: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiêm và cho
thêm một ít tinh thể NajCOj thấy bọt khí nổi lên => phản ứng dương tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng có acid hữu cơ.
- Định tính acid amin: cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt
TT Ninhydrin 3%, Đun cách thuỷ 7-10 phút, thấy xuất hiện màu xanh tím
=> phản ứng dương tính.
> Kết luận: trong cúc hoa trắng, cúc hoa vàng có acid amin.
B ả n g l : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cúc trắng, cúc vàng:
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Cúc hoa
trắng
Cúc hoa vàng
Kết luận
1 Alcaloid Tạo tủa với thuốc thử
Tl May er l'1'.Dragendorff
có
Trang 264 Coumarin Vi thăng hoa
Hiện tượng huỳnh quang
-Không có
9 Đường khử Hư VỚI n .hehling A
có
(+): Dương tính (+++): Phản ứng rất rõ Kết luận: Trong cúc hoa vàng, cúc hoa trắng có các nhóm chất: flavonoid, saponin loại triterpenoid, acid hữu cơ, đường khử, aciđ amin, sterol, caroten.
3.1.2 Đ ịnh tính phán đoạn etylacetat bằng SKLM:
- Dịch chấm sắc ký: cắn của dịch chiết etyl acetat cúc hoa trắng, cúc hoa vàng
hoà tan trong metanol.
- Chất hấp phụ: Bản mỏng silicagen GF2I5 4 được hoạt hoá ở 110 “C/1 giờ.
- Hệ dung môi khai triển:
Hệ 1: Etylacetat: chloroform: acid formic (4:1:1)
Hệ 2: Toluen: etyl acetat: acid formic ( 5:6:2)
Trang 27Hệ 3: Toluen: etyl acetat: acid formic: nước (6:5:1,5:1)
Hệ 4: Etỵl acetat: acid formic: nước (8:1:1)
- Thuốc thử hiện màu: hơi NH3.
- Kết quả: Với hệ 2, các vết tách tốt hcfn Kết quả định tính bằng SKLM sử dụng hệ dung môi 2 được thể hiện trên bảng 2, hình 1.
B ảng 2: Kết quả định tính phân đoạn etỵlacetat của cúc hoa trắng, cúc hoa
Trang 293.1.3 Phân tích thành phần của dịch chiết cồn và phân đoạn etylacetat
bằng HPLC ( ở bước sóng 254,4 nm).
3.1.3.1 Dịch chiết cồn cúc hoa trắng, cúc hoa vàng.
Trên phổ HPLC của cúc hoa vàng có 5 pic (phụ lục 1), của cúc hoa trắng (phụ lục 2) có 8 pic Số lượng các pic chính có mặt ở cả hai phổ HPLC của cúc hoa vàng, cúc hoa trắng với thời gian lưu tương ứng khá gần nhau Tuy nhiên,
tỷ lệ các pic khác nhau nhiều khi so sánh hai phổ HPLC này Chất có hàm lượng cao nhất trong cúc hoa vàng có thời gian lưu là 21,705 phút (53,2681%) (pic 4), còn cúc hoa trắng là 2,612 phút (35,628%) (pic 2) Các pic có thời gian lưu từ 0-25 phút có thể chia thành 3 nhóm theo bảmg 3:
cúc hoa vàng, cúc hoa trắng theo thời gian lưu.
Nhóm Thời gian lưu(phút)
các chất có thời gian lưu ở nhóm 1 , còn cúc hoa vàng chủ yếu là các chất có thời gian lưu ở nhóm 2 .
3 ỉ 3.2 Phân đoạn etylacetat của cúc hoa vàng, cúc hoa trắng.
ở cùng một điều kiện sắc ký (loại cột, chế độ dung môi, detector) và ở
bước sóng 254 nm, phân đoạn etylacetat của cúc hoa vàng, cúc hoa trắng có các đặc tính phổ HPLC như sau:
Trang 30B ảng 4: Thời gian lưu và hàm lượng phần trăm của các pic trong phổ
HPLC của phân đoạn etylacetat cúc hoa vàng, cúc hoa trắng:
stt
s t t Thời gian
lưu(phút)
Hàm lương (% )'
Thời gian lưu (phút) Hàm lượng (%)
Trang 31Trên phổ HPLC của phân đoạn etylacetat từ cúc hoa trắng (Phụ lục 4) có
21 pic, cồn từ cúc hoa vàng (Phụ lục 3) có 17 pic Trong đó, 14 pic có thời gian lưu gần sát với các pic có trong phổ của cúc hoa trắng 3 pic không tưcíng ứng là các pic có thời gian lưu là 1,620; 11,388; 16,104, các pic này có diện tích đáng kể nhưpic ở 11,388 chiếm 9,2133 %; pic ở 16,104 chiếm 7,1792%; pic ở 1,620 chiếm 2,1637%; tổng cộng 3 pic này có tỷ lệ là 18,5562% trong tổng sô' các pic xuất hiện trong phổ của phân đoạn etylacetat của cúc hoa vàng, mà các pic này không thấy xuất hiện trên phổ HPLC của phân đoạn etylacetat từ cúc hoa trắng.
Trên phổ của cúc hoa trắng có 3 pic gần nhau có thời gian lưu là 11,865; 13,882; 15,645, chiếm diện tích khá lớn là 45,7893 % trong tổng số các pic có trên phổ tưcmg ứng của cúc hoa trắng Tỷ lệ 2 pic xuất hiện gần trùng với các pic đang nói là các pic có thời gian lưu 11,916 và 15,626 chiếm chỉ có 4,5502
% trong tổng số các pic của phân đoạn etylacetat từ cúc hoa vàng.
Ngoài sự khác biệt trên, có thể thấy là nhiều trong số các pic thành phần của hai phân đoạn etylacetat đã phân tích trùng hợp nhau nếu ta xem xét đến phổ UV của các pic thành phần này Ví dụ: nếu ta chọn các pic có thời gian lưu tưcỉng tự như pic có thời gian lưu 15,653 trên phổ của cúc hoa trắng và 16,105 trên phổ của cúc hoa vàng ta thấy hai pic này có dạng phổ u v và các đỉnh cực đại trùng lặp (Bảng 5, Phụ lục 5).
B ảng 5: Các đỉnh cực đại của các pic có thời gian lưu là 15,653và 16,105 phút.
Trang 32luu từ cúc hoa vàng là 21,742, ta thấy hai pic này có dạng phổ khác nhau, pic
ở dải I , dải II cao hơn hay thấp hcm khác nhau (Phụ lục 6 ).
Tóm lại, các số liệu về HPLC tuy chưa đủ để có thể kết luận về sự khác nhau hay giống nhau giữa thành phần các chất có trong phân đoạn etylacetat
từ cúc hoa vàng, cúc hoa trắng, nhưng cũng có thể sơ bộ nhân xét là có sự khác nhau về số lượng các chất (tương ứng với các pic) có trong phân đoạn etylacetat của hai loại cúc hoa, đặc biệt tỷ lệ tương đối giữa các chất chính (có hàm lượng đáng kể) trong tổng số các chất có trong dịch chiết cũng khác nhau đáng kể giữa hai loại dịch chiết etylacetat từ cúc hoa vàng, cúc hoa trắng Những khác nhau này có thể dẫn đến sự không hoàn toàn giống nhau (hoặc khác nhau) về tác dụng sinh học của hai vị thuốc.
3.1.4 Phân tích thành phần tinh dầu của cúc hoa vàng, cúc hoa tráng bàng GC-M S (Phụ lục 7, 8 ).
- Tinh dầu được cất bằng phưcfng pháp cất kéo với hơi nước.
- Bằng GC-MS, xác định được 25 cấu tử trong tinh dầu của cúc hoa trắng cũng như cúc hoa vàng:
B ảng 6 Thành phần và hàm lượng các cấu tử trong tinh dầu củc hoa.
Trang 336 Limonen dioxid 2,78 1,23 Phenyl-p-menhan
2 1 Acid Eicosatrienoic 2,51 3,36 Ethyl linoleolat
N hận x é t Thành phần cũng như hàm lượng các cấu tử trong tinh dầu của
hai loại cúc hoa rất khác nhau.
Trang 343.1.5 Định lượng phân đoạn etylacetat của cúc hoa trắng, cúc hoa vàng theo phương pháp cân.
a C hiết xuất-.
Cân chính xác 50 g dược liệu, xác định hàm ẩm Cho dược liệu vào bình
cầu 0,5 1, chiết hồi lưu với cồn IQf 3 lần (900 ml), mỗi lần 6 giờ Gộp dịch chiết, cô cách thuỷ đến hết cồn Hoà cắn trong nước nóng, lọc nóng, dịch nước thu được chiết trên bình gạn với n-hexan đến khi lớp n-hexan hết màu (3 lần) Dịch nước thu được cho bay hơi hết dung môi n-hexan, sau đó tiếp tục chiết bằng chloroform đến khi lớp chloroform hết màu (3 lần) Dịch nước thu được lại cho bay hcd hết chloroform ,và chiết với etylacetat đến khi lớp etylacetat hết màu (30ml * 8 lần) Thu hồi dung mồi đến khi dịch chiết đâm đặc, rồi cô cách thuỷ tới khô Sấy cắn ở 5 0 °c đến khối lượng không đổi Cân, tính hàm lượng các chất trong dịch chiết etylacetat theo công thức:
a.ioo Hàm lượng (%) = - =^100%
A.(IOO-X) Với; a: Lượng cắn khô (g).
A; Khối lượng dược liệu đem định lượng (g) X: Hàm ẩm của dược liệu (%)
Bảng 7: Kết quả định lượng phân đoạn etylacetat cúc hoa trắng, cúc hoa vàng.
Mẫu
Khối lượng dược liệu(g) Độ ẩm (%)
Khối lượng cắn
(g)
Hàm lưcfng (%)■ Cúc
trắng
cúc vàng
Cúc trắng
cúc vàng
Cúc trắng
cúc vàng
Cúc trắng
cúc vàng
1 50,8901 51,9935 21,31 19,22 U0325 0,9478 2,58 2,26
2 49,9720 51,3818 17,35 15,06 1,0283 0,9845 2,49 2,256
Trang 35Nhận xét: Kết quả xác định hàm lượng các chất trong phân đoạn etylacetat
của cúc trắng, cúc vàng được tính theo phucfng pháp thống kê, với độ tin cậy 95% cho hàm lượng cúc trắng và cúc vàng tưcmg ứng là 2,54 ± 0,072 %; 2,27±0,038 %.
3.1.6 Phán lập, nhận dạng các chất trong phân đoạn etyfacetat của cúc hoa vàng.
a Phán lập.
- Cột thuỷ tinh, đường kính 2,4 cm, chiều dài 40 cm, Chất nhồi cột là silicagel 60 (Merck), cỡ hạt 0,04-0,06 mm.
- Nạp silicagel vào cột theo phương pháp nhồi cột ướt.
- Dùng dung môi chloroform và tăng dần độ phân cực bằng metanol để rửa giải.
- Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm được đánh số Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi Toluen: Etylacetat: Acid formic (5: 6 : 2) Gộp các ống có vết giống nhau.
- Kết quả: ớ phân đoạn đầu với chloroform, và phân đoạn (chloroform: metanol) (47:3) có chất kết tinh Lấy riêng hai phân đoạn trên, cho kết tinh nhiều lần, thu được hai chất P l, P2 P2 tưcmg ứng với vết 1, P1 gần với vết 3 Irong sắc ký đồ của phân đoạn etylacetat cúc hoa vàng (Hình 2) Kiểm tra độ tinh khiết của P l, P2 với 2 hệ dung môi là hệ III và hệ V (etylacetat: chloroform: acid formic (9:4:1)) Kết quả cho thấy các chất phân lập đều cho một vết.
Trang 36- Phổ IR (phụ lục 10) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3110,9; 2927,0; 1671,7; 1523,3; 1404,2; 1274,8; 1197,7; 1051,1; 949,7; 833,1; 776,9; 489,9 cm *.
- Phổ khối (MS ) (Phụ lục 11) cho [M^] = 206 mu Tra thư viện phổ khối cho biết P1 trùng khớp 83% với 5 , 5 - oxy- dimethylen- bis (2- furaldehyd) Căn cứ phổ u v , IR, phổ khối chúng tôi sơ bộ nhận dạng chất P1 là 5, 5 - oxy- dimethylen- bis (2 - furaldehyd).
b2 N hận dạng P2\
- Ÿ2 ò dạng tinh thể hình khối dẹt, tụ lại với nhau thành đám, màu nâu
sẫm (Hình 3) tan tốt trong dietylete, aceton, chloroform, metanol, không tan trong nước.
- Phổ u v (Phụ lục 12) đo trong metanol cho ^max ■ 254 nm.
- Phổ IR (Phụ lục 13) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3358 (~ VOH); 1685,1 (^v c = 0 ) ; 1608,6; 1585,9; 1513,2; 1432,3; 1288,5; 1221,7; 1167,6; 1118,2; 856,5; 776,0; 703,2; 667,8; 504,6 (c m '').
- Phổ khối (MS) (Phụ lục 14) cho biết [M"*"] = 152 mu tương ứng với công thức phân tử CgHgOg Tra thư viện phổ khối chất P2 trùng hợp 95% với methyl- p- hydroxybenzoat.
Căn cứ vào phổ u v , phổ IR, phổ khối, chúng tôi sơ bộ nhận dạng chất P2
là methyl- p- hydroxybenzoat.
O ^ ^ O C H 3
0H
Trang 373.2 NGHIÊN CỨU MỘT s ố TÁC DỤNG SINH HỌC.
3.2.1 Xác định hoạt tính dọn gốc tự do O 2 '' ■
Mẫu được hoà tan trong PBS, chọn liều thích hợp để thử hoạt tính dọn gốc tự do Oj*' Kết quả thử sơ bộ cho thấy dung dịch của các mẫu có màu xanh tím đậm và độ đậm thay đổi theo nồng độ mẫu thử, Sau khi thăm dò, mỗi mẫu được pha ở nồng độ tối ưu là: 2mg/ml với dịch chiết cồn và 0,5 mg/ml với dịch chiết etỵlaceíat Kết quả được thể hiện trong các bảng sau:
B ảng 5;Tác dụng của dịch chiết cồn cúc hoa vàng đối với sự tạo thành
anion Superoxid trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase.
Nồng độ mẫu thử (klg/ml) E ± S D
% so với đối chứng
Độ ức chế (%)
Nồng độ mẫu thử (|ig/ml) E ± S D
% so với đối chứng
Độ ức chế (%)
Trang 38□ Cúc hoa vàng
■ Cúc hoa tráng
H ình 4: Tác dụng của dịch chiết cồn cúc hoa tráng, cúc hoa vàng đối với sự
t ạ o t h à n h a n i o n S u p e r o x id t r o n g h ệ Xanthin/Xanthin o x i d a s e
B ảng 10: Tác dụng của phân đoạn etyl acetat cúc hoa vàng đối với sự tạo
thành anion S u p e r o x id trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase.
Nồng độ mẫu thử E ± S D
% so với
đối chứng
Độ ức chế (%)
B ảng I I : Tác dụng của dịch chiết etylacetat cúc hoa trắng đối với sự tạo thành
anion S u p e r o x id trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase.
Nồng độ mẫu thử (Mg/ml) E ± S D
% so với đối chứng
Độ ức chế (%)
Trang 39H ỉnh 5: Tác dụng của dịch chiết etylacetat cúc hoa trắng, cúc hoa vàng đối
với sự tạo thành anion Superoxid trong hệ Xanthin/Xanthin oxidase.
Nhận xét.
cúc hoa trắng đều có tác dụng ức chế sự tạo thành Superoxid mạnh hơn dịch chiết cồn: ở nồng độ 2.5 Hg/ml , dịch chiết etyl acetat cúc hoa vàng và cúc trắng có tác dụng ức chế khá tốt (cúc hoa vàng: 21.55% ; cúc hoa trắng: 15.47%), trong khi đó phải ở nồng độ 20 Hg/ml, dịch chiết cồn cúc hoa vàng, trắng mới có tác dụng ức chế (cúc hoa vàng: 6.16%; cúc hoa trắng: 2,57%).
- Khi tăng nồng độ mẫu thử lên độ ức chế cũng tăng lên ở nồng độ 15
Trang 403.2.2 Tác dụng dọn gốc DPPH:
Mẫu được hoà vào cồn tuyệt đối với các nồng độ sau:
• Dịch chiết etylacetat của cúc hoa trắng và vàng: 0,5 mg/ml và
• Dịch chiết cồn etylic cúc hoa tráng, v à n g : 5 mg/ml,
Kết quả ihu được ở các bảng sau:
B ảng 12: Tác dụng dọn gốc DPPH của dịch chiết etylacetat cúc hoa vàng:
Nồng độ mẫu thử (^g/ml)
E ± S D % so với
đối chứng
Nồng độ mẫu thử (Mg/ml)
E ± S D % so với
đối chứng
Độ ức che (%)