nghiên cứu thành phần hóa học thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium l amaryllidaceae)

B GIÁO D C VÀ ÀO T O IH CYD B C THÀNH PH H YT CHÍ MINH ***** NGUY N H U L C TH Y NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C, THI T L P CH T I CHI U VÀ XÂY D NG QUY TRÌNH KI M NGHI M THÀNH PH N ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) LU N ÁN TI N S D CH C Tp H Chí Minh – N m 2014 B GIÁO D C VÀ ÀO T O IH CYD B C THÀNH PH H YT CHÍ MIINH NGUY N H U L C TH Y NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C, THI T L P CH T I CHI U VÀ XÂY D NG QUY TRÌNH KI M NGHI M THÀNH PH N ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: KI M NGHI M THU C Mã s : 62.73.15.01 LU N ÁN TI N S D Ng ih CH C ng d n khoa h c: PGS.TS VÕ TH B CH HU Tp H Chí Minh – N m 2014 L I CAM OAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên c u c a riêng tơi Các s li u, k t qu đ c trình bày lu n án trung th c ch a t ng đ c công b b t k cơng trình khác Ng i cam đoan, Nguy n H u L c Th y i M CL C M C L C i B NG CÁC CH VI T T T .iii DANH M C HÌNH NH v DANH M C S vi DANH M C CÁC B NG vii TV N CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 T ng quan th c v t h c Trinh n hoàng cung 1.2 T ng quan hóa h c c a chi Crinum TNHC 1.3 T ng quan tác d ng sinh h c chi Crinum TNHC 14 1.4 Chi t ho t ch t t d 1.5 Các ph 1.6 Ph CH c li u b ng dung môi CO2 siêu t i h n 21 ng pháp nghiên c u hóa h c c a Trinh n hoàng cung 22 ng pháp thi t l p ch t đ i chi u 24 NG 2: PH NG PHÁP NGHIÊN C U 27 2.1 Nguyên v t li u 27 2.2 Trang thi t b 28 2.3 Ph ng pháp nghiên c u 29 2.3.1 Chi t xu t – phân l p ho t ch t t TNHC 29 2.3.3 Thi t l p ch t đ i chi u 34 2.3.4 Ph 2.3.5 CH ng pháp đ nh tính, đ nh l ng alcaloid flavonoid 35 xu t m t s ch tiêu c n thi t đ xây d ng TCKN d c li u TNHC 40 NG 3: K T QU NGHIÊN C U 41 3.1 Quy trình chi t cao c n, phân đo n alcaloid flavonoid t TNHC 41 3.1.1 Quy trình chi t ho t ch t b ng ph ng pháp ng m ki t 42 3.1.2 Chi t ho t ch t t TNHC b ng ph ng pháp SFE ng m ki t 44 3.2 Phân l p h p ch t tinh t t cao chi t TNHC 47 3.2.1 S c ký c t chân không 47 3.2.2 S c ký c t c n 48 ii 3.2.3 Xác đ nh c u trúc 53 3.2.3.1 Xác đ nh c u trúc h p ch t (2) 53 3.2.3.2 C u trúc h p ch t ch a đ 3.2.3.3 C u trúc h p ch t đ c công b t TNHC 60 c công b t TNHC 63 3.3 Thi t l p ch t đ i chi u 70 3.3.1 Xây d ng ph ng pháp đánh giá nguyên li u thi t l p C C 70 3.3.2 Xây d ng tiêu chu n ch t l ng đánh giá nguyên li u C C 76 3.3.3 Xây d ng tiêu chu n ch t l ng đánh giá C C 77 3.3.4 óng gói đánh giá đ ng nh t lô 77 3.3.5 ánh giá đ ng nh t liên phịng thí nghi m 79 3.3.6 Xác đ nh giá tr n đ nh giá tr công b 79 3.4 Xây d ng ph ng pháp HPLC, CE, d u vân tay 83 3.4.1 Quy trình x lý m u 83 3.4.2 Quy trình đ nh l ng đ ng th i alcaloid b ng ph 3.4.3 Quy trình đ nh l ng đ ng th i flavonoid b ng HPLC 89 3.4.4 Quy trình đ nh l ng đ ng th i alcaloid b ng ph 3.4.5 Quy trình đ nh l ng đ ng th i flavonoid b ng ph 3.4.6 Ph 3.5 CH ng pháp HPLC 84 ng pháp CE 92 ng pháp CE 95 ng pháp d u vân tay 98 xu t m t s ch tiêu c n thi t đ xây d ng TCKN d c li u TNHC 100 NG 4: BÀN LU N 103 4.1 Các ph ng pháp chi t xu t ho t ch t t TNHC 103 4.2 Phân l p h p ch t tinh t 107 4.3 Thi t l p ch t đ i chi u 112 4.4 Quy trình đ nh l ng alcaloid flavonoid 113 4.5 Tiêu chu n ki m nghi m d c li u TNHC 118 K T LU N KI N NGH DANH M C CƠNG TRÌNH NGHIÊN C U LIÊN QUAN TÀI LI U THAM KH O PH N PH L C N LU N ÁN iii B NG CÁC CH ASEAN VI T T T Association of Southeast Asian Nations (Hi p h i qu c gia ông Nam Á) AL-NK Phân đo n alcaloid chi t t TNHC b ng ph ng pháp ng m ki t AL-SA Phân đo n alcaloid chi t t TNHC b ng sóng siêu âm AL-SFE Phân đo n alcaloid chi t t TNHC b ng ph AR-96 Phân đo n alcaloid chi t t r TNHC v i dung môi c n 96% As H s b tđ i C C Ch t đ i chi u CE Caplillary Electrophoresis ( i n di mao qu n) Corr Area Corrected Area (Di n tích pic đ CZE Caplillary Zone Electrophoresis ( i n di mao qu n vùng) d doublet (đ nh đôi) D VN IV D DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhi t vi sai) DMSO Dimethylsulfoxyd DVT D u vân tay FL-NK Phân đo n flavonoid chi t t TNHC b ng ph FL-SA Phân đo n flavonoid chi t t TNHC b ng sóng siêu âm FL-SFE Phân đo n flavonoid chi t t TNHC b ng ph FR-96 Phân đo n flavonoid chi t t r TNHC v i dung môi c n 96% GC Gas Chromatography (S c ký khí) GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (S c ký khí ghép kh i ph ) HPLC High Performance Liquid Chromatography (S c ký l ng hi u n ng cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared (H ng ngo i) J Coupling constant (H ng s ghép) ng pháp SFE c chu n hóa) c n Vi t Nam xu t b n l n th IV ng pháp ng m ki t ng pháp SFE iv LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (S c ký l ng ghép kh i ph ) L-SFE Cao toàn ph n chi t t TNHC b ng ph ng pháp SFE MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (S c ký mixen n đ ng) MS Mass Spectrometry (Kh i ph ) NMR Nuclear Magnetic Resonance (C ng h P Phân đo n PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PCRS Primary Chemical Reference Standard ng t h t nhân) (Ch t đ i chi u hóa h c s c p) PTN Phịng thí nghi m RSD Relative Standard Deviation ( Rs đ phân gi i gi a pic có th i gian l u nh l n h n k bên S Di n tích pic (µV x giây) s singlet ( SK S c ký đ SCRS Secondary Chemical Reference Standard l ch chu n t ng đ i) nh đ n) (Ch t đ i chi u hóa h c th c p) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chi t b ng ch t l ng siêu t i h n) SKLM S c ký l p m ng TCKN Tiêu chu n ki m nghi m TR Th i gian l u (phút) TM Th i gian di chuy n (phút) TNHC Trinh n hoàng cung TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhi t tr ng l TT Thu c th UV-Vis Ultraviolet-Visible (T ngo i kh ki n) VLC Vacuum Liquid Chromatography (S c ký c t chân khơng) ng) v DANH M C HÌNH NH Hình 1.1: Hình v TNHC Hình 1.2: Các c u trúc hóa h c c a alcaloid khung crinin Hình 1.3: C u trúc hóa h c alcaloid khung lycorin (A) khung tazettin (B) Hình 1.4: C u trúc hóa h c khung belladin (C) c u trúc khung galanthamin (D) Hình 1.5: C u trúc hóa h c khung lycorenin (E) c u trúc khung cheryllin (F) Hình 1.6: C u trúc hóa h c c a flavonoid chi Crinum Hình 1.7: C u trúc hóa h c h p ch t flavonoid TNHC 10 Hình 3.1: Hình c m hoa c a TNHC (Crinum latifolium L.) 41 Hình 3.2: Hình hoa Trinh n hồng cung (Crinum latifolium L.) 41 Hình 3.3: SK h p ch t phân l p t phân đo n alcaloid 49 Hình 3.4: SK h p ch t phân l p t phân đo n alcaloid AR flavonoid 49 Hình 3.5: C u trúc hóa h c d li u ph NMR (500 MHz, CDCl3) c a (2) 59 Hình 3.6: C u trúc hóa h c c a 6-ethoxyundulatin 59 Hình 3.7: SK xác đ nh đ tinh t c a C C crinamidin b ng HPLC 72 Hình 3.8: SK xác đ nh đ tinh t C C 6-hydroxycrinamidin HPLC 73 Hình 3.9: SK xác đ nh đ tinh t c a C C lycorin b ng HPLC 73 Hình 3.10: SK xác đ nh đ tinh t c a C C hippadin b ng HPLC 74 Hình 3.11: SK xác đ nh đ tinh t c a C C astragalin b ng HPLC 74 Hình 3.12: SK xác đ nh đ tinh t c a C C isoquercitrin b ng HPLC 75 Hình 3.13: Các SK th m đ nh tính đ c hi u quy trình đ nh l alcaloid TNHC b ng ph Hình 3.14: Các SK ng đ ng th i ng pháp HPLC 86 th m đ nh tính đ c hi u quy trình đ nh l astragalin isoquercitrin TNHC b ng ph ng đ ng th i ng pháp HPLC 90 Hình 3.15: Các n di đ th m đ nh tính đ c hi u c a quy trình đ nh l th i alcaloid TNHC b ng ph ng đ ng ng pháp CE 93 vi Hình 3.16: Các n di đ th m đ nh tính đ c hi u c a quy trình đ nh l th i astragalin isoquercitrin TNHC b ng ph ng đ ng ng pháp CE 96 Hình 3.17: S c ký đ DVT – SKLM alcaloid TNHC 98 Hình 3.18: S c ký đ DVT – SKLM flavonoid TNHC 99 Hình 4.1: SK alcaloid TNHC b ng HPLC, k thu t r a gi i isocratic 114 Hình 4.2: SK alcaloid TNHC b ng HPLC, k thu t r a gi i gradient 114 Hình 4.3: i n di đ so sánh m u th alcaloid phân tích b ng CZE MEKC 115 Hình 4.4: i n di đ m u th alcaloid pha methanol 116 Hình 4.5: i n di đ m u th alcaloid pha đ m dinatri tetraborat 25 mM 116 Hình 4.6: i n di đ m u th alcaloid pha dung d ch acid H3PO4 116 DANH M C S S đ 2.1 S đ kh o sát quy trình chi t ho t ch t t TNHC 29 S đ 2.2 S đ kh o sát chi t ho t ch t t TNHC k t h p hai ph ph ng pháp SFE ng pháp chi t ng m ki t v i c n 70% 32 S đ 3.1 S đ chi t cao c n, P alcaloid P flavonoid t TNHC 43 S đ 3.2 S đ chi t alcaloid flavonoid t r TNHC 43 S đ 3.3 S đ chi t alcaloid flavonoid b t k t h p hai ph ng pháp chi t 46 S đ 3.4 S đ phân l p h p ch t (2) (3) t P alcaloid AL-SFE 51 S đ 3.5 S đ chi t alcaloid AL-SA ho c flavonoid FL-SA 83 vii DANH M C CÁC B NG B ng 1.1: Alcaloid c a TNHC Crinum latifolium L 11 B ng 3.1: Hi u su t chi t (%) ho t ch t b ng ph ng pháp ng m ki t 42 B ng 3.2: K t qu kh o sát nh h ng th i gian lên hi u su t chi t 44 B ng 3.3: K t qu kh o sát nh h ng c a áp su t lên hi u su t chi t 45 B ng 3.4: K t qu tách phân đo n m u AL-SFE FL-NK b ng VLC 47 B ng 3.5: Các h p ch t tinh t phân l p đ c t cao chi t TNHC 48 B ng 3.6: K t qu phân l p alcaloid t phân đo n ALS1 49 B ng 3.7: K t qu tri n khai s c ký c t v i ch t h p ph pha đ o 50 B ng 3.8: K t qu phân l p (2) (3) t P n–hexan 50 B ng 3.9: K t qu phân l p (8), (9), (10) t P alcaloid AL-NK 52 B ng 3.10: D li u ph NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) c a h p ch t (2) 57 B ng 3.11: Các t ng tác proton ph COSY, HMBC c a h p ch t (2) 58 B ng 3.12: K t qu đ tinh t; hàm m b ng phân tích nhi t tr ng l B ng 3.13: Thành ph n pha đ ng b ng 70 c sóng phát hi n c a quy trình xác đ nh đ tinh t c a nguyên li u C C b ng ph ng pháp HPLC 71 B ng 3.14: K t qu kh o sát tính phù h p h th ng quy trình phân tích HPLC 71 B ng 3.15: K t qu xác đ nh đ tinh t s c ký (%) C C b ng HPLC 75 B ng 3.16: D li u ph UV-Vis, MS m ch y c a C C 76 B ng 3.17: D li u ph IR c a C C 76 B ng 3.18: K t qu đánh giá đ ng nh t lơ c a C C sau đóng gói 78 B ng 3.19: K t qu phân tích robust A c a C C crinamidin 80 B ng 3.20: K t qu phân tích robust A c a C C 6-hydroxycrinamidin 80 B ng 3.21: K t qu phân tích robust A c a C C hippadin 81 B ng 3.22: K t qu phân tích robust A c a C C lycorin 81 B ng 3.23: K t qu phân tích robust A c a C C astragalin 82 PL-40 PL-41 BOYTE V$N TP PL-42 DHYDuQ'c TpHCM HO cRt MINH Qui tdnh djnh hl'gng d5ng thai al aloid Khoa DU'Q'c B9 mon Ph an tfch Ki€m nghi~m ~M NGm.eMTIW6c (crinamidin, 6-hydroxycrinamid n~ga Y.' ~.Q:.2iiJ 6-hydroxypowellin,6-hydroxybuphanidrin, ul1dulatin va 6-hydroxyundulatin) hI Trinh 11fthoang cung b~ngs~c ky long hifU nang cao (HPLC) Ban hanh theo quyet ajnh so: 1P thcingg nam 2012 Qui trinh dinh IUQ1lgd6ng thai alcaloid (crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, 6hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin, 6-hydroxyundulatin) tir la Trinh nfr hoang cung (TNHC) b~ng phuong phap s~c ky long hi~u n[mg cao (HPLC): Cbi~t xu§t cao alcaloid tir hi TNHC: Can chinh xac khoi'mg 10 g bot duQ'cli~u cho van c&cco mo 250 ml, them c6n 70% Sieu am l~n (x50 ml/30 phut) (y nhi~t 50°C Dich chi~t c6n duQ'cloe;tite;tpva thu h6i dung moi d~n 1/3 th~ tich, ki€m hoa dich'chi~t b~ng dung dich amoniac 25% d~n pH khoi'mg9-1 O Chi~t v6i 20 ml cloroform (x l~n), ge;tnl~y lap cloroform GOp tOEmbOdich cloroform, thu h6i dung m6i d~n c~n (cao alcaloid toan ph~n) Qui trinh dinb hrQ1lgdAng thM alcaloid tir hi TNHC b~ng phuong phap HPLC: Dung djch a6i chiiu: pha dung dich d&ichi~u pha dong thee n6ng dOtuong (mg crinamidin: 100 (~g/ml) 6-hydroxycrinamidin: 100 (~g/ml) undulatin: 70 (~g/ml) 6-hydroxyundulatin: 200 (~g/ml) 6-hydroxybuphanidrin: 400 (~g/ml) 6-hydroxypowellin: 300 (~g/ml) Dung djch thie: toan bO cao alcaloid toan ph~n duQ'choa tan va di~n d~y b~ng pha dong binh dinh muc 10 ml LQc qua mang lQc0,45 ~m Dich lQcduQ'ctiem van h~ th&ngHPLC Pha a9ng: Dung moi A: methanol Dung moi B: acid phosphoric pH co 0,2 % TEA Di€u ki¢n sdc kf;: Cot Luna 5u C8 100R; 250 x 4,6 mm; ~m Bu6c song phM hi~n: 214 nm Th~ tich tiem: 10 ~l T&cdOdong: ml/phut NH m ~d.~ BOYT~ V¢N KI~M NG~M TP THUOC H6 em MINH PL-43 Chuang trinh dung moi -' -+-::- ,, -, ~~Thai gian % dungmoiA 20 20 25 25 20 20 Kit qua: Ham luqng (ppm) cua cac alcaloid duQ'c t1nh dva VaGdi~n t1ch pic tren s~c kY d6 cua m~u thu va m~u d6i chi€u theo duang tuy€n t1nh ho~c theo cong thuc sau: P(ppm) a tipl 100 xCx-x-x xlO Sc c 100 m 100-h S =_1 St: di~n t1ch pic cua m~u thu m: kh6i luqng bQt la (g) Sc: di~n tich pic cua ch&t d6i chiSu h: dQ frm tuang d6i cua m~u thu (%) Cc: n6ng dQ cua m~u d6i chi€u (mg/ml) a: dQ tinh khi€t cua m~u d6i chi€u (%) P (pprrF):ham luqng cu~ alcaloid tuang Ung dpl: dQ pha loang r$MTHUOC fMrnH VlDINH • TpHCM, 20 thang nam 2012 I Kh-oa £)~I HOC Y 0110C TrU'&ng I THANHPH6H6CHIM~ ,KHOA lJOtrJ· Nguy~n Hfru L~c Thuy " -··-PGS.tS.%dn ~ nOYT~ 1/ fp PL-44 ,,' "" - Df-IYDuQ'c TpHCM KhoaDuac Bo mon Phan'tich Ki~m nghi~m muoc HO em MINH lr:l':KllM NG~M -Qui t~inh-d!nh IUQ'ngd6ngthO'i alcr!OidIlj~i> 'c ~NH "