Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất flavonoid từ củ gấu biển (cyperus stoloniferus retz)

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa và điều kiện khí hậu thuận lợi đã tạo nên một hệ thực vật đa dạng, phong phú nói chung và nguồn dược liệu quý nói riêng. Trong đó, họ Cói có rất nhiều loài. Điển hình, trên thế giới, họ Cói (Cyperaceae) có 95 chi, 3800 loài 7, 11, 14, 23. Chi Cyperus là chi lớn nhất trong họ Cói có 300 loài, phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, họ Cói có 2730 chi, 301 loài ; chi Cyperus có 81 loài, phân bố khắp nơi trong cả nước từ vùng đồng bằng, ven biển, trung du cho đến miền núi, có nhiều ở những nơi đất ẩm thấp 3, 5, 9, 11, 59. Trong chi Cyperus, có nhiều loài được dùng làm thuốc; trong đó, cỏ gấu là một loài được sử dụng khá nhiều. Cây cỏ gấu (hay còn gọi là củ gấu, hương phụ, cỏ cú) là một loại cỏ sống lâu năm, mọc hoang ở khắp nơi trên đồng ruộng, ven đường, trên mương, bãi cỏ, bãi cát…. Chúng có thể sống cả trên đất nước lợ và nước mặn. Theo kinh nghiệm dân gian cũng như các tài liệu nghiên cứu, thân rễ của cây cỏ gấu được dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau như: chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, các bệnh của phụ nữ, viêm tử cung mạn tính, đau dạ dày, ăn không ngon, tiêu hóa kém, nôn mửa, cảm mạo,… 4, 9, 15, 56. Trên thị trường dược phẩm, có rất nhiều chế phẩm chứa thành phần hương phụ và đã được xếp vào danh mục thuốc thiết yếu năm 2005, được lưu hành rộng rãi trong cả nước như: Cảm xuyên hương, Cao hương ngải, Cao ích mẫu, Hoàn điều kinh, Cao ích mẫu. Đây là một trong những bài thuốc thiết yếu để điều trị các chứng bệnh của phụ nữ 5, 22. Những bài thuốc có thành phần “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển; do hương phụ biển có nhiều hơn, củ to hơn, thu hái dễ dàng hơn so với hương phụ vườn 4, 23. Theo một số tài liệu nghiên cứu về hai vị thuốc này cho thấy hương phụ biển được dùng làm thuốc với cùng công dụng như hương phụ vườn 15, 26.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGUYỄN THANH NHÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ FLAVONOID TỪ CỦ GẤU BIỂN (Cyperus stoloniferus Retz.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Hà Nội-2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NGUYỄN THANH NHÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ FLAVONOID TỪ CỦ GẤU BIỂN (Cyperus stoloniferus Retz.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Thanh Hiền TS. Nguyễn Tiến Đạt Nơi thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Hóa Sinh Biển-Viện Hàn lâm KH & CNVN HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên, các bạn đồng môn và gia đình. Nhờ sự giúp đỡ quý báu đó mà tôi có thể học tập và hoàn thành tốt khóa luận của mình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS. Đào Thị Thanh Hiền, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua, để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Tiến Đạt, cùng các cán bộ ở Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở. Tôi cũng xin gửi tới các thầy cô giáo trong ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội những lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình và bạn bè - những người đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận. Do thời gian có hạn nên khóa luận còn nhiều hạn chế, vì vậy tôi rất mong nhận được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Sinh viên Lê Nguyễn Thanh Nhàn MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………… 1 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Cyperus 1.1.1. Đặc điểm thực vật chung của chi Cyperus…………………………….3 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Cyperus………………………………….3 1.1.3. Tác dụng sinh học của chi Cyperus……………………………………5 1.2. Tổng quan về loài Cyperus stoloniferus Retz. 1.2.1. Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz……………………8 1.2.2. Đặc điểm thực vật của loài Cyperus stoloniferus Retz……………… 9 1.2.3. Phân bố và sinh thái………………………………………………… 10 1.2.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến……………………………………11 1.2.5. Tính vị, công năng và công dụng…………………………………… 12 1.2.6. Một số bài thuốc chứa củ gấu……………………………………… 12 1.2.7. Thành phần hóa học của loài Cyperus stoloniferus Retz…………… 14 1.2.8. Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus Retz……………….15 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị……………………………… 18 2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………….19 2.3. Phương pháp thực nghiệm 2.3.1. Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học……… 19 2.3.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 19 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất……….… 21 2.3.4. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa DPPH… 22 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học. …………23 3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất…………………………… 25 3.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được…… 28 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa …… …………………………….36 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận………………………………………………………… 39 4.2. Đề xuất……………………………………………………………… 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT br s Broad singlet 13 C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) CC Sắc ký cột (Column Chromatography) D Doublet Dd doublet of doublet DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancemnt by Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl GS. Giáo sư 1 H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) HR-ESI- MS Phổ khối lượng phân giải cao ( High Resolution Electron Spay Ionization Mass Spectroscopy) J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) PGS.TS Phó giáo sư tiến sĩ P/ư Phản ứng S Singlet δ (ppm) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TT Thuốc thử UV – Vis Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultra Violet-Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất chính của củ gấu biển Bảng 3.2 Số liệu phổ của chất CSE1 Bảng 3.3 Số liệu phổ của chất CR2 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cây cỏ gấu biển Hình 1.2 Củ gấu biển Hình 1.3 Hoa cỏ gấu biển Hình 2.1 Cột sắc kí Hình 2.2 Cơ chế quét gốc tự do DPPH Hình 3.1 Một số đặc điểm của bột hương phụ biển (Cyperus stoloniferus Retz.) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập và chiết xuất Hình 3.3 TLC của chất CSE1 Hình 3.4 TLC của chất CR2 Hình 3.5 Phổ 1 H-NMR của hợp chất CSE1 Hình 3.6 Phổ 13 C-NMR của hợp chất CSE1 Hình 3.7 Cấu trúc hóa học và một số tương tác HMBC chính của hợp chất CSE1 Hình 3.8 Phổ 1 H-NMR của hợp chất CR2 Hình 3.9 Phổ 13 C-NMR của hợp chất CR2 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chât CR2 Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện kết quả quét gốc tự do DPPH của dịch chiết và các chất phân lập từ củ gấu biển ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa và điều kiện khí hậu thuận lợi đã tạo nên một hệ thực vật đa dạng, phong phú nói chung và nguồn dược liệu quý nói riêng. Trong đó, họ Cói có rất nhiều loài. Điển hình, trên thế giới, họ Cói (Cyperaceae) có 95 chi, 3800 loài [7, 11, 14, 23]. Chi Cyperus là chi lớn nhất trong họ Cói có 300 loài, phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, họ Cói có 27-30 chi, 301 loài ; chi Cyperus có 81 loài, phân bố khắp nơi trong cả nước từ vùng đồng bằng, ven biển, trung du cho đến miền núi, có nhiều ở những nơi đất ẩm thấp [3, 5, 9, 11, 59]. Trong chi Cyperus, có nhiều loài được dùng làm thuốc; trong đó, cỏ gấu là một loài được sử dụng khá nhiều. Cây cỏ gấu (hay còn gọi là củ gấu, hương phụ, cỏ cú) là một loại cỏ sống lâu năm, mọc hoang ở khắp nơi trên đồng ruộng, ven đường, trên mương, bãi cỏ, bãi cát…. Chúng có thể sống cả trên đất nước lợ và nước mặn. Theo kinh nghiệm dân gian cũng như các tài liệu nghiên cứu, thân rễ của cây cỏ gấu được dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau như: chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, các bệnh của phụ nữ, viêm tử cung mạn tính, đau dạ dày, ăn không ngon, tiêu hóa kém, nôn mửa, cảm mạo,… [4, 9, 15, 56]. Trên thị trường dược phẩm, có rất nhiều chế phẩm chứa thành phần hương phụ và đã được xếp vào danh mục thuốc thiết yếu năm 2005, được lưu hành rộng rãi trong cả nước như: Cảm xuyên hương, Cao hương ngải, Cao ích mẫu, Hoàn điều kinh, Cao ích mẫu. Đây là một trong những bài thuốc thiết yếu để điều trị các chứng bệnh của phụ nữ [5, 22]. Những bài thuốc có thành phần “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển; do hương phụ biển có nhiều hơn, củ to hơn, thu hái dễ dàng hơn so với hương phụ vườn [4, 23]. Theo một số tài liệu nghiên cứu về hai vị thuốc này cho thấy hương phụ biển được dùng làm thuốc với cùng công dụng như hương phụ vườn [15, 26]. Về thành phần hóa học, theo một số nghiên cứu [19, 20, 26] đã xác định được trong củ gấu biển có chứa : tinh dầu, alkaloid, flavonoid, glycosid tim, tanin, saponin, acid hữu cơ, tinh bột….Tuy nhiên, đa phần chỉ nghiên cứu sâu về thành phần và tác dụng của tinh dầu, còn các thành phần khác chỉ mới nghiên cứu sơ bộ. Các nghiên cứu từ trước đến nay về flavonoid cho thấy rằng flavonoid là một nhóm các chất chống oxy hóa rất mạnh, góp phần quan trọng trong bảo vệ sức khỏe con người. Ví dụ, catechin là một flavonoid có nhiều trong trà xanh và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Theo F. Nanjo đã chứng minh được catechin trong trà xanh có khả năng thu dọn gốc tự do đến 50% trong khoảng nồng độ từ 1 - 3 µM [53, 63]. Vậy thành phần flavonoid trong củ gấu biển có hoạt tính chống oxy hóa không ? và khả năng chống oxy hóa như thế nào ? Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi xin tiến hành đề tài “ Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính chống oxy hóa của một số flavonoid từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) ” với các mục tiêu như sau: 1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất flavonoid từ củ gấu biển. 2. Thử hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất flavonoid phân lập được từ củ gấu biển. [...]... nóng từ từ đến khi hiện màu Kết quả: Xuất hiện một vết màu vàng cam, Rf = 0,537 Hình 3.2 TLC của chất CSE1 - Hợp chất CR2: Hệ dung môi: Cloroform-Methanol-Nước (5:1:0,1) Thuốc thử: H2SO4 10%, đốt nóng từ từ đến khi hiện màu Kết quả: Xuất hiện một vết màu vàng cam đậm, Rf = 0,205 Hình 3.3 TLC của chất CR2 Kết luận: Từ 47g cặn etyl acetat của củ gấu biển đã phân lập được 2 chất sạch là CSE1 (10mg) và CR2... (5,95%); caryophylen oxyd (3,68%) Theo R D Allan và cộng sự [58] tại Australia đã xác định trong thân rễ củ gấu biển có các chất quinon là cyperaquinon và hydroxyperaquinon 1.2.8 Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus RetZ - Tác dụng gây độc của tinh dầu: Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Văn Điền [26], tinh dầu có khả năng gây độc trên chuột nhắt trắng, liều LD50 của tinh dầu củ gấu biển là 12,1ml/kg... hoạt tính chống oxy hoá của các dịch chiết và chất sạch phân lập được: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH 2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học - Kiểm nghiệm bột dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi - Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo tài liệu [1,13] 2.3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất. .. cung bình thường, cao củ gấu đều có tác dụng ức chế So sánh với đương quy, tác dụng ức chế co bóp tử cung của củ gấu yếu hơn Thành phần tinh dầu chiết từ củ gấu có tác dụng kiểu estrogen, nhưng không mạnh [23] Theo nghiên cứu của Vũ Văn Điền, nước sắc của củ gấu biển có tác dụng giãn cơ tử cung cô lập trên chuột ở liều 0,5-2%; trên thỏ có chửa ở liều 5-6%; giãn cơ tử cung tại chỗ của thỏ ở liều 4-6g/kg... etyl acetat của củ gấu biển đã phân lập được 2 chất sạch là CSE1 (10mg) và CR2 (50mg) 3.3 Xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được xác định dựa vào phân tích các dữ liệu phổ gồm phổ MS và phổ NMR 3.3.1 Hợp chất CSE1 Bảng 3.2 Số liệu phổ của chất CSE1 1 δCa δCa,b DEPT δHa,c mult (J= Hz) HMBC 2 80,5 80,4 CH 5,28 dd (3,0; 12,5) 4, 1', 2', 6' 3 44,1... dụng chống oxy hóa: Theo C H Lee và cộng sự [35] thì dịch chiết nước từ thân rễ củ gấu có vai trò chống thoái hóa thần kinh nhờ tác dụng chống oxy hóa và dọn các gốc tự do bằng mô hình dùng 6-hydroxydopamine gây bệnh Parkinson ở chuột, với liều 50 và 100 mg/kg - Tác dụng trên cơ trơn: Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc”, cao lỏng củ gấu 5%, thí nghiệm trên tử cung cô lập chuột lang, thỏ, mèo và chó... kháng khuẩn, chống oxy hóa, bảo vệ gan, an thần, chống co giật, chống tiêu chảy, hạ đường huyết, chống sốt rét, chống kết tập tiểu cầu, chống dị ứng 1.2 Tổng quan về loài Cyperus stoloniferus Retz 1.2.1 Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz Theo các tài liệu [4, 25, 33] cây cỏ gấu có: Tên khác: Cỏ cú, cú chồi, cú biển, cỏ biển, hương phụ biển, hải dương phụ Tên khoa học: Cyperus stoloniferus. .. pháp hiển vi của PGS.TS Nguyễn Viết Thân [2, 14] 3.1.2 Định tính một số nhóm chất trong dược liệu bằng phương pháp hóa học Tiến hành định tính mẫu nghiên cứu các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 sau: Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính của củ gấu biển TT Nhóm chất P/ư định tính Kết quả Kết luận P/ư với TT Mayer Tanin P/ư với kiềm... 25mg/ml) và bảo vệ chống lại các tác nhân oxy hóa khử như H2O2/ UV Theo G M Rukunga và cộng sự [41] hai sesquiterpene là corymbolone và mustakone, được phân lập từ dịch chiết chloroform của thân rễ Cyperus articulatus có hoạt tính chống Plasmodia Trong đó, mustakone có hoạt lực mạnh hơn corymbolone khoảng 10 lần đối với chủng Plasmodium falciparum Theo C Thebtaranonth và cộng sự [37] các chất được phân lập. .. Hải, Thái Bình vào tháng 05/2011, được giám định bởi PGS.TS Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.1.2 Hóa chất và thiết bị  Hóa chất: Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn của DĐVN IV  Thiết . Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính chống oxy hóa của một số flavonoid từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) ” với các mục tiêu như sau: 1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của. xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất flavonoid từ củ gấu biển. 2. Thử hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất flavonoid phân lập được từ củ gấu biển. Chương. NỘI LÊ NGUYỄN THANH NHÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ FLAVONOID TỪ CỦ GẤU BIỂN (Cyperus stoloniferus Retz.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ