Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất flavonoid từ củ gấu biển (cyperus stoloniferus retz)

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa và điều kiện khí hậu thuận lợi đã tạo nên một hệ thực vật đa dạng, phong phú nói chung và nguồn dược liệu quý nói riêng. Trong đó, họ Cói có rất nhiều loài. Điển hình, trên thế giới, họ Cói (Cyperaceae) có 95 chi, 3800 loài 7, 11, 14, 23. Chi Cyperus là chi lớn nhất trong họ Cói có 300 loài, phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, họ Cói có 2730 chi, 301 loài ; chi Cyperus có 81 loài, phân bố khắp nơi trong cả nước từ vùng đồng bằng, ven biển, trung du cho đến miền núi, có nhiều ở những nơi đất ẩm thấp 3, 5, 9, 11, 59. Trong chi Cyperus, có nhiều loài được dùng làm thuốc; trong đó, cỏ gấu là một loài được sử dụng khá nhiều. Cây cỏ gấu (hay còn gọi là củ gấu, hương phụ, cỏ cú) là một loại cỏ sống lâu năm, mọc hoang ở khắp nơi trên đồng ruộng, ven đường, trên mương, bãi cỏ, bãi cát…. Chúng có thể sống cả trên đất nước lợ và nước mặn. Theo kinh nghiệm dân gian cũng như các tài liệu nghiên cứu, thân rễ của cây cỏ gấu được dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau như: chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, các bệnh của phụ nữ, viêm tử cung mạn tính, đau dạ dày, ăn không ngon, tiêu hóa kém, nôn mửa, cảm mạo,… 4, 9, 15, 56. Trên thị trường dược phẩm, có rất nhiều chế phẩm chứa thành phần hương phụ và đã được xếp vào danh mục thuốc thiết yếu năm 2005, được lưu hành rộng rãi trong cả nước như: Cảm xuyên hương, Cao hương ngải, Cao ích mẫu, Hoàn điều kinh, Cao ích mẫu. Đây là một trong những bài thuốc thiết yếu để điều trị các chứng bệnh của phụ nữ 5, 22. Những bài thuốc có thành phần “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển; do hương phụ biển có nhiều hơn, củ to hơn, thu hái dễ dàng hơn so với hương phụ vườn 4, 23. Theo một số tài liệu nghiên cứu về hai vị thuốc này cho thấy hương phụ biển được dùng làm thuốc với cùng công dụng như hương phụ vườn 15, 26.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ NGUYỄN THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

CỦA MỘT SỐ FLAVONOID

TỪ CỦ GẤU BIỂN

(Cyperus stoloniferus Retz.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Hà Nội-2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ NGUYỄN THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ

THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

CỦA MỘT SỐ FLAVONOID

TỪ CỦ GẤU BIỂN

(Cyperus stoloniferus Retz.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: TS Đào Thị Thanh Hiền

TS Nguyễn Tiến Đạt Nơi thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Hóa Sinh Biển-Viện Hàn lâm KH & CNVN

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên, các bạn đồng môn

và gia đình Nhờ sự giúp đỡ quý báu đó mà tôi có thể học tập và hoàn thành tốt khóa luận của mình

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

đến: TS Đào Thị Thanh Hiền, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian qua, để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Tiến Đạt, cùng các cán bộ ở

Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở

Tôi cũng xin gửi tới các thầy cô giáo trong ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, cùng toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội những lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt năm năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình và bạn bè những người đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận

-Do thời gian có hạn nên khóa luận còn nhiều hạn chế, vì vậy tôi rất mong nhận được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Lê Nguyễn Thanh Nhàn

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Cyperus 1.1.1 Đặc điểm thực vật chung của chi Cyperus……….3

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Cyperus……….3

1.1.3 Tác dụng sinh học của chi Cyperus………5

1.2 Tổng quan về loài Cyperus stoloniferus Retz 1.2.1 Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz………8

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Cyperus stoloniferus Retz……… 9

1.2.3 Phân bố và sinh thái……… 10

1.2.4 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến………11

1.2.5 Tính vị, công năng và công dụng……… 12

1.2.6 Một số bài thuốc chứa củ gấu……… 12

1.2.7 Thành phần hóa học của loài Cyperus stoloniferus Retz……… 14

1.2.8 Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus Retz……….15

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị……… 18

2.2 Nội dung nghiên cứu……….19

2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học……… 19

2.3.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 19

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất……….… 21

2.3.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa DPPH… 22

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học …………23

3.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất……… 25 3.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được…… 28 3.4 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa …… ……….36

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 Kết luận……… 39 4.2 Đề xuất……… 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (Carbon-13 Nuclear

Magnetic Resonance Spectroscopy)

DEPT Distortionless Enhancemnt by Polarisation Transfer

Ionization Mass Spectroscopy)

PGS.TS Phó giáo sư tiến sĩ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất chính của củ gấu biển Bảng 3.2 Số liệu phổ của chất CSE1

Bảng 3.3 Số liệu phổ của chất CR2

Hình 3.9 Phổ 13C-NMR của hợp chất CR2

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chât CR2

Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện kết quả quét gốc tự do DPPH của dịch chiết

và các chất phân lập từ củ gấu biển

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa và điều kiện khí hậu thuận lợi đã tạo nên một hệ thực vật đa dạng, phong phú nói chung và nguồn dược liệu quý nói riêng Trong đó, họ Cói có rất nhiều loài Điển hình, trên thế giới, họ Cói (Cyperaceae) có 95 chi, 3800 loài [7, 11, 14, 23] Chi

Cyperus là chi lớn nhất trong họ Cói có 300 loài, phân bố rộng rãi ở khắp nơi

trên thế giới Ở Việt Nam, họ Cói có 27-30 chi, 301 loài ; chi Cyperus có 81

loài, phân bố khắp nơi trong cả nước từ vùng đồng bằng, ven biển, trung du cho đến miền núi, có nhiều ở những nơi đất ẩm thấp [3, 5, 9, 11, 59] Trong

chi Cyperus, có nhiều loài được dùng làm thuốc; trong đó, cỏ gấu là một loài

Trên thị trường dược phẩm, có rất nhiều chế phẩm chứa thành phần hương phụ và đã được xếp vào danh mục thuốc thiết yếu năm 2005, được lưu hành rộng rãi trong cả nước như: Cảm xuyên hương, Cao hương ngải, Cao ích mẫu, Hoàn điều kinh, Cao ích mẫu Đây là một trong những bài thuốc thiết yếu để điều trị các chứng bệnh của phụ nữ [5, 22] Những bài thuốc có thành phần “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển; do hương phụ biển có nhiều hơn, củ to hơn, thu hái dễ dàng hơn so với hương phụ vườn [4, 23] Theo một số tài liệu nghiên cứu về hai vị thuốc này cho thấy hương phụ biển được dùng làm thuốc với cùng công dụng như hương phụ vườn [15, 26]

Về thành phần hóa học, theo một số nghiên cứu [19, 20, 26] đã xác định được trong củ gấu biển có chứa : tinh dầu, alkaloid, flavonoid, glycosid tim, tanin, saponin, acid hữu cơ, tinh bột….Tuy nhiên, đa phần chỉ nghiên cứu sâu

về thành phần và tác dụng của tinh dầu, còn các thành phần khác chỉ mới nghiên cứu sơ bộ Các nghiên cứu từ trước đến nay về flavonoid cho thấy rằng flavonoid là một nhóm các chất chống oxy hóa rất mạnh, góp phần quan trọng trong bảo vệ sức khỏe con người Ví dụ, catechin là một flavonoid có nhiều trong trà xanh và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Theo F Nanjo đã chứng minh được catechin trong trà xanh có khả năng thu dọn gốc tự do đến 50% trong khoảng nồng độ từ 1 - 3 µM[53, 63] Vậy thành phần flavonoid trong củ gấu biển có hoạt tính chống oxy hóa không ? và khả năng chống oxy hóa như thế nào ? Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi xin tiến hành đề tài

“ Nghiên cứu phân lập và thử hoạt tính chống oxy hóa của một số

flavonoid từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) ” với các mục tiêu

Chương I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Cyperus

1.1.1 Đặc điểm thực vật chung của chi Cyperus

Trên thế giới, họ Cói (Cyperaceae) có 95 chi, 3800 loài Trong đó, chi

Cyperus là chi lớn nhất có 300 loài, phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới

Ở Việt Nam, họ Cói có 27-30 chi, 301 loài, chi Cyperus có 81 loài; phân bố

khắp nơi trong cả nước từ vùng đồng bằng, ven biển, trung du cho đến miền núi, có nhiều ở những nơi đất ẩm thấp [3, 5, 9, 11, 59]

Chi Cyperus là chi lớn nhất trong họ Cói có nhiều đặc điểm điển hình

của họ :

- Cây thảo sống hàng năm, có thân ngầm ở dưới đất mọc lên thân khí sinh, thân có thiết diện 3 cạnh

- Lá : hình giải có bẹ ôm lấy thân

- Hoa : bông nhỏ có tiết diện dẹp, nhiều vảy, sắp xếp thành 2 hàng; cụm hoa hình tán ; quả có tiết diện 3 cạnh ; nhụy chẻ 3 Đây là những đặc điểm để

phân biệt với các chi khác [7, 11, 16] Trong chi Cyperus, có nhiều loài được

dùng làm thuốc; trong đó, hương phụ vườn thường được sử dụng nhiều hơn Tuy nhiên, gần đây nhiều nơi đã dùng hương phụ biển với công dụng như hương phụ vườn

1.1.2 Thành phần hoá học của chi Cyperus

Một cuộc khảo sát của 170 loài thuộc 35 chi [32], cho thấy chi Cyperus

có:

- Aurone đã được tìm thấy trong lá của 25% mẫu và trong các chùm hoa

là 40%

- Sulphuretin đã được tìm thấy lần đầu tiên trong Carex appressa

- Flavon như tricin, luteolin và các methyl este (luteolin-5-methylete, luteolin-7-methyl ete, diosmetin, acacetin)

- Flavonol như myricetin ; flavone-C-glycosid

- Các carexidin-3-desoxyanthocyanidin đã được tìm thấy trong các cụm hoa của 8 loài

J B Harborne đã khảo sát lá của 62 loài thuộc 11 chi của họ Cyperaceae [48] thấy chứa tricin, luteolin, quercetin, kaempferol và các glycoflavones như tricin - 5 - glucoside, luteolin - 7 - arabinosylglucoside, quercetin - 3 - rutinoside

J B Harborne và cộng sự đã nghiên cứu 92 loài thuộc chi Cyperus ở

Úc [58] và xác định được:

- Trong lá chứa luteolin - 5 - methylete, quercetin - 3 - monomethylete, ete 7 - dimethyl của kaempferol và quercetin; 3, 7, ether - trimethyl của quercetin; tricin, luteolin và quercetin ở dạng glycoside

- Trong chùm hoa luteolin - 5 - methylete dường như được thay thế bằng

7, 3’, 4’ - trihydroxyflavone

Theo một số tác giả ở Ai Cập [29], ngoài luteolin và 7 - methyl ete của

nó, ở loài Cyperus conglomerates còn xuất hiện hai prenylflavan mới là 7, 3’ -

dihydroxy - 5, 5’- dimetoxy - 8 - prenylflavan và 5, 7, 3’ - trihydroxy - 5’ –methoxy - 8 - prenylflavan Các cấu trúc được xác định dựa trên phân tích phổ CIMS, 1H-NMR, 13C-NMR, H-H COSY, HMBC và DEPT

Z Zhou và W Yin [67] đã xác định được hai hợp chất mới, 1α - methoxy - 3 β - hydroxy - 4α - (3’, 4’ - dihydroxyphenyl) - 1, 2, 3, 4 - tetrahydronaphthalin và 1α, 3β - dihydroxy - 4α - (3’,4’- dihydroxyphenyl) -

1, 2, 3, 4 - tetrahydronaphthalin từ thân rễ Cyperus rotundus Các cấu trúc

được xác định dựa trên phổ NMR, UV, IR và MS

Năm 1993, một số tác giả [38] đã phân lập được coumarin từ Cyperus

incomplestus là umbeliferon, scopoletin; 5, 7 và 7, 8 - dimethoxycoumarin; 5,

7, 8 - trimethoxycoumarin, leptodaitilon, prenyletin; 5, 7 - dimethoxy - 8 - ( γ, γ’ - dimethyl - allyloxy) coumarin và 7 - (γ, γ’- dimethy - allyloxy) - 8 -methoxycoumarin

Theo V S Rakotonirina và cộng sự [64], bằng các phản ứng hóa học

của dịch chiết tổng cho thấy C.articulatus chứa flavonoid, saponin, tannin,

tecpen và đường

B N Emelugo và cộng sự [34] đã phân tích và tìm ra các thành phần alkaloid, glycoside, flavonoid, tannin, terpenoid, steroid, saponin trong dịch

chiết ether dầu hỏa của C rotundus

H M Sayed và cộng sự [46] đã phân lập và xác định được thành phần

fructose - amino acid trong C rotundus L bao gồm: N - (1 - deoxy - alpha - D

- fructos - 1- yl) - L - tryptophan (16) và đồng phân tautomers, n - butyl - beta

- D - fructopyranoside (1), ethyl - alpha - D - glucopyranoside (2), adenosine (3), (-) - (E) - caffeoylmalic axit (4), vitexin ( 5), isovitexin (6), orientin (7), epiorientin (8), myricetin 3 - O - beta - D - galactopyranoside (9), luteolin 7 -

O - beta - D - glucuronopyranoside - 6'' - methyl ester (10), axit chlorogenic (11), luteolin 4' - O - beta - D - glucuronopyranoside (12), luteolin 7 - O - beta

- D - glucuronopyranoside (13), uridine (14) và acid ellagic (15)

M R Seabra và cộng sự [52] đã phân lập được một aurone từ Cyperus

capitatus là 6, 3’, 4’ - trihydroxy - 4 - methoxy - 5 - methylaurone

Theo M Masanori và cộng sự [50] đã xác định được thành phần coumaran, remirol, furoquinones, cyperaquinone và scabequinone từ thân rễ

loài Cyperus nipponicus và Cyperus distans

Theo El - Habashy và cộng sự ở Ai Cập [39] nghiên cứu trên lá của 20

loài Cyperus có chứa flavonoid, đã xác định được glycosid apigenin, lutiolin,

tricin và quercetin

1.1.3 Tác dụng sinh học của chi Cyperus

Theo Trương Phát Sơ, Trương Diệu Đức và Lưu Thiệu Quang (1935), cao lỏng hương phụ 5% có khả năng ức chế sự co bóp của tử cung, làm dịu sự căng thẳng của tử cung động vật Năm 1959, một số tác giả ở Quý Dương y

học viện (Trung Quốc) đã chứng minh tác dụng giảm đau trên chuột nhắt trắng [4]

Theo N Prakas và B Ragavan [54], các dịch chiết khác nhau của

Cyperus esculentus L như acetone, ethanol 50%, chloroform, ether dầu hỏa

có hoạt tính kháng khuẩn với một số chủng vi khuẩn như Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Salmonella sp, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa và Citrobabacter freundii, bằng cách sử

dụng phương pháp khuếch tán đĩa Dịch chiết aceton cho thấy hoạt động ức

chế mạnh nhất với S aureus, K pneumoniae và P vulgaris Dịch chiết ethanol 50% ức chế mạnh nhất với E coli, S aureus và Salmonella sp Dịch chiết chloroform ức chế mạnh nhất sự tăng trưởng của S aureus, trong khi đó dịch ether dầu hỏa cho kết quả tích cực đối với Salmonella sp Tất cả các dịch chiết rất nhạy cảm với C freundii

Theo V S Rakotonirina và cộng sự [64] dịch chiết tổng từ thân rễ của

C articulatus dường như không có tác dụng gây mê hoặc gây tê Tuy nhiên,

khi so sánh với diazepam, C articulatus dường như không có tác dụng giãn

cơ Khi kết hợp với natri thiopental hoặc diazepam, dịch chiết tổng gây cảm giác ngủ và tăng thời gian ngủ mà không có tác dụng giảm đau đồng thời Các

nghiên cứu cho thấy thân rễ của C articulatus có tính chất dược lí tương tự

như các thuốc an thần

Theo H G Anwar và H J Khalid [44] dịch chiết nước - methanol của

C scariosus có tác dụng bảo vệ gan với liều 500mg/kg Thí nghiệm được tiến

hành trên chuột, gây tổn thương gan bằng acetaminophen và CCl4

Theo E Ngo Bum và cộng sự [40] dịch chiết methanol từ thân rễ của

Cyperus articulatus có hoạt tính chống co giật ở chuột Liều ED50 để bảo vệ chống co giật là 306 (154 - 541) mg/kg cho các thử nghiệm tiêm màng bụng pentylenetetrazol (gây ra cơn động kinh) và 1005 (797 - 1200) mg/kg cho gây sốc bằng điện

Theo S Kilani và cộng sự [61] dịch chiết ethyl acetate và các flavonoid

của C rotundus có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế enzyme xanthine oxidase

với giá trị IC50 là 185 và 240 mg/ml; ức chế superoxide anion với IC50 là 150

và 215 mg/ml Ngoài ra, các tác giả còn đánh giá hoạt tính sinh học của catechin, acid ferulic và luteolin Kết quả cho thấy, luteolin có tác dụng mạnh nhất trên việc giảm sản xuất acid thiobarbituric (MDA=1,5nm), ức chế đáng

kể sự gia tăng của các tế bào K562 (IC50 = 25mg/ml) và bảo vệ chống lại các tác nhân oxy hóa khử như H2O2/ UV

Theo G M Rukunga và cộng sự [41] hai sesquiterpene là corymbolone

và mustakone, được phân lập từ dịch chiết chloroform của thân rễ Cyperus

articulatus có hoạt tính chống Plasmodia Trong đó, mustakone có hoạt lực

mạnh hơn corymbolone khoảng 10 lần đối với chủng Plasmodium falciparum

Theo C Thebtaranonth và cộng sự [37] các chất được phân lập từ thân

rễ Cyperus rotundus là patchoulenone, caryophyllene α oxit, 10, 12

-peroxycalamenene và 4, 7 - dimethyl - 1- tetralone có hoạt tính chống sốt rét với EC50 = 10-4 - 10-6 M Endoperoxide và 10, 12 - peroxycalamene có tác dụng mạnh nhất tại EC50 = 2.33 x 10-6 M

Theo J S Eun và cộng sự [49] dịch chiết ethanol của C rotundus có

tác dụng chống kết tập tiểu cầu và phụ thuộc vào nồng độ collagen, thrombin

và acid arachidonic Trong tám hợp chất của C rotundus, (+)-nootkatone có

tác dụng ức chế mạnh nhất trên collagen, thrombin và acid arachidonic

A R Nishikant và cộng sự [30] đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của

C rotundus trên alloxan gây tăng đường huyết ở chuột Kết quả cho chuột

uống 500mg/kg dịch chiết (một lần một ngày, trong 7 ngày liên tiếp) làm giảm đáng kể lượng đường trong máu

Theo S J Uddinvà cộng sự [60] dịch chiết methanol và ether dầu hỏa

của thân rễ C rotundus, dùng đường uống với liều 250 và 500 mg/kg thể

trọng, cho thấy có tác dụng chống tiêu chảy rõ rệt trên mô hình chuột gây tiêu chảy bằng dầu thầu dầu Phần dịch chiết ethyl acetate không có tác dụng này Theo H Bae và cộng sự [42] đã nghiên cứu về phát triển dòng Th1/Th2

in vitro từ các tế bào lympho T thu được từ lá lách của chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nước của củ gấu tăng cường phát triển dòng Th1 (tế bào hỗ trợ) bằng cách tăng tiết cytokine Th1 và làm giảm phát triển dòng Th2 bằng cách ức chế sản xuất cytokin Th2 Vì vậy, dịch chiết củ gấu có thể ngăn ngừa dị ứng hoặc cải thiện các triệu chứng dị ứng

Như vậy, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lí

của chi Cyperus bao gồm một số tác dụng như: giãn cơ trơn, giảm đau, kháng

khuẩn, chống oxy hóa, bảo vệ gan, an thần, chống co giật, chống tiêu chảy, hạ đường huyết, chống sốt rét, chống kết tập tiểu cầu, chống dị ứng

1.2 Tổng quan về loài Cyperus stoloniferus Retz

1.2.1 Vị trí phân loại của loài Cyperus stoloniferus Retz

Theo các tài liệu [4, 25, 33] cây cỏ gấu có:

Tên khác: Cỏ cú, cú chồi, cú biển, cỏ biển, hương phụ biển, hải dương phụ

Tên khoa học: Cyperus stoloniferus Retz

Tên đồng nghĩa:

Cyperus arenarius Hance ex C.B.Clarke, nom Illeg

Cyperus bulbosostoloniferus Steud

Cyperus conjunctus Steud

Cây cỏ sống dai, cao 15-30cm Thân rễ nằm bò dưới mặt đất, từng đoạn phình thành củ hình trứng, từ củ mọc lên thân khí sinh.Thân nhẵn, hình 3 cạnh Lá rộng 2-3mm, gốc có bẹ ôm thân, đầu lá thuôn nhọn, gân chính rõ, cứng và bóng

Cụm hoa ở đỉnh, phân nhánh nhiều thành những bông xếp dạng ngù, bông kép hay cờ không đều, mỗi bông có trục nhẵn mang 3-20 bông nhỏ, các bông nhỏ gồm nhiều hoa, trục bông nhỏ có cánh, mỗi hoa mọc ở kẽ một lá

Hình 1.2 Củ gấu biển Hình 1.1 Cây cỏ gấu biển

Hình 1.3 Hoa của cỏ gấu biển

bắc còn gọi là vảy, các vảy có màu nâu đỏ xếp thành dãy ở trên trục, hình trái xoan tù, hoa không có đài và tràng, nhị 3, bao phấn hình dải thuôn; bầu thượng, có một ô, một noãn, vòi nhụy hình chỉ, đầu nhụy dài và chẻ 3

Quả bế có 3 cạnh, màu đen nhạt chứa 1 hạt

Mùa hoa quả: tháng 3-7 [4, 23]

1.2.3 Phân bố và sinh thái

Cỏ gấu phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Âu, châu Á, châu Mỹ, châu Phi và châu Đại Dương Tuy nhiên cỏ gấu biển chỉ có ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Đại Dương (Úc, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonexia, Malaysia, Pakistan, Thái Lan, Việt Nam, Madagascar, quần đảo Ấn Độ Dương, đảo Thái Bình Dương) [55, 59, 66] Ở Việt Nam, cỏ gấu có mặt ở khắp nơi, trừ vùng núi cao trên 2000m, cỏ gấu biển mọc tập trung trên các bãi cát, đất pha cát ven biển từ Móng Cái đến Hà Tiên, ở các đảo và quần đảo như Cát Bà, Hòn Mê, Hòn Khoai, Phú Quốc, Côn Đảo, Trường Sa…[23]

Cả hai loài cỏ gấu đều có thể sống được trên mọi loại đất Cỏ gấu biển

ưa ánh sáng, có khả năng chịu hạn và chịu mặn tốt

Vị thuốc có tên “hương phụ” ở Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ thân rễ loài cỏ gấu biển Hàng năm, các vùng ven biển từ Thanh Hóa trở vào

có khả năng cung cấp từ 50-100 tấn loại dược liệu này cho nhu cầu sử dụng

trong nước và xuất khẩu

1.2.4 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến

Bộ phận dùng: thân rễ phơi khô (Rhizoma cyperi)

Thân rễ thường được thu hái vào mùa xuân, nhưng đào về mùa thu củ chắc và tốt hơn Sau khi thu hái, vun củ thành đống để đốt, lá và rễ con sẽ cháy hết, lấy những củ còn lại phơi hay sấy khô Ở Trung Quốc, có khi người

ta lấy củ nấu qua với nước sôi hoặc đồ rồi mới phơi hay sấy [43]

Mô tả dược liệu: Thân rễ hình thoi, thể chất chắc; dài 1-5cm; đường kính 0,5-1,5cm Mặt ngoài màu nâu hay nâu sẫm; có nhiều nếp nhăn dọc và đốt ngang (mỗi đốt cách nhau 0,1-0,6cm); trên mỗi đốt có lông cứng mọc nghiêng theo chiều dọc, về phía đầu củ, màu nâu hay nâu sẫm và có nhiều vết tích của rễ con Vết bẻ có sợi bóng nhoáng Cắt ngang thấy rõ phần vỏ màu hồng nhạt, trụ giữa màu nâu sẫm Mùi thơm, vị hơi đắng ngọt, sau đó có vị cay [2, 4, 23]

Theo y học cổ truyền, trước khi sử dụng, củ gấu cần được chế biến Có thể chế biến theo lối tứ chế (tẩm sao lần lượt bằng 4 phụ liệu khác nhau) hoặc thất chế (tẩm sao bằng 7 phụ liệu khác nhau) Tuy nhiên, phương pháp tứ chế được dùng phổ biến hơn Phương pháp thất chế tốt hơn nhưng do chế biến phức tạp, nên ít được dùng

Cách làm hương phụ tứ chế: Loại bỏ hết rễ con và tạp chất, rửa sạch, phơi ráo nước, rồi chia đều làm 4 phần Tẩm 1 phần bằng nước muối 5%, một phần bằng nước gừng 5%, một phần bằng giấm và một phần bằng rượu 35-

400 Tẩm vừa đủ ướt, ủ riêng mỗi phần trong 12 giờ, rồi sao vàng Khi dùng,

để riêng từng phần hoặc trộn lẫn 4 phần với nhau tùy theo cách chữa bệnh (củ gấu đã chế biến mang tên hương phụ) [4]

Tuy nhiên, theo GS.TS Đỗ Tất Lợi, củ gấu không chế biến gì cả tác dụng vẫn rất tốt

1.2.5 Tính vị, công năng và công dụng

Củ gấu là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong y học cổ truyền, trong dân gian có câu: “nam bất thiểu trần bì, nữ bất ly hương phụ” có nghĩa

là chữa bệnh cho nam giới không thể thiếu trần bì và chữa bệnh cho nữ giới không thể thiếu hương phụ

Theo đông y, củ gấu có vị cay, hơi đắng, tính bình, quy vào các kinh can, tam tiêu Có tác dụng lý khí, giải uất, kiện vị tiêu thực, thư can, điều kinh, chỉ thống chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, viêm tử cung

mạn tính, băng lậu đới hạ, chữa can vị bất hòa, đau dạ dày, ăn không ngon, tiêu hóa kém, nôn mửa

Vị củ gấu qua các phương pháp sao tẩm khác nhau, có tính năng công dụng không giống nhau Củ gấu sống (chưa qua chế biến) có tác dụng giải cảm, thông khí trừ đờm Củ gấu sao đen có tác dụng cầm máu dùng trong trường hợp rong kinh Củ gấu tẩm nước muối sao chữa bệnh về huyết; tẩm đồng tiện (nước tiểu trẻ em) sao, có tác dụng giáng hỏa trong chứng bốc nóng; tẩm giấm sao, có tác dụng tiêu tích tụ chữa các trường hợp huyết ứ, u báng; tẩm rượu sao có tác dụng tiêu đờm Hương phụ tứ chế (tẩm muối, đồng tiện, giấm, rượu) được dùng chữa các chứng bệnh phụ nữ

Liều dùng hàng ngày: 6-12g dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột, thuốc cao hoặc thuốc viên Thường dùng phối hợp với các vị thuốc khác [4, 23]

1.2.6 Một số bài thuốc chứa củ gấu

Sau đây là một số bài thuốc có chứa thành phần củ gấu [5, 6, 8, 10, 17,

18, 21]:

Chữa kinh nguyệt không đều, đau bụng khi hành kinh, huyết áp cao: Củ

gấu 3g, ích mẫu 3g, ngải cứu 3g, bạch đồng nữ 3g Sắc với nước, chia làm 3 lần uống trong ngày Muốn cho kinh nguyệt đều, uống đón kinh 10 ngày

trước ngày dự đoán có kinh (thuốc hương ngải)

Chữa kinh nguyệt không đều, kinh đến muộn, bụng dưới tức đau, lúc

hành kinh có máu cục tím: Củ gấu 5g, đương quy 10g, thược dược 10g, xuyên

khung 5g, ô dược 7g, ngải diệp 3g Sắc nước uống

Chữa hành kinh đau bụng: Hương phụ sao 160g, duyên hồng 80g, phục linh chích thảo 40g Đem tán nhỏ, mỗi lần lấy 8g hòa vào nước sôi uống (phụ

nhân lương phương)

Chữa băng huyết, rong huyết: Củ gấu sao đen, tán bột, mỗi lần uống 6g, ngày 2 lần Nếu có kèm theo mê man, gia thêm bẹ móc đốt thành than tán bột uống với nước cơm

Chữa kinh nguyệt không đều do huyết nhiệt, kinh thường thấy trước kỳ, lượng huyết nhiều màu sẫm, mùi hôi, đại tiện táo, tiểu tiện đỏ: Củ gấu (tứ chế) 12g, cỏ nhọ nồi 30g, sinh địa 16g, cỏ roi ngựa 25g, ích mẫu 16g, rau má tươi 30g, ngưu tất 12g Sắc nước uống ngày 1 thang

Chữa dạ dày lạnh đau, nôn, ợ ra nước trong: Củ gấu 5g, can khương 3g, mộc hương 3g, khương bán hạ 10g Sắc nước uống

Chữa hội chứng dạ dày:

- Củ gấu 6g, sài hồ 12g, thanh bì 8g, rau má 12g, chỉ xác 6g, trần bì 6g Sắc nước, chia làm 3 lần, uống trước bữa ăn, vào sáng trưa chiều (theo phép chữa lý khí, thư can)

- Củ gấu 12g, thanh bì 12g, bồ công anh 12g, rau má 16g, lá khôi 16g, chỉ xác 12g, khổ sâm 12g, ngải cứu 8g Sắc nước uống, chia làm 3 lần trong ngày (theo phép chữa thanh can, giáng hỏa)

- Củ gấu 12g, ngải cứu 12g, ô dược 12g, tô mộc 12g, uất kim 6g, hồng hoa 6g, bồ công anh 12g Sắc nước uống (theo phép chữa hành khí hoạt huyết)

Chữa tùy vị hư nhược, tiêu hóa kém, bụng trướng đau, buồn nôn, tiêu chảy:

- Củ gấu (sao) 12g, vỏ quýt (sao) 12g, vỏ vối (sao) 12g, mộc hương (sao) 16g, chỉ xác 12g Sắc nước uống, nếu có kèm tiêu chảy, thêm củ riềng 8g, búp

Chữa đau nửa đầu: Rau má 12g, hương phụ 8g (sao, tẩm nước tiểu trẻ em), thảo quyết minh 12g (sao thơm), vỏ bưởi 8g (phơi khô, sao), rễ nhào 12g Cho 3 bát nước sắc lấy 1 bát, chia 2 lần uống trong ngày, dùng lúc nóng Chữa cảm cúm, gai rét, nhức đầu, đau nhức mình: Hương phụ 12g, tía

tô 10g, vỏ quýt 10g, cam thảo 4g, hành 3 cây, gừng tươi 3 lát Sắc với nước uống

Chữa trẻ em gầy yếu: Hương phụ (sao vàng) 40g, vỏ chuối tiêu chín còn tươi 240g, bột thịt cóc 40g Sấy khô và tán nhỏ củ cói và vỏ chuối thành bột; trộn đều với bột thịt cóc, thêm kẹo mạch nha vào làm thành viên Mỗi viên 4 g, ngày cho ăn 2-4 viên, chia làm 2 lần

Kiêng kị: những người âm hư, huyết nhiệt không nên dùng

1.2.7 Thành phần hóa học của loài Cyperus stoloniferus Retz

Theo “Dược Điển Việt Nam IV” và theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” [2, 23], thành phần hóa học của củ gấu biển gồm: tinh dầu 30,620%; alcaloid 0,128%; glycosid tim 0,77%; saponin 0,05%; flavonoid 0,78%

Cụ thể, tinh dầu chứa cyperen 8,90% ; β - caryophylen 4,89% ; 5β - H, 7β, 10α - selinen 4 (14) - 11 - dien 10,67% ; cyperotundon 2,88% ; cyperolon 1,39% ; caryophylen oxyd 21,31% ; 9H - cyclolongifolen - 8 - oxo 2,35% ; patchoulenon 2,69% ; α - cyperon 3,95% ; α - cyperol 4,73% ; đồng phân của cyperon 14,00%

Theo luận án phó tiến sĩ năm 1994 của dược sĩ Vũ Văn Điền [26], đã xác định được trong củ gấu biển có 0,62% tinh dầu theo phương pháp cất kéo hơi nước; 0,128% alcaloid theo phương pháp cân; 0,77% glycosid bằng phương pháp đo quang; 0,050% saponin theo phương pháp cân; 0,78% flavonoid bằng phương pháp đo quang; 1,78% tanin bằng phương pháp chuẩn

độ

Theo tác giả Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ [14] thì trong thành phần tinh dầu củ gấu biển có 22 chất

Theo Trần Huy Thái, Trần Thị Ngọc Diệp [19] đã xác định được 28 hợp chất trong tinh dầu củ gấu biển bằng phương pháp sắc khí khối phổ, chiếm 86,27% tổng hàm lượng tinh dầu Thành phần hóa học chính của tinh dầu là α - cyperon (32,37%); β - selinen (7,34%); 1, 4 - methanoazulen - 7 -on

- octahydro - 4 - 8 - tetramethyl (6,1%); 2 - cyclohexen - 1 - ol - 2 - methyl - 5 (5,95%); caryophylen oxyd (3,68%)

Theo R D Allan và cộng sự [58] tại Australia đã xác định trong thân rễ

củ gấu biển có các chất quinon là cyperaquinon và hydroxyperaquinon

1.2.8 Tác dụng sinh học của loài Cyperus stoloniferus RetZ

- Tác dụng gây độc của tinh dầu:

Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Văn Điền [26], tinh dầu có khả năng gây độc trên chuột nhắt trắng, liều LD50 của tinh dầu củ gấu biển là 12,1ml/kg

- Tác dụng ức chế thần kinh trung ương:

Tinh dầu củ gấu, thí nghiệm trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm phúc mạc với liều 0,03 ml/chuột, có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của pentobarbital Trên thỏ thí nghiệm, tinh dầu củ gấu tăng cường tác dụng gây

mê của scopolamin Về cơ chế tác dụng, qua thí nghiệm chứng tỏ tinh dầu củ gấu ức chế chủ yếu quá trình dẫn truyền các xung thần kinh qua synap của tế bào vùng hải mã và bó tháp, còn đối với dẫn truyền qua sợi trục thần kinh thì không có tác dụng ức chế [23]

- Tác dụng trên cơ trơn:

Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc”, cao lỏng củ gấu 5%, thí nghiệm trên tử cung cô lập chuột lang, thỏ, mèo và chó đều có tác dụng ức chế sự co bóp tử cung, đồng thời làm giảm trương lực Trên tử cung có thai cũng như trên tử cung bình thường, cao củ gấu đều có tác dụng ức chế So sánh với đương quy, tác dụng ức chế co bóp tử cung của củ gấu yếu hơn Thành phần tinh dầu chiết từ củ gấu có tác dụng kiểu estrogen, nhưng không mạnh [23]

Theo nghiên cứu của Vũ Văn Điền, nước sắc của củ gấu biển có tác dụng giãn cơ tử cung cô lập trên chuột ở liều 0,5-2%; trên thỏ có chửa ở liều 5-6%; giãn cơ tử cung tại chỗ của thỏ ở liều 4-6g/kg [26]

- Tác dụng trên tim mạch:

Theo tác giả Trần Văn Bính, chế phẩm hương phụ biển có tác dụng làm giảm biên độ co bóp và hơi giảm nhịp tim ếch cô lập ở liều 1-4%, ở liều 5% tâm trương toàn bộ [20]

- Tác dụng hạ huyết áp:

Theo luận án phó tiến sĩ năm 1994 của dược sĩ Vũ Văn Điền, nước sắc hương phụ có tác dụng hạ áp nhẹ trên chó với liều 0,5g/kg qua đường tim tĩnh mạch [26]

- Tác dụng giảm đau:

Nước sắc từ thân rễ củ gấu biển, thí nghiệm trên chuột nhắt trắng được gây đau bằng tiêm phúc mạc chuột dung dịch acid acetic đã cho thấy tác dụng giảm đau tương tự acid salicylic Trong nhóm hợp chất thì alcaloid có tác dụng giảm đau mạnh nhất, sau đó là tinh dầu, còn saponin và glycosid không thể hiện tác dụng [28]

- Tác dụng kháng khuẩn:

Theo nghiên cứu của Vũ Văn Điền và Cao Văn Thu, nước sắc của hương phụ biển dạng sống và dạng chế (nước gừng, đồng tiện) có tác dụng

kháng sinh trên 5 chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus

mirabilis, Sarcina lutea và Staphylococcus; trong đó, dạng sống tác dụng

mạnh hơn dạng chế Các nhóm hoạt chất toàn phần thì saponin không có tác dụng kháng khuẩn; alcaloid, glycosid tim và tinh dầu của củ gấu cũng có tác dụng kháng sinh trên 10 chủng vi khuẩn, trong đó glycosid có tác dụng mạnh hơn cả [27]

Chương II NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200

- Máy đo phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): API Q - STAR PULSAR

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT NMR Spectrometer

- Kính hiển vi

- Máy ảnh Canon

- Cân kĩ thuật Sartorius

- Cân phân tích Precisa

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và xử lý mẫu:

+ Thu mẫu, định danh khoa học

+ Xử lý và tạo cao chiết methanol tổng phần củ gấu biển

- Chiết xuất, phân lập chất:

+ Chiết xuất bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với hệ dung môi thích hợp

+ Phân lập sử dụng sắc ký cột với phương pháp rửa giải gradient

- Xác định cấu trúc hoá học: Bằng các phương pháp phổ MS (phổ khối lượng), NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

- Thử hoạt tính chống oxy hoá của các dịch chiết và chất sạch phân lập được: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học

- Kiểm nghiệm bột dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi

- Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo tài liệu [1,13]

- Đưa mẫu vào cột:

Yêu cầu của việc đưa chất thử vào cột là phải phân tán chất thử thành

một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng

Trộn đều một lượng bột silicagel với dung dịch cắn toàn phần, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rãi thành một lớp đều đặn trên mặt chất hấp phụ

Hòa chất thử với một lượng vừa đủ dung môi Dùng pipet hút hết dung dịch thử cho nhẹ lên bề mặt chất hấp phụ Mở vòi cho dung dịch ngấm hết vào cột, dùng pipet hút lấy 1 ít dung môi rửa thành cột và cũng cho ngấm hết vào cột

- Rửa giải:

Cho hệ dung môi rửa giải vào 1 bình cầu cổ nhỏ có van, rồi úp ngược lên cột sắc kí Kiểm soát tốc độ dòng chảy bằng cách đóng mở van có độ rộng thích hợp Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm Sau đó, kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn cho sắc kí đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn

- Tinh chế các chất phân lập:

Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan chất phân lập

- Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập:

Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng SKLM và được triển khai với nhiều hệ dung môi khác nhau

Hình 2.1.Cột sắc kí Sắc kí lớp mỏng (TLC):

Sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi xuất hiện màu

DC-2.3.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết đem tiến hành ghi các phổ:

- Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy APIQ-STAR PLUSAR

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC, phổ HMBC) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS

2.3.4 Đánh giá hoạt tính quét gốc tự do DPPH

Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy-hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH làm cho dung dịch bị giảm màu sắc và độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng

517 nm [24,62]

Hình 2.2: Cơ chế quét gốc tự do DPPH

Chương III KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học

3.1.1 Kiểm nghiệm bột dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi

Hình 3.1: Một số đặc điểm bột Hương phụ biển

(Cyperus stoloniferus Retz.)

1.Mảnh mô mềm mang các tế bào tiết; 2 Khối hạt tinh bột; 3 Mảnh mạch; 4 Tế bào tiết và các tế bào kèm; 5 Tế bào mô cứng; 6 Bó sợi; 7 Tế bào nội bì

Nhận xét: Kết quả soi mẫu bột dược liệu phù hợp với các đặc điểm của

hương phụ biển được mô tả trong DĐVN IV và Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi của PGS.TS Nguyễn Viết Thân [2, 14]

3.1.2 Định tính một số nhóm chất trong dược liệu bằng phương pháp hóa học

Tiến hành định tính mẫu nghiên cứu các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 sau:

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính của củ gấu biển

TT Nhóm chất P/ư định tính Kết quả Kết luận

1 Alcaloid

Có

có

có P/ư mở và đóng vòng lacton -

9 Coumarin P/ư diazo hóa -

Như vậy, đã sơ bộ xác định được trong dịch chiết củ gấu biển có chứa thành phần flavonoid, phù hợp với hướng nghiên cứu của đề tài

3.2 Chiết xuất và phân lập các chất

Sơ đồ phân lập:

Chiết 3 lần bằng MeOH (10L x 3 lần)

Cô quay chân không

Cloroform: nước (1:1)

Cloroform 1L x 3 lần

Lắc siêu âm

Cô quay chân không

CC, Sephadex LH-20, MW 1:1

E3a

Cặn etyl acetat (47g)

Dịch nước

CC, YMC-RP-18

MW 1:1 E3c

CR2 (50mg)

Quá trình tiến hành:

Củ gấu sau khi thu hái được phơi khô, xay nhỏ (3kg bột khô) và ngâm chiết với methanol (10L x 3 lần) trong bể siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-500 mỗi lần 60 phút Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch cao chiết methanol (250g) Cắn chiết này được hòa với nước (1L) rồi chiết phân đoạn lần lượt với cloroform (1L x 3lần) và etyl acetat (1L x 3 lần) thu được các cắn chiết cloroform (80g) và cắn etyl acetat tương ứng (47g) Tiến hành sắc kí cột với silicagel đối với cắn chiết etyl acetat, rửa giải bằng hệ dung môi gradient cloroform-methanol (100:0

→100% methanol) thu được 4 phân đoạn kí hiệu E1-E4 Trong đó, phân đoạn E3 được chạy qua cột silicagel với hệ dung môi cloroform-methanol (20:1) thu được các phân đoạn nhỏ E3a, E3b và E3c Phân đoạn E3a sau khi tách qua cột sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol-nước (1:1) thu được hợp chất 1 kí hiệu là CSE1 (10mg) Phân đoạn E3c sau khi tách qua cột pha đảo YMC RP-18 với hệ dung môi methanol-nước (1:1) thu được hợp chất 2 kí hiệu là CR2 (50mg)

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất đã phân lập:

- Hợp chất CSE1:

Hệ dung môi: Cloroform – methanol (5:1) Thuốc thử: H2SO4 10%, đốt nóng từ từ đến khi hiện màu Kết quả: Xuất hiện một vết màu vàng cam, Rf = 0,537

Hình 3.2 TLC của chất CSE1

- Hợp chất CR2:

Kết luận: Từ 47g cặn etyl acetat của củ gấu biển đã phân lập được 2

chất sạch là CSE1 (10mg) và CR2 (50mg)

3.3 Xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được

Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được xác định dựa vào phân tích các dữ liệu phổ gồm phổ MS và phổ NMR

3.3.1 Hợp chất CSE1

Bảng 3.2 Số liệu phổ của chất CSE1

Position 1δCa δCa,b DEPT δHa,c mult (J= Hz) HMBC

Hệ dung môi: Cloroform-Methanol-Nước (5:1:0,1)

Thuốc thử: H2SO4 10%, đốt nóng từ từ đến khi hiện màu

Kết quả: Xuất hiện một vết màu vàng cam đậm, Rf = 0,205

Hình 3.3 TLC của chất CR2

đo trong CD 3 OD, b 125MHz, c 500MHz

1 δ C :Số liệu phổ theo chất Eriodictyol tài liệu số [65]

1

H NMR (500 MHz, CD3OD):  5,28 (1H, dd, J=3,0; 12,5 Hz, H-2); 2,70 (1H, dd, J=3,0; 17,0 Hz, Ha-3); 3,08 (1H, dd, J=13,0; 17,0 Hz, Hb-3),

5,83 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 5,86 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,93 (1H, s, H-2');

6,80 (2H, s, H-5', H-6')

13

C NMR (125MHz, CD3OD):  80,4 (C-2), 44,0 (C-3), 197,6 (C-4), 165,3 (C-5), 97,0 (C-6), 168,6 (C-7), 96,3 (C-8), 164,7 (C-9), 103,2 (C-10), 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6')

Hợp chất CSE1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng, phổ khối lượng

phân giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 289,0693 [M+H]+

kết hợp với phổ 1H, và 13C-NMR có thể dự đoán CTPT của hợp chất CSE1 là

cho hợp chất có khung flavanon trong đó hai tín hiệu proton tại  5,83 và 5,86 được xác định là thuộc vòng A còn 3 tín hiệu tại  6,93 và 6,80 được xác định

là thuộc vòng B

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của hợp chất CSE1

Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon trong đó nhóm cacbonyl tại C 197,6 là hoàn toàn phù hợp với vị trí C-4 của khung flavanon Độ dịch chuyển tại C 97,0 và 96,3 được xác định là của vị trí C-6

và C-8 trên vòng A của khung flavanon khi vị trí C-5 và C-7 bị thế, điều này được khẳng định khi trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác của H-8 với các

vị trí C 97,0 (C-6); 168,6 (C-7) và 103,2 (C-10) Vòng B được xác định là có dạng thế 1,3,4, điều này không thể hiện trên phổ proton nhưng được thể hiện

rõ trên phổ 13C với các giá trị rất đặc trưng cho dạng thế 1,3,4 tại độ chuyển dịch C 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6') điều này cũng được khẳng định chắc chắn dựa vào tương tác trên phổ HMBC (xem bảng 3.2)

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất CSE1

Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên và so sánh với chất Eriodictyol đã được công bố tại tài liệu [65] thấy có sự trùng khớp về số liệu phổ NMR Như vậy có thể khẳng định hợp chất CSE1 có tên gọi là Eriodictyol và có cấu trúc như hình vẽ

O HO

OH O

OH

2 3 4 5

6

7

8

9 10

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OH

O HO

OH O

OH OH

Hình 3.6: Cấu trúc hóa học và một số tương tác HMBC chính của hợp chất CSE1