Sử dụng phương pháp sắc kí cột thông dụng để phân lập các chất.
Sắc kí cột:
Sắc kí cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silicagel 240-430 mesh, Merck), pha đảo (YMC RP-18, Nhật Bản) hoặc Sephadex LH- 20 (Sigma - Aldrich).
Tiến hành:
- Chuẩn bị cột: Cột rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên một giá cố định.
- Ổn định cột:
Dùng đũa thủy tinh dài để lót một lớp bông (loại bông thấm nước) lên trên ống thoát dịch của cột.
Cho một lượng chất hấp phụ cần dùng vào cốc có mỏ. Thêm dung môi rửa giải vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tới khi hết bọt khí.
Mở khóa cột, rót nhanh hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột. Khi dung môi chảy gần hết trong cột, tiếp tục rót hỗn dịch trên vào cột. Chú ý không để cột khô dung môi và có bọt khí. Khi chất hấp phụ trong cột đạt được độ cao thích hợp thì cho dung môi rửa giải chảy qua liên tục 1 thời gian (có thể từ 5-10h) đến khi cột hấp phụ đã hoàn toàn ổn định.
-Đưa mẫu vào cột:
Yêu cầu của việc đưa chất thử vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng.
Trộn đều một lượng bột silicagel với dung dịch cắn toàn phần, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rãi thành một lớp đều đặn trên mặt chất hấp phụ.
Hòa chất thử với một lượng vừa đủ dung môi. Dùng pipet hút hết dung dịch thử cho nhẹ lên bề mặt chất hấp phụ. Mở vòi cho dung dịch ngấm hết vào cột, dùng pipet hút lấy 1 ít dung môi rửa thành cột và cũng cho ngấm hết vào cột.
-Rửa giải:
Cho hệ dung môi rửa giải vào 1 bình cầu cổ nhỏ có van, rồi úp ngược lên cột sắc kí. Kiểm soát tốc độ dòng chảy bằng cách đóng mở van có độ rộng thích hợp. Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm. Sau đó, kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn cho sắc kí đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn.
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan chất phân lập.
-Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập:
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng SKLM và được triển khai với nhiều hệ dung môi khác nhau.
Hình 2.1.Cột sắc kí Sắc kí lớp mỏng (TLC):
Sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi xuất hiện màu.
2.3.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết đem tiến hành ghi các phổ: - Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy APIQ-STAR PLUSAR.
-Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC, phổ HMBC) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội là TMS.
Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy-hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH làm cho dung dịch bị giảm màu sắc và độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 517 nm [24,62].
Chương III. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kiểm nghiệm bột dược liệu và định tính thành phần hóa học 3.1.1. Kiểm nghiệm bột dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi
Hình 3.1: Một số đặc điểm bột Hương phụ biển (Cyperus stoloniferus Retz.)
1.Mảnh mô mềm mang các tế bào tiết; 2. Khối hạt tinh bột; 3. Mảnh mạch; 4. Tế bào tiết và các tế bào kèm; 5. Tế bào mô cứng; 6. Bó sợi; 7. Tế bào nội bì.
Nhận xét: Kết quả soi mẫu bột dược liệu phù hợp với các đặc điểm của hương phụ biển được mô tả trong DĐVN IV và Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi của PGS.TS. Nguyễn Viết Thân [2, 14].
3 2 4 5 6 7 1
3.1.2. Định tính một số nhóm chất trong dược liệu bằng phương pháp hóa học
Tiến hành định tính mẫu nghiên cứu các nhóm chất thường gặp trong dược liệu bằng phản ứng hóa học, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính của củ gấu biển TT Nhóm chất P/ư định tính Kết quả Kết luận
1 Alcaloid
P/ư với TT Mayer +++
Có
P/ư với TT Bouchardat +++
P/ư với TT Dragendorff +++
2 Glycosid tim
P/ư Liebermann ++
Có
P/ư Baljet ++
P/ư Keller- Kiliani +++
3 Flavonoid
P/ư Cyanidin +++
Có
P/ư với kiềm ++
P/ư với FeCl3 5% +++
4 Saponin
Hiện tượng tạo bọt +++
Có
P/ư Salkowski +++
P/ư Rosenthaler +++
5 Tanin
P/ư với dd FeCl3 5% +++
Có
P/ư với dd chì acetate 10% ++
P/ư với dd gelatin 1% ++
6 Acid amin P/ư với TT Ninhydrin 3% +++ Có
7 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy lọc - Không
có
8 Sterol P/ư Liebermann - Không
có
9 Coumarin P/ư diazo hóa -
Không có
Soi huỳnh quang -
10 Anthranoid
P/ư với dd amoniac 10% -
Không có
P/ư với dd NaOH 10% -
Vi thăng hoa -
11 Polysaccharide P/ư với TT lugol + Có
12 Acid hữu cơ P/ư với bột Na2CO3 ++ Có
13 Đường khử P/ư với TT Fehling A, B +++ Có
Giải thích:
(-): Phản ứng âm tính. (+): Phản ứng dương tính. (++): Phản ứng dương tính rõ. (+++): Phản ứng dương tính rất rõ.
Nhận xét: Qua thực nghiệm đã sơ bộ xác định các nhóm chất có trong dịch chiết củ gấu biển bao gồm: alcaloid, saponin, flavonoid, glycosid tim, tanin, acid amin, polysaccharid, acid hữu cơ, đường khử. Không có coumarin, anthranoid, chất béo, sterol.
Như vậy, đã sơ bộ xác định được trong dịch chiết củ gấu biển có chứa thành phần flavonoid, phù hợp với hướng nghiên cứu của đề tài.
3.2. Chiết xuất và phân lập các chất Sơ đồ phân lập:
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập và chiết xuất
Bột khô (3kg)
Cặn MeOH (250g) Bổ sung nước (1L)
Cặn cloroform (80g) Dịch nước E1 E2 E3 E4 E3b CSE1 (10mg) CC, Silicagel CM 20:1 CC, Sillicagel CM 100:0 0:100 Etyl acetat:nước (1:1) Etyl acetat 1L x 3 lần Chiết 3 lần bằng MeOH (10L x 3 lần) Cô quay chân không
Cloroform: nước (1:1) Cloroform 1L x 3 lần
Lắc siêu âm
Cô quaychân không
Cô quay chân không
CC, Sephadex LH-20, MW 1:1 E3a Cặn etyl acetat (47g) Dịch nước CC, YMC-RP-18 MW 1:1 E3c CR2 (50mg)
Quá trình tiến hành:
Củ gấu sau khi thu hái được phơi khô, xay nhỏ (3kg bột khô) và ngâm chiết với methanol (10L x 3 lần) trong bể siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-500 mỗi lần 60 phút. Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch cao chiết methanol (250g). Cắn chiết này được hòa với nước (1L) rồi chiết phân đoạn lần lượt với cloroform (1L x 3lần) và etyl acetat (1L x 3 lần) thu được các cắn chiết cloroform (80g) và cắn etyl acetat tương ứng (47g). Tiến hành sắc kí cột với silicagel đối với cắn chiết etyl acetat, rửa giải bằng hệ dung môi gradient cloroform-methanol (100:0 →100% methanol) thu được 4 phân đoạn kí hiệu E1-E4. Trong đó, phân đoạn E3 được chạy qua cột silicagel với hệ dung môi cloroform-methanol (20:1) thu được các phân đoạn nhỏ E3a, E3b và E3c. Phân đoạn E3a sau khi tách qua cột sephadex LH-20 với hệ dung môi methanol-nước (1:1) thu được hợp chất 1 kí hiệu là CSE1 (10mg). Phân đoạn E3c sau khi tách qua cột pha đảo YMC RP-18 với hệ dung môi methanol-nước (1:1) thu được hợp chất 2 kí hiệu là CR2 (50mg).
Kiểm tra độ tinh khiết của các chất đã phân lập:
- Hợp chất CSE1:
Hệ dung môi: Cloroform – methanol (5:1)
Thuốc thử: H2SO4 10%, đốt nóng từ từ đến khi hiện màu. Kết quả: Xuất hiện một vết màu vàng cam, Rf = 0,537.
- Hợp chất CR2:
Kết luận: Từ 47g cặn etyl acetat của củ gấu biển đã phân lập được 2 chất sạch là CSE1 (10mg) và CR2 (50mg).
3.3. Xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được
Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được xác định dựa vào phân tích các dữ liệu phổ gồm phổ MS và phổ NMR.
3.3.1. Hợp chất CSE1
Bảng 3.2. Số liệu phổ của chất CSE1
Position 1δCa δCa,b DEPT δHa,c mult. (J= Hz) HMBC
2 80,5 80,4 CH 5,28 dd (3,0; 12,5) 4, 1', 2', 6' 3 44,1 44,0 CH2 2,70 dd (3,0; 17,0) 3,08 dd (13,0; 17.0) 2, 4, 1' 4 197,8 197,6 C - 5 165,4 165,3 C - 6 97,0 97,0 C 5,83 d (2,0) 5, 7, 10 7 168,4 168,6 C - 8 96,2 96,3 CH 5,86 d (2,0) 6, 7, 10 9 164,8 164,7 C - 10 103,3 103,2 C - 1' 131,8 131,7 C -
Hệ dung môi: Cloroform-Methanol-Nước (5:1:0,1). Thuốc thử: H2SO4 10%, đốt nóng từ từ đến khi hiện màu. Kết quả: Xuất hiện một vết màu vàng cam đậm, Rf = 0,205.
2' 114,7 114,7 CH 6,93 s 2, 1', 3', 6' 3' 146,5 146,4 C - 4' 146,9 146,8 C - 5' 116,2 116,2 CH 6,80 s 6' 119,3 119,2 CH 6,80 s 2, 1', 2', 4' a
đo trong CD3 OD, b 125MHz, c 500MHz
1δC :Số liệu phổ theo chất Eriodictyol tài liệu số [65]
1 H NMR (500 MHz, CD3OD): 5,28 (1H, dd, J=3,0; 12,5 Hz, H-2); 2,70 (1H, dd, J=3,0; 17,0 Hz, Ha-3); 3,08 (1H, dd, J=13,0; 17,0 Hz, Hb-3), 5,83 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 5,86 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,93 (1H, s, H-2'); 6,80 (2H, s, H-5', H-6'). 13 C NMR (125MHz, CD3OD): 80,4 (C-2), 44,0 (C-3), 197,6 (C-4), 165,3 (C-5), 97,0 (C-6), 168,6 (C-7), 96,3 (C-8), 164,7 (C-9), 103,2 (C-10), 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C- 6').
Hợp chất CSE1 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 289,0693 [M+H]+ kết hợp với phổ 1H, và 13C-NMR có thể dự đoán CTPT của hợp chất CSE1 là C15H12O6 và KLPT là 288.
Trên phổ 1H-NMR tại vùng trường trung bình đặc trưng cho các olefin vòng thơm xuất hiện tín hiệu của ba proton dạng singlet tại độ dịch chuyển H
6,93 (1H, s, H-2'); 6,80 (2H, s, H-5', H-6', tín hiệu của hai proton dạng meta
tại 5,83 (1H, d, J=2,0 Hz, H-6); 5,86 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8). Bên cạnh đó phổ
1
H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của một nhóm methyl tại H 5,28 (1H, dd,
J=3,0; 12,5 Hz, H-2), một nhóm methylen tại 2,70 (1H, dd, J=3,0; 17,0 Hz, Ha-3); 3,08 (1H, dd, J=13,0; 17,0 Hz, Hb-3). Các tín hiệu này khá đặc trưng
cho hợp chất có khung flavanon trong đó hai tín hiệu proton tại 5,83 và 5,86 được xác định là thuộc vòng A còn 3 tín hiệu tại 6,93 và 6,80 được xác định là thuộc vòng B.
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất CSE1
Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon trong đó nhóm cacbonyl tại C 197,6 là hoàn toàn phù hợp với vị trí C-4 của khung flavanon. Độ dịch chuyển tại C 97,0 và 96,3 được xác định là của vị trí C-6 và C-8 trên vòng A của khung flavanon khi vị trí C-5 và C-7 bị thế, điều này được khẳng định khi trên phổ HMBC cho thấy sự tương tác của H-8 với các vị trí C 97,0 (C-6); 168,6 (C-7) và 103,2 (C-10). Vòng B được xác định là có dạng thế 1,3,4, điều này không thể hiện trên phổ proton nhưng được thể hiện rõ trên phổ 13C với các giá trị rất đặc trưng cho dạng thế 1,3,4 tại độ chuyển dịch C 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6') điều này cũng được khẳng định chắc chắn dựa vào tương tác trên phổ HMBC (xem bảng 3.2).
Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất CSE1
Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên và so sánh với chất Eriodictyol đã được công bố tại tài liệu [65] thấy có sự trùng khớp về số liệu phổ NMR. Như vậy có thể khẳng định hợp chất CSE1 có tên gọi là Eriodictyol và có cấu trúc như hình vẽ.
Tên: Eriodictyol
Công thức phân tử: C15H12O6 Khối lượng phân tử: 288 ESI MS m/z: 289,0693 [M+H]+
O HO OH O OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH O HO OH O OH OH
Hình 3.6: Cấu trúc hóa học và một số tương tác HMBC chính của hợp chất CSE1
3.3.2. Hợp chất CR2
Bảng 3.3: Số liệu phổ của chất CR2
Position *δCa,e δCa,b DEPT δHa,c mult. (J= Hz)
2 81,0 81,1 CH 4,48 d (8,0) 3 66,4 66,5 CH 3,83m 4 27,7 27,9 CH2 2,36 dd (8,0, 16,0) 2,65 dd (5,0, 16,0) 5 156,1 156,6 C - 6 95,3 95,3 CH 5,70 br s 7 156,4 156,3 C - 8 94,0 94,1 CH 5,89 br s 9 155,3 155,5 C - 10 99,2 99,3 C - 1' 130,7 130,8 C - 2' 114,5 114,6 CH 6,72 br s 3' 144,8 145,0 C - 4' 144,8 145,0 C -
5' 115,1 115,3 CH 6,59 d (8,0)
6' 118,4 118,6 CH 6,69 d (8,0)
a
đo trong DMSO-d6, b 125MHz, c 500MHz * Số liệu phổ theo chất (+)-Catechin tài liệu số [36]
1 H NMR (500 MHz, DMSO): 4,48 (1H; d; J=8,0 Hz; H-2); 3,83 (2H, m, H-3); 2,36 (1H; dd; J=8,0; 16,0 Hz; Ha-4); 2,56 (1H; dd; J=5,0; 16,0 Hz; Hb-4); 5,70 (1H, br s, H-6); 5,89 (1H, br s, H-8); 6,72 (1H,br s, H-2'); 6,59 (1H, d, J=8,0 Hz; H-5'); 6,69 (1H; d; J=8,0 Hz; H-6') 13 C NMR (125MHz, DMSO): 81,1 (C-2); 66,5 (C-3); 27,9 (C-4); 156,6 (C-5); 95,3 (C-6); 156,3 (C-7); 94,1 (C-8); 155,5 (C-9); 99,3 (C-10); 130,8 (C-1'); 114,6 (C-2'); 145,0 (C-3'); 145,0 (C-4'); 115,3 (C-5'); 118,6 (C- 6').
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của hai proton ở vị trí meta với nhau tại
5,70 (1H, br s, H-6); 5,89 (1H, br s, H-8), đồng thời phổ 1H cũng xác định sự xuất hiện của vòng thơm thế kiểu ABX bởi các tín hiệu 6,72 (1H, br s, H-2'); 6,59 (1H; d; J=8,0 Hz; H-5'); 6,69 (1H; d; J=8,0 Hz, H-6'). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của hai nhóm methyl nối với oxi tại 4,48 (1H; d;
J=8,0 Hz; H-2); 3,83 (1H, m, H-3) và hai proton của nhóm methylen tại 2,36 (1H; dd; J=8,0; 16,0 Hz; Ha-4); 2,56 (1H; dd; J=5,0; 16,0 Hz; Hb-4). Như vậy có thể sơ bộ nhận định hợp chất CR2 có khung flavan, điều này được khẳng định hơn trên phổ 13C-NMR.
Hình 3.7.Phổ 1H-NMR của hợp chất CR2
Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon, kết hợp với phổ DEPT nhận thấy có một nhóm CH2, 7 CH và 7C không có hydro. Hai tín hiệu tại 94,1 và 99,3 được xác định là ở hai vị trí C-8, C-6 của vòng A khung flavan khi vị trí C-5 và C-7 bị thế, ba nhóm methyl còn lại của vòng benzen được xác định là thuộc vòng B: 114,6 (C-2'); 115,3 (C-5'); 118,6 (C- 6'). Tín hiệu của hai nhóm methyl tại 81,1 và 66,5 là hoàn toàn phù hợp với vị trí C-2 và C-3 của khung flavan trong đó vị trí C-3 có đính với nhóm thế chứa oxi, nhóm CH2 duy nhất được được xác định là ở vị trí C-4. Ngoài ra phổ 1H-NMR và 13C-NMR cũng không xuất hiện bất kì tín hiệu của nhóm thế nào chứng tỏ tất cả các nhóm thế trong phân tử đều là nhóm OH, điều này được khẳng định thêm dựa vào phổ khối lượng ESI-MS. So sánh các dữ kiện phổ của hợp chất CR2 với các dữ kiện phổ của chất (+)-catechin [36] thấy có sự phù hợp hoàn toàn. Như vậy hợp chất CR2 là (+)-catechin, một chất có mặt phổ biến trong chè xanh.
Hình 3.8.Phổ 13C-NMR của hợp chất CR2
Tên: (+)-Catechin
Công thức phân tử: C15H14O6 Khối lượng phân tử: 290
O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OH
3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa 3.4.1. Tiến hành
Pha dung dịch DPPH nồng độ 150µM trong MeOH ngay trước khi dùng. Hỗn hợp phản ứng 200µl được cho vào các giếng của phiến 96 giếng gồm 10µl chất thử pha trong DMSO ở các nồng độ khảo sát (100, 50 và 10µg/ml) và 190µl dung dịch DPPH. Mỗi nồng độ khảo sát được tiến hành 3 lần. Những mẫu thử có hoạt tính mạnh, ức chế trên 50% ở nồng độ 10µg/ml sẽ thử tiếp ở các nồng độ thấp hơn: 10, 5 và 1µg/ml. Lắc nhẹ hỗn hợp phản ứng, đem ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng 30 phút. Sau đó, đo quang ở bước