Nghiên cứu phân lập một vài hợp chất trong phân đoạn phân cực trung bình của hạt bìm bìm biếc (impomoea hederacea jacq convulvulaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC TRUNG BÌNH CỦA HẠT BÌM BÌM BIẾC (IMPOMOEA HEDERACEA JACQ CONVULVULACEAE) Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đơng Phương Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC TRUNG BÌNH CỦA HẠT BÌM BÌM BIẾC (IMPOMOEA HEDERACEA JACQ CONVULVULACEAE) Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 2.1 Nguyên vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu…… 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………….2 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………….5 3.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn……………………………5 3.2 Phân lập……………………………………………………………6 3.3 Xác Định Cấu Trúc Chất Phân Lập Được……………………… 15 IV KẾT LUẬN…………………………………………………………… 19 V TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 20 I ĐẶT VẤN ĐỀ: Hạt Bìm bìm biếc vị thuốc sử dụng từ lâu nền y học cổ truyển của nước ta nhiều nước giới với tác dụng tẩy xổ, tăng sức co bóp của ruột, thơng mật và dùng để trị giun Hiện nay, nước ta có nhiều chế phẩm thuốc có nguồn gốc tự nhiên chứa vị thuốc này để chữa phòng ngừa bệnh về gan mật như: sản phẩm Boganic (công ty Traphaco), sản phẩm Bổ gan thông mật (công ty Sohaco)… Ngoài ra, theo nghiên cứu gần đây, dịch chiết hạt Bìm bìm biếc cịn có tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm… Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố về tác dụng sinh học hoạt chất phân lập từ hạt Bìm bìm biếc Với giá trị sử dụng vậy, việc khảo sát tác dụng sinh học nghiên cứu phân lập hoạt chất từ hạt Bìm bìm biếc cần thiết Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu phân lập vài hợp chất phân đoạn phân cực trung bình của Bìm bìm biếc” (Semen Ipomoeae hederaceae Jacp., Họ Convolvulaceae) tiến hành với mục tiêu sau: - Thu mẫu nguyên liệu (Bìm bìm biếc) - Nghiên cứu thành phần hóa thực vật - Chiết xuất hoạt chất toàn phần EtOH - Phân tách cao cồn thành phân đoạn đơn giản phương pháp phân bố lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần - Phân lập vài hợp chất phân đoạn phân cực trung bình II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ngun vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu hạt Bìm bìm biếc semen Ipomoeae hederaceae (xuất xứ Trung Quốc, Công ty BV Pharma cung cấp) rửa nước, sấy khô xay bột thô để chiết xuất cho thử sinh học phân lập hợp chất tinh khiết 2.1.2 Ngun liệu, dung mơi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu - Dung môi: cồn 96%, methanol, n-hxan, chloroform, ethylacetat, ether dầu hỏa đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR) đạt tiêu chuẩn phân tích dùng SKLM, SKC Dung môi cho UPLC: methanol, acetonitril, nước cất cho HPLC 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị: - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), ct Sunfire C18 (250 ì 4,6 mm; àm) v tiờn ct Sunfire C18 (12,5 ì 4,6 mm; àm) - SKLM dùng silica gel F254 tráng sẵn nền nhôm (Merck, Art 1.05554) - SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn (Merck) cỡ hạt 15- 40µm) Máy quay Buchi R300 (Nhật Bản) Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức) Tủ sấy Gallentkamp (Anh) Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức) Cột sắc ký dụng cụ thí nghiệm thơng thường phịng thí nghiệm của Bộ mơn Dược liệu Phịng nghiên cứu hóa hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo nghiên cứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH Y Dược Tp HCM - Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters) - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt nam - Hà nội - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; àm) v tiờn ct Sunfire C18 (12,5 ì 4,6 mm; µm) - Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng máy HPLC 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn - Chiết xuất: bột hạt Bìm bìm biếc chiết xuất phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 50 % Dịch chiết thu cô giảm áp thu hồi dung mơi, thu cao cồn tồn phần - Phân tách phân đọan đơn giản: cao cồn toàn phần pha loãng với nước theo tỉ lệ (1:1) tạo thành hỗn dịch lắc phân bố với dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetat n-butanol phần lại không tan dung môi Các dịch sau lắc phân bố cô áp suất giảm thu cao tương ứng - Phân lập hợp chất phân đoạn EtOAc 2.2.2 Phân lập, kết tinh kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 2.2.2.1 SKC nhanh - Cột thủy tinh đường kính 7,5 x 90 cm, có lưới thủy tinh xốp - Mẫu phân lập: cao EtOAc - Pha động: Như phần thực nghiệm - Thể tích hứng: 100 ml - Kiểm tra phân đoạn: SKLM silica gel F254, khai triển với hệ dung môi chloroform – methanol (9:1) 2.2.2.2 Phân lập tủa phân đoạn (EA4) SKC cổ điển Điều kiện SK: - Cột sắc ký: x 40 cm có lưới thủy tinh xốp - Pha tĩnh: 30 g silica gel kích thước hạt hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck) - Mẫu: Tủa phân đoạn EA4 cột VLC - Dung môi khai triển: Như phần kết nghiên cứu - Thể tích hứng ống nghiệm: 20 ml - Hệ dung môi cho SKLM kiểm tra phân đoạn: cloroform – methanol (9:1), phát hiện UV 254, UV 365 nm 2.2.2.3 Phân lập Tủa phân đoạn EA5 SKC cổ điển2 Điều kiện SK: - Cột sắc ký: x 40 cm có lưới thủy tinh xốp - Pha tĩnh: 33 g silica gel kích thước hạt hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck) - Mẫu: Tủa phân đoạn EA5 cột VLC - Dung môi khai triển: Như phần kết nghiên cứu - Thể tích hứng ống nghiệm: 20 ml - Hệ dung môi cho SKLM kiểm tra phân đoạn: cloroform – methanol (8:2), phát hiện UV 254, UV 365 nm 2.2.2.4 Phân lập phân đoạn EA6 sắc ký rây phân tử - Cột SK: 2,5x60 cm, pha tĩnh Sephadex LH-20, khối lượng 50 g - Chuẩn bị mẫu: 1,13 g phân đoạn EA hòa tan MeOH - Pha động: MeOH - Thể tích hứng: ml, tương ứng tốc độ ml/phút - Kiểm tra phân đoạn: SKLM silica gel F254, khai triển với hệ dung môi chloroform – methanol (9:1), phát hiện UV 254, UV 365 nm thuốc thử VS 2.2.3 Kiểm tra tinh khiết 2.2.3.1 Kiểm tra tinh khiết SKLM: Các chất phân lập khác có hệ dung mơi phân tích SKLM khác (xem phần Kiểm tra tinh khiết hợp chất phân lập) 2.2.3.2 Kiểm tra tinh khiết UPLC Điều kiện sắc ký: - Tiến hành phân tích hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC với đầu dò dãy diod quang PDA, kết hợp phần mềm EMPOWER 3, sử dụng cột sắc ký Acquity UPLCđ BEH C18 (130; 1,7 àm; 2,1 mm x 50 mm) - Chuẩn bị mẫu: IH2 pha dung môi methanol, nồng độ 0,1mg/ml - Pha động: acetonitril – nước acid formic 0,1 % - Tốc độ dịng: 0,2 ml/phút; - Thể tích tiêm: 0,2 ml/phút; - Nhiệt độ cột: 25 °C - Dãy bước sóng phát hiện: 210 – 400 nm - Thời gian phân tích: 30 phút; 2.2.6 Xác định cấu trúc chất phân lập Chất tinh khiết phân tích phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với liệu về phổ NMR, MS của chất tương tự công bố tài liệu Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo máy BRUKER – AV – 500, Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫu hòa tan CD3OD CD3COCD3 với TMS chất chuẩn nội Phổ proton (1H-NMR) đo 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) đo 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn tín hiệu của TMS Các số ghép (J) tính Hertz (Hz) III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn Làm ẩm kg bột hạt Bìm bìm biếc EtOH 50% 15 phút, sau chiết ngấm kiệt với 40 lít EtOH 50%, chiết lần Tổng dịch chiết thu 120 lít, thu hồi dung mơi cô áp suất giảm, thu 1,14 kg cao tồn phần Cao hịa tan với lượng nước cất vừa đủ (1:1), lắc phân bố với dung môi n-hexan, chloroform, ethyl acetat n-butanol Các dịch sau lắc phân bố cô áp suất giảm cho cao n-hexan có lẫn nhiều dầu béo (30 g), cao chloroform (23 g), cao etyl acetat (32 g), cao n-butanol (15 g) Kết chiết xuất, phân tách cao trình bày Bảng 3.4 Sơ đồ 3.1: Bột dược liệu (9 kg) EtOH 50% Dịch cồn Cô thu hồi cồn Cao lỏng + nước, lắc phân bố chloroform n-hexan Dịch chloroform Dịch n-hexan Cô thu hồi Cô thu hồi Cao n-hexan Cao chloroform Ethyl acetat Dịch ethyl acetat n-butanol Dịch n-butanol Cô thu hồi Cao ethyl acetat Cơ thu hồi Cao n-butanol Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân bố lỏng - lỏng cao Bìm bìm biếc Bảng 0.1 Kết phân tách cao phân đoạn từ cao toàn phần Bìm bìm biếc Dịch chiết Cao Khối lượng (g) n-hexan Cao n-hexan 30 Chloroform Cao CF 23 EtOAc Cao EtOAc 32 n-butanol Cao n-butanol 15 3.2 Phân lập 3.2.1 Phân lập cao EtOAc sắc ký cột nhanh (VLV) 3.2.1.1 Thăm dị hệ dung mơi SKLM Tiến hành sắc ký lớp mỏng cao EA với mỏng tráng sẵn nền nhôm F254 (Merck), đoạn đường dung môi (khoảng cm), khai triển với hệ dung môi, phát hiện đèn UV hai bước sóng 365 nm 254 nm Kết thăm dò pha động trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết thăm dị pha động cột VLC cao EA Hệ dung mơi Khả tách Thành phần sắc ký đồ n-Hexan + Tách vết, vết đáy chưa tách DCM ++ Tách vết, vết tách rõ DCM - EA (8:2) +++ Tách nhiều vết, vết rõ, tách xa CF - MeOH (9:1) +++ Tách nhiều vết, vết rõ, Rf vết cao EA +++ Tách nhiều vết, vết phân cực bị dồn lại Nhận xét: hệ dung môi CF – MeOH (9:1) cho kết tách tốt nên chọn làm hệ dung môi phát hiện Dung môi khai triển cột chọn hệ DCM sau tăng dần tỷ lệ EA từ - 100% 3.2.1.2 Tiến hành phân tách cao EA thành phân đoạn sắc ký cột nhanh (VLC) Chuẩn bị mẫu: 25 g cao EA hòa tan lượng tối thiểu MeOH, trộn đều với silica gel, làm khô mẫu tủ sấy chân không, nghiền mịn bột tơi mịn, màu nâu Chuẩn bị cột: cột thủy tinh đường kính 7,5 x 90 cm, có lưới thủy tinh xốp Nạp 500 g silica gel hạt vừa (0,040 – 0,063 µm);, hút chân khơng cột ổn định Pha động: chạy gradient từ dung môi nền DCM, tăng dần tỷ lệ EA từ - 100% Thể tích hứng: 100 ml Kiểm tra phân đoạn: SKLM silica gel F254, khai triển với hệ dung môi chloroform – methanol (9:1), phát hiện UV 254, UV 365 nm thuốc thử VS Gộp phân đoạn giống nhau, cô thu hồi dung môi cắn dịch đậm đặc Kết quả: từ 25 g cao ethyl acetat qua cột sắc ký cột nhanh, thu 290 bình hứng, kiểm tra sắc ký lớp mỏng gộp phần có thành phần giống kết thu 10 phân đoạn Kết ghi nhận Bảng 3.3 Bảng 3.3 Các phân đoạn cao EA thu qua VLC Phân đoạn Tỉ lệ dung môi EA DCM (100%) - 31 3,02 Dạng dầu EA DCM - EA (95:5) 32 - 56 0,53 Có tinh thể vàng EA DCM - EA(90:10) 57 - 80 0,32 Có tinh thể vàng EA DCM - EA (85:15) 81 - 105 0,6 Có tủa đỏ cam EA DCM - EA(80:20) 106 - 150 0,75 Có tủa đỏ cam EA DCM - EA (75:25) 151 - 167 1,45 Có tủa đỏ cam EA DCM - EA (60:40) 168 - 200 1,85 Có tủa trắng EA DCM - EA(50:50) 201 - 234 1,27 Có tủa trắng EA EA (100%) 235 - 290 2,2 Có tủa trắng Erlen Khối lượng (g) Ghi Sắc ký đồ kiểm tra phân đoạn hệ dung môi CHCl3 – MeOH (90:10) cho thấy: - Phân đoạn:1 dạng dầu, thành phần chủ yếu dầu béo nên chưa nghiên cứu - Các phân đoạn lại sau thu hồi dung mơi, có tủa kết tinh nên tiếp tục nghiên cứu để thu chất tinh khiết 3.2.2 Tinh chế phân đoạn EA2 - Kết tinh phân đoạn lọc rửa nhiều lần methanol lạnh phễu thủy tinh xốp áp suất giảm, làm khô tủ hút chân không, thu kết tinh màu vàng nhạt (IH1, 420,3 mg) tan tốt dichlometan - Kiểm tra độ tinh khiết IH1 sắc ký lớp mỏng mỏng silicagel, chạy khai triển với ba hệ dung môi CF - EA (8:2), Cf-MeOH (9:1) EA Kết quả: hệ dung môi, IH1 đều cho vết gọn sắc ký đồ IH1 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm, cho vết màu tím với thuốc thử VS trùng với CL1 (đã phân lập cao CHCl3) Như sơ kết luận IH1 caffeat ethyl 3.2.3 Phân lập hợp chất phân đoạn EA4 SKC cổ điển Phân đoạn EA4 lọc rửa nhiều lần dung môi dichlometan lạnh phễu thủy tinh xốp áp suất giảm, thu tủa phân đoạn EA4, có khối lượng 0,41 g Tủa phân đoạn EA4 tiến hành chạy cột sắc ký cột cổ điển Chuẩn bị mẫu: 0,41 g tủa phân đoạn EA4 hòa tan lượng tối thiểu MeOH, trộn đều với silica gel, làm khô mẫu tủ sấy chân khơng, sau nghiền mịn thu bột khô mịn màu nâu Chuẩn bị cột: cột thủy tinh đường kính x 40 cm, có lưới thủy tinh xốp Nạp 30 g silica gel hạt vừa (0,040 – 0,063 µm), hút chân khơng cột ổn định Pha động: chạy gradient từ dung môi nền dichlometan, tăng dần tỷ lệ ethyl acetat từ - 30% Thể tích hứng: 20 ml Kiểm tra phân đoạn: SKLM silica gel F254, khai triển với hệ dung môi cloroform – methanol (9:1), phát hiện UV 254, UV 365 nm Gộp phân đoạn giống nhau, cô thu hồi dung môi cắn dịch đậm đặc Kết quả: từ 0,41 g tủa phân đoạn EA qua cột sắc ký cột, thu 58 bình hứng, kiểm tra sắc ký lớp mỏng gộp phần có thành phần giống kết thu phân đoạn Kết ghi nhận Bảng 3.4 Bảng 3.4 Các phân đoạn tủa EA thu qua VLC Phân đoạn Tỉ lệ dung môi Erlen Khối lượng (mg) Ghi EA4-1 DCM - EA (95:5) - 10 Có tinh thể vàng EA4-2 DCM - EA(90:10) 11 - 22 60,3 nâu EA4-3 DCM - EA(80:20) 23 - 36 79,5 nâu EA4-4 DCM - EA (70:30) 37 - 58 115,6 đen Nhận xét: + Phân đoạn EA 4-1 sau cô thu hồi dung môi thu tinh thể - rửa giải liên tục với methanol lạnh thu IH2 có khối lượng 2,5 mg + Phân đoạn EA 4-2,3,4: sau cô thu hồi dung môi sắc ký đồ nhiều vết dạng dịch đậm đặc nên với sắc ký cột cổ điển khó phân lập chất tinh khiết - Kiểm tra sắc ký lớp mỏng IH2 Chấm mẫu lên mỏng silicagel gồm mẫu cao EA, mẫu phân đoạn 2, mẫu IH2 khai triển với ba hệ dung môi CF - EA (8:2), Cf-MeOH (9:1) EA Kết quả: hệ dung môi, IH2 đều cho vết gọn sắc ký đồ IH2 tắt quang với UV 254 nm, không phát quang với UV 365 nm âm tính với thuốc thử VS Kiểm tra tinh khiết UPLC - Chuẩn bị mẫu: IH2 pha dung môi methanol, nồng độ 0,1mg/ml - Diều kiện sắc ký: phần phương pháp nghiên cứu Hình 3.1 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra tinh khiết IH2 Tên peak Thời gian lưu (phút) Diện tích peak % diện tích peak Peak 4,582 14840 0,08 Peak 14,453 17736374 99,62 Peak 22,999 53545 0.30 Kết kiểm tra UPLC, IH2 có độ tinh khiết 99,62 % 3.2.4 Phân lập hợp chất phân đoạn EA5 SKC cổ điển Tiến hành sắc ký cột cổ điển Chuẩn bị mẫu: 0,75 g phân đoạn EA5 hòa tan lượng tối thiểu MeOH, trộn đều với silica gel, làm khơ mẫu tủ sấy chân khơng, sau nghiền mịn thu bột khô mịn màu nâu Chuẩn bị cột: cột thủy tinh đường kính x 40 cm, có lưới thủy tinh xốp Nạp 33 g silica gel hạt vừa (0,040 – 0,063 µm), hút chân khơng cột ổn định Pha động: chạy gradient từ dung môi nền DCM, tăng dần tỷ lệ EA từ - 30% Thể tích hứng: 20 ml Kiểm tra phân đoạn: SKLM silica gel F254, khai triển với hệ dung môi cloroform – methanol (8:2), phát hiện UV 254, UV 365 nm Gộp phân đoạn giống nhau, cô thu hồi dung môi cắn dịch đậm đặc Kết quả: từ 0,75 g phân đoạn EA qua cột sắc ký cột cổ điển, thu 100 bình hứng, kiểm tra sắc ký lớp mỏng gộp phần có thành phần giống kết thu phân đoạn Kết ghi nhận Bảng 3.5 Bảng 3.5 Các phân đoạn tủa EA thu qua VLC Phân đoạn Tỉ lệ dung môi Erlen Khối lượng (mg) Ghi EA5-1 DCM - EA (100%) 1-9 10,4 nâu EA5-2 DCM – EA (95:5) 10 - 17 11,7 Có tinh thể cam EA5-3 DCM – EA (90:10) 18 - 29 13,1 Có tinh thể vàng EA5-4 DCM - EA (85:15) 30 - 45 33,8 nâu EA5-5 DCM – EA (80:20) 46 - 60 72.9 Có tinh thể nâu EA5-6 DCM - EA (75:25) 61 - 78 110,4 Có tinh thể nâu Nhận xét: - Phân đoạn EA 5-3: cô thu hồi bớt dung môi, để lạnh xuất hiện kết tinh, rửa 10 methanol lạnh thu IH3 có khối lượng mg - Phân đoạn EA 5-2,5,6: cô thu hồi bớt dung môi, để lạnh xuất hiện kết tinh cịn nhiều vết, khó phân lập chất tinh khiết - Phân đoạn EA 5-1,4,7: sắc ký đồ nhận thấy có thành phần phức tạp (nhiều vết) nên chưa nghiên cứu Kiểm tra tinh khiết IH3: - Chấm mẫu lên mỏng silicagel gồm mẫu cao EA, mẫu phân đoạn 2, mẫu IH1 khai triển với ba hệ dung môi CF - EA (8:2), Cf-MeOH (9:1) EA Nhận xét: hệ dung môi, IH3 đều cho vết gọn sắc ký đồ IH3 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm, âm tính với thuốc thử VS - Kiểm tra tinh khiết UPLC Tên peak Thời gian lưu (phút) Diện tích peak % diện tích peak IH3 10,218 3369270 100 Hình 3.3 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết IH3 Kết quả: kiểm tra UPLC, IH3 có độ tinh khiết 100 % 11 3.2.5 Phân lập hợp chất phân đoạn EA6 sắc ký rây phân tử Tủa phân đoạn EA lọc rửa phễu thủy tinh xốp áp suất giảm hỗn hợp DCM-EA (9:1), thu 1,13 g và dùng để phân tách cột Sephadex LH-20 Tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 Chuẩn bị mẫu: 1,13 g phân đoạn EA hòa tan MeOH Chuẩn bị cột: cột Sephadex LH-20 (2,5x60 cm), khối lượng pha tĩnh 50 g Pha động: MeOH Thể tích hứng: ml, tương ứng tốc độ ml/phút Kiểm tra phân đoạn: SKLM silica gel F254, khai triển với hệ dung môi chloroform – methanol (9:1), phát hiện UV 254, UV 365 nm thuốc thử VS Nhận xét: - Phân đoạn EA 6-1: cô thu hồi dung môi, bảo quản lạnh thu kết tinh Kết tinh rửa giải liên tục với methanol lạnh thu IH4 có khối lượng 285,3 mg - Phân đoạn EA 6-2,3,5: cô thu hồi dung môi, bảo quản lạnh thu kết tinh sắc ký đồ vần nhiều vết, dạng dịch đậm đặc nên với sắc ký cột cổ điển khó phân lập chất tinh khiết - Phân đoạn EA 6-4: cô thu hồi dung môi, bảo quản lạnh thu kết tinh Kết tinh rửa giải liên tục với methanol thu IH5 IH5 có hình dạng bột màu đỏ, khối lượng mg, tan tốt methanol Kiểm tra tinh khiết IH4: - Trên SKLM: Chấm mẫu lên mỏng silicagel gồm mẫu cao EA, mẫu phân đoạn 2, mẫu IH1 khai triển với ba hệ dung môi CF - EA (8:2), Cf-MeOH (9:1) EA Kết quả: hệ dung môi, IH4 đều cho vết gọn sắc ký đồ IH4 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm cho vết màu tím với thuốc thử VS - Kiểm tra tinh khiết UPLC: Tên peak Thời gian lưu (phút) Diện tích peak % diện tích peak Peak 10,128 7026520 98,63 Peak2 10,615 97483 1,37 12 Hình 3.4 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra tinh khiết IH4 Kết kiểm tra UPLC, IH4 có độ tinh khiết 98,63 % Kiểm tra tinh khiết IH5: - Trên SKLM: IH5 kiểm tra độ tinh khiết với hệ dung môi khác nhau: chấm mẫu lên mỏng silicagel gồm mẫu cao EA, mẫu IH4 chạy ba hệ dung môi CF - EA (8:2), Cf-MeOH (9:1) EA Kết quả: hệ dung môi, IH5 đều cho vết gọn sắc ký đồ IH5 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm, cho vết màu nâu với thuốc thử VS - Kiểm tra tinh khiết UPLC Stt Tên peak Thời gian lưu (phút) Diện tích peak % diện tích peak Peak 9,517 33623 0,65 Peak 9.768 5075709 98,12 Peak 13,154 53706 1,23 13 Hình 3.5 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra tinh khiết IH5 Kết kiểm tra UPLC, IH5 có độ tinh khiết 98,12 % 3.2.6 Tinh chế phân đoạn EA-7, - Tủa phân đoạn 7, 8, lọc và rửa nhiều lần methanol phễu thủy tinh xốp áp suất giảm Kiểm tra SKLM cho thấy tủa của phân đoạn trùng nên gộp chung Tinh khiết hóa cách kết tinh MeOH và thu hợp chất có bột màu trắng, đặt tên IH6 (khối lượng 70 mg) - IH6 kiểm tra độ tinh khiết với hệ dung môi khác mỏng silicagel ba hệ dung môi CF-MeOH (90:10), EA EA-MeOH (7:3) - Kết quả: IH6 không phát huỳnh quang UV 365 nm, không phát quang UV 254 nm cho với thuốc thử vanilun sulfuric màu tím Kết tinh khơng tan dichlometan, methanol, tan methanol nóng 14 3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.3.1 Xác định cấu trúc IH1 IH1 phân lập từ cao EA, dạng kết tinh màu vàng nhạt, tan chloroform, ethyl acetat, tan tốt methanol Trên SKLM cho thấy IH1 tắt quang UV 254 nm, phát quang UV 365 nm, hiện màu tím với thuốc thử VS - Kiểm tra độ tinh khiết IH1 vết CL1 (caffeat ethyl) tách phân đoạn CHCl3 sắc ký lớp mỏng mỏng silicagel, chạy khai triển với ba hệ dung môi CF EA (8:2), Cf-MeOH (9:1) EA Kết quả: hệ dung môi, IH1 đều cho vết gọn sắc ký đồ IH1 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm, cho vết màu tím với thuốc thử VS trùng với CL1 Như kết luận IH1 caffeat ethyl - Phổ MS: Phổ MS của IH1 cho tín hiệu ion m/z [M-H]- = 207,39 cho phép nhận định khối lượng phân tử 208, kết hợp phổ 13C-NMR có 11 tín hiệu phổ 1H-NMR có 12 tín hiệu công thức phân tử phù hợp C11H12O4 (Ω = 6) Kết luận: IH1 ethyl caffeat 3.3.2 Xác định cấu trúc IH2 - IH2 dạng kết tinh màu vàng nhạt tan chloroform, ethyl acetat, tan tốt methanol IH2 tắt quang UV 254 nm, không phát quang với UV 365 nm âm tính với thuốc thử VS - Phổ MS - Phổ MS của IH2 cho tín hiệu ion m/z [M-H]+ = 143,45 cho phép nhận định khối lượng phân tử 142 Vì khối lượng IH2 (2,5mg) nên khơng thể tiến hành đo phổ NMR để xác định cấu trúc 3.3.3 Xác định cấu trúc IH3 - IH3 dạng kết tinh màu vàng nhạt, tan chloroform, ethyl acetat, tan tốt methanol IH3 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm, âm tính với thuốc thử VS - Phổ MS: Phổ MS của IH1 cho tín hiệu ion m/z [M-H]- = 177,34 cho phép nhận định khối lượng phân tử 178, kết hợp phổ 13C-NMR có tín hiệu cơng thức 15 phân tử dự đoán là C9H6O4 (Ω = 7) - Quan sát phổ 13C-NMR của IH3, có tín hiệu vùng δC 140 -160 ppm tín hiệu vùng δC 100 - 120 ppm Có tín hiệu δC 160,7 ppm tín hiệu nhóm –COO-, tín hiệu δC 150,3 148,4 ppm tín hiệu của liên kết với oxy >C-OH nhân thơm - Phổ 1H-NMR, có tín hiệu khoảng δH 6,17; 7,87; 6,87 6,73 ppm tín hiệu của H vịng thơm Kết hợp với liệu phổ HMBC, COSY, cấu trúc của IH3 xác định esculetin Hình 3.6 Cấu trúc hóa học tương quan HMBC, COSY IH3 Tương tác H-H COSY Tương tác H-C HMBC Bảng 3.6 Bảng so sánh phổ NMR IH3 esculetin Thứ tự C Esculetin [12] (DMSO-d6,400 MHz) IH3 (DMSO-d6,500 MHz) (C ppm) (H ppm) m (J, Hz) HMBC COSY 160.71 (C ppm) (H ppm) 160.8 111.45 6.17 (1H; d; 9,5Hz) 144.36 7.87 (1H; d; 9,5 Hz) 112.28 6.97 (1H; s ) C10 H3/H4 111.5 6.1 (1H; d; 9,6 Hz) C5, C9, C2 H3/H4 144.5 7.81(1H; d; 9,6 Hz) 112.3 6.94 (1H; s) C4, C9 142.81 142.9 150.33 150.4 102.59 1H 6.73 (1H; s) C10, C6, C9 102.6 6.7 s (1H; s) 16 10 148.44 148.5 110.7 C11 110.8 -OH (C6-OH) -OH (C7-OH) 9,37 s (1H) 10,08 s (1H) Kết luận: IH3 esculetin 3.3.4 Xác định cấu trúc IH4 IH4 tinh thể màu trắng ngà, tan tốt methanol, ethanol, ethyl acetat, cho phản ứng dương tính với FeCl3 Phổ MS của IH4 cho tín hiệu ion m/z [M-H]- = 179,48 Do khối lượng phân tử của IH4 180, kết hợp phổ 13C-NMR có tín hiệu cơng thức phân tử C9H8O4 Dữ liệu phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT của IH4 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của carbon, gồm carbon bậc IV, nhóm carbon bậc III (>CH-), có nhóm carbonyl Độ bất bão hòa của cấu trúc chứng tỏ cấu trúc có vịng thơm, nối đơi nhóm methylen nhóm carbonyl Phổ 1H-NMR tín hiệu proton lớn vùng δH 12,08 ppm nên tín hiệu nhóm -OH của COOH tín hiệu proton vùng δH 9,49 ppm δH 9,09 ppm tín hiệu nhóm –OH nối vịng thơm Kết hợp với liệu phổ HMBC, COSY, cấu trúc của IH4 acid caffeic Tương tác H-H COSY Tương tác H-C HMBC Hình 3.7 Cấu trúc hóa học tương quan HMBC, COSY IH4 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR (DMSO-d6, 500 MHz) IH4 17 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh C (C ppm) 125,7 - 114,6 7,02 (1H, d; Hz) 148,1 - 145,5 - 115,7 6,75 (1H; Hz) C1, C4, C3 121,1 6,96 (1H;dd; 2; Hz) C2, C1’, C4 1’ 144,5 7,41 (1H; d; 16 H z) C6, C2,C1 H1’/H2’ 2’ 115,1 6,16 (1H; d; 16Hz) C3’, C1 H2’/H1’ 3’ 167,8 - -OH -COOH 12,08 -OH C3-OH 9,49 -OH C4OH 9,09 1H (C ppm), m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY C6, C1’, C4, C3 3.3.5 Xác định cấu trúc IH5 IH5 bột màu đỏ, tan tốt methanol, ethyl acetat IH5 tắt quang với UV 254 nm, phát quang với UV 365 nm, cho vết màu nâu với thuốc thử VS Phổ MS của IH5 cho tín hiệu ion m/z [M-H]- = 311,26 Do khối lượng phân tử của IH5 312 Dữ liệu phổ 13C-NMR cho thấy 17 tín hiệu, tín hiệu carbon bậc III tín hiệu carbon bậc IV Trong tín hiệu carbon bậc IV, có tín hiệu δC 169,5 ppm tín hiệu của >COO-, tín hiệu δC 155,0; 148,6; 148,0; 145,7; 145,6 ppm tín hiệu của liên kết với oxy >C-OH nhân thơm Việc xác định cấu trúc IH5 tiếp tục 3.3.6 Xác định cấu trúc IH6 IH6 bột màu trắng, tan DMSO, methanol nóng IH6 không phát huỳnh quang UV 365 nm, không phát quang UV 254 nm cho với thuốc thử vanilun sulfuric màu tím Việc xác định cấu trúc IH6 tiếp tục 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh IV KẾT LUẬN Sau thực hiện đề tài thu kết sau: - Với kg dược liệu khô, sau chiết cồn 50 % cô thu hồi dung môi, thu 1,14 kg cao cồn toàn phần Phân bố lỏng – lỏng qua dung mơi có độ phân cực tăng dần, thu cao n-hexan có lẫn nhiều dầu béo (40,7 g), cao chloroform (23,3 g), cao etyl acetat (32,1 g), cao n-butanol (16,4 g) Từ 25 g cao ethyl acetat, phương pháp sắc ký cột nhanh, cột cổ điển, cột sephadex LH - 20 phân lập hợp chất 420,3 mg IH1; 2,5 mg IH2; 8,0 mg IH3, 285,3 mg IH4; 7,0 mg IH5 70 mg IH6 Qua biện giải liệu phổ (MS, NMR) với việc so sánh tài liệu tham khảo, hợp chất phân lập xác định ethyl caffeat (IH1), esculetin (IH3), acid caffeic (IH4) IH5 và IH6 tiếp tục 19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – Đại học Y Dược TP HCM (2007), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, trang 25 – 50 Bộ Y tế (2010), “Dược điển Việt Nam IV”, NXB Y học Hà Nội Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tập 1, tr 166-167 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 444-446 Viện dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học kỹ thuật TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abou-Chaar C I et al (1996), “Alkaloids of an Ipomoea seed commonly known as Kaladana in Pakistan” Lebanese Pharm J 9, pp 93-109 Ahmad, M et al (2011), “Determination of LD50 and ED50 by dose response relationship and assessment of toxicological and non toxicological behaviour of Ipomoea hederacea” J Pharm Res., (4), pp 1176–1178 A V Badarinath, K Mallikajuna Rao et al, (2010), “Corrections and considerations”, International Journal of PharmTech Research, 2, pp 1276-1285 Atolovich M.P.D Prenzler et al, (2002), “Methods for testing antioxidant activity”, Analyst, 127, pp 183-198 10 Jung D Y et al (2008), “Triterpenoid saponins from the seeds of pharbitis nil”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 56 (2), pp 203-206 11 Kim K H et al (2011), “Bioactive phenolic constituents from the seeds of Pharbitis nil”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 59 (11), pp 1425-1429 12 Kim K H et al (2014), “Identification of Antitumor Lignans from the Seeds of Morning Glory (Pharbitis nil)” journal of agricultural and food chemistry 62 (31), pp 7746-7752 13 Li, L., L.-W Xu, Y.-F Jiang, C.-J Xi, H.-Q Wang and Y.-R Suo (2004), "Isolation, characterization and crystal structure of natural eremophilenolide from Ligularia sagitta", Zeitschrift für Naturforschung B, 59 (8), pp 921-924 14 Meira, M et al (2012), “Review of the genus Ipomoea: Traditional uses, chemistry and biological activities”, Revista Brasileira de Farmacognosia, 22 (3), pp 682–713 15 Miller, J.H et al (2005) Forest Plants of the Southeast and Their Wildlife Uses, University of Georgia Press 16 Nasir, E.; Ali, S.I (1995), Flora of Pakistan; Shamim Printing Press: Karachi, Pakistan 20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 17 Pham-Huy L A et al (2008), "Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health",International Journal of Biomedical Science : IJBS, (2), pp 89-96 18 Saied S (2005), studies in the chemical constituents of Murraya paniculata and Ipomoea hederacea, University of Karachi, Karachi 19 Shahzaman M A A et al (2011), “Ipomoea hederacea: an Imperative Source for Natural Antioxidants”, Asian J Pharm Biol Res (4), pp 5-6 20 Singh B et al (2012), “Chemical investigation of seed of Ipomoea hederacea and its biological activity”, J Chem Pharm Res 4, pp 1441-1448 21 Takhtajan A (2009), Flowering Plants, Springer 2nd Ed, pp 534 22 Xiang, M., H Su, J Hu and Y Yan (2011), "Isolation, identification and determination of methyl caffeate, ethyl caffeate and other phenolic compounds from Polygonum amplexicaule var sinense", Journal of Medicinal Plants Research, (9), pp 1685-1691 23 Yashpal K et al (1947), “Chemical examination of the fixed oil from Ipomoea hederacea”, Ind Soap J 13, pp 77-80 24 Zia-Ul-Haq M et al (2011), “Antimicrobial screening of selected flora of Pakistan”, Archives of Biological Science.63 (3), pp 691-695 Tiếng Pháp 25 Lecomte, H et Humbert, et al (1907 - 1952), Flore générale de l'Indo-chine., I - VII, et suppléments, Masson et Cie, Editeurs, Paris 21 ... TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC TRUNG BÌNH CỦA HẠT BÌM BÌM BIẾC (IMPOMOEA HEDERACEA JACQ CONVULVULACEAE) Chủ nhiệm đề tài:... phân lập từ hạt Bìm bìm biếc Với giá trị sử dụng vậy, việc khảo sát tác dụng sinh học nghiên cứu phân lập hoạt chất từ hạt Bìm bìm biếc cần thiết Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập vài hợp chất. .. hoạt chất toàn phần EtOH - Phân tách cao cồn thành phân đoạn đơn giản phương pháp phân bố lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần - Phân lập vài hợp chất phân đoạn phân cực trung bình