Nghiên cứu hóa học và phân lập một vài hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat của thổ phục linh (smilax glabra roxb liliaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA THỔ PHỤC LINH (SMILAX GLABRA ROXB LILIACEAE) Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đơng Phương Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HĨA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA THỔ PHỤC LINH (SMILAX GLABRA ROXB LILIACEAE) Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Đông Phương Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 2.1 Nguyên vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu…… 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………….2 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………………….4 3.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn……………………………4 3.2 Phân lập tủa EA……………………………………………………7 3.3 Phân lập cao EA SKC nhanh HPLC………………………7 3.4 Xác định độ tinh khiết chất phân lập được……………………8 3.5 Xác định cấu trúc……………………………………………… 10 III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………… 19 IV TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 20 I ĐẶT VẤN ĐỀ: Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác khơng Việt Nam mà nhiều nước giới, khu vực châu Á để làm thuốc chữa giang mai, đau xương, lợi tiểu, giải độc thể, đặc biệt nhiều bệnh liên quan tới viêm như: viêm gan, viêm thận, viêm da, chàm [10], [13], [53] Mặc dù dùng rộng rãi nhiên Việt Nam, đến chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học tác dụng dược lý của Thổ phục linh Để bổ sung sở khoa học, làm sáng tỏ tác dụng của Thổ phục linh, đề tài “Nghiên cứu phân lập vài hợp chất phân đoạn ethyl acetat của Thổ phục linh Smilax glabra Roxb., Smilacaceae” tiến hành với nội dung sau: - Thu mẫu nghiên cứu thành phần hóa thực vật - Chiết xuất hoạt chất toàn phần EtOH - Phân tách cao cồn thành phân đoạn đơn giản - Phân lập vài hợp chất phân đọan EtOAc II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ngun vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Phần thân rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) thu hái và định danh Dược liệu phơi sấy 50 – 70 oC đến khô Xay thành bột thô 2.1.2 Nguyên liệu, dung mơi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu - Dung môi: cồn 96%, methanol, n-hxan, chloroform, ethylacetat, ether dầu hỏa đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR) 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị: - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; àm) v tiờn ct Sunfire C18 (12,5 ì 4,6 mm; µm) - SKLM dùng silica gel F254 tráng sẵn nền nhôm (Merck, Art 1.05554) - SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn (Merck) cỡ hạt 15- 40µm) Máy quay Buchi R300 (Nhật Bản) Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức) Tủ sấy Gallentkamp (Anh) Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức) Cột sắc ký dụng cụ thí nghiệm thơng thường phịng thí nghiệm của Bộ mơn Dược liệu Phịng nghiên cứu hóa hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo nghiên cứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH Y Dược Tp HCM - Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters) - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam - Hà nội - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 ì 4,6 mm; àm) v tiờn ct Sunfire C18 (12,5 ì 4,6 mm; àm) - Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng máy HPLC 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thu hái định danh mẫu: khảo sát đặc điểm hình thái, định danh mẫu, lưu mẫu Bộ môn Dược liệu – khoa Dược – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2.2.1 Xác định độ tinh khiết - Xác định độ ẩm: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.6, PL-182 - Xác định tro tồn phần tro khơng tan HCl: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 9.8 phụ lục 9.7., phương pháp 2.2.2 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật: Theo phương pháp Ciuley cải tiến 2.2.3 Chiết xuất và phân tách phân đoạn - Chiết xuất: bột rễ Thổ phục linh chiết ngấm kiệt với cồn, thu hồi dung môi để cao lỏng Lắc phân bố cao lỏng với dung mơi có tính phân cực tăng dần n-hexan, CHCl3, ethyl acetat, n-BuOH phần cịn lại khơng phân bố vào dung mơi Bay dung môi để thu cao tương ứng - Kiểm tra cao chiết SKLM 2.2.4 Phân lập, kết tinh kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 2.2.4.1 Phân lập SKC cổ điển Điều kiện SK: - Cột sắc ký: x 40 cm - Pha tĩnh: 100 g silica gel kích thước hạt hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck) - Mẫu: g tủa EA - Dung môi khai triển: cloroform-methanol, gradient từ 100-0 đến 95-5 - Thể tích hứng ống nghiệm: 10 ml - Hệ dung môi cho SKLM kiểm tra phân đoạn: cloroform –methanol –acid formic (8,5:2:0,5) 2.2.4.2 SKC nhanh cao EtOAc Điều kiện SK: - Cột sắc ký: x 50 cm - Pha tĩnh: silica gel hạt trung bình: (40-63 µm, Merck), khối lượng: 1000 g - Mẫu: 45 g cao EtOAc - Dung môi khai triển: ethyl acetat-methanol Tăng dần tỉ lệ methanol từ 0% - 15% - Thể tích lọ hứng: 80 ml - Kiểm tra phân đoạn SKLM, hệ dung môi: ethyl acetat–methanol–acid acetic 9:0,5:0,5 - Kiểm tra gộp phân đoạn: hứng phân đoạn, kiểm tra SKLM, phát hiện đèn UV 254 nm, UV 365 nm TT VS Các phân đoạn gần giống gộp chung lại, thu hồi dung môi áp suất giảm (cô quay chân không) 2.2.4.3 Phân lập HPLC Điều kiện SK: - Hệ thống sắc ký: máy sắc ký điều chế Waters 2767, đầu dò PDA 2996 - Cột sắc ký: cột bán điều chế Sunfire C18 (10 x 150 mm; μm) tiền cột C18 (10 x 10 mm; μm) - Nhiệt độ cột: 25 oC - Mẫu thử: tủa phân đọan cao EtOAc hòa tan lượng tối thiểu MeOH, lọc qua màng 0,45μm - Thể tích tiêm: 150 μL - Tốc độ dịng: 3,5 ml/phút - Bước sóng phát hiện: 295 nm - Pha động: nước (A) - methanol (B) - Chương trình rửa giải: nước - methanol (55 : 45) thời gian 22 phút - Tinh chế: Các phân đoạn sau cô quay kết tinh hay kết tinh phân đoạn lượng tối thiểu dung mơi thích hợp (có gia nhiệt) Kiểm tra chất kết tinh SKLM với hệ dung môi khác 2.2.5 Kiểm tra độ tinh khiết: 2.2.21 Kiểm tra độ tinh khiết SKLM - Thực hiện mỏng silica gel tráng sẵn với hệ dung môi sau: - Cloroform-methanol-acid acetic (8:1,5:0,5) - Ethyl acetat-methanol-acid acetic (9:0,5:0,5) - n-Butanol-methanol (8:2) 2.2.5.2 Kiểm tra độ tinh khiết UPLC - Mẫu pha dung môi methanol, nồng độ 0,1 mg/ml - Thiết bị sắc ký: Máy UPLC ACQUITY HCLASS - Waters, đầu dị PDA 2998 Cột UPLC BEH C18 1,7 µm; 2,1 × mm Nhiệt độ cột: 25 oC - Thể tích tiêm: µl Tốc độ dịng: 0,2 ml/phút - Pha động: acid formic 0,1% - MeOH (tỉ lệ khởi đầu 95:5 đến kết thúc 0:100) - Thời gian phân tích: 60 phút với mẫu SG01 SG05, 30 phút với SG02 2.2.6 Xác định cấu trúc chất phân lập Chất tinh khiết phân tích phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với liệu về phổ NMR, MS của chất tương tự công bố tài liệu Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo máy BRUKER – AV – 500, Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội Mẫu hòa tan CD3OD CD3COCD3 với TMS chất chuẩn nội Phổ proton (1H-NMR) đo 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) đo 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn tín hiệu của TMS Các số ghép (J) tính Hertz (Hz) III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết xuất và phân tách phân đoạn kg dược liệu chiết ngấm kiệt cồn 96%, thu hồi dung môi để cao lỏng chiết phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần, bao gồm: ether dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, n-butanol phần cịn lại khơng tan vào dung mơi Cô thu hồi dung và thu cao tương ứng Với phân đoạn EtOAc, thu bớt dung mơi, để nguội có xuất hiện tủa, lọc lấy riêng tủa (gọi tủa EA), phần dịch lọc cô đến cao cao EA Với phân đoạn không tan vào dung môi trên, bay bớt dung mơi và để nguội có xuất hiện tủa, lọc lấy tủa (gọi tủa N1) Dịch lọc cô đến cao, gọi cao N2 Kết chiết xuất phân lập đựơc trình bày sơ Bảng 3.1 Hình 3.1 Bảng 0.1 Các cao phân đoạn Thổ phục linh Cao Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Ether dầu hỏa Cao ether dầu hỏa 20,4 12,15 Chloroform Cao CF 8,4 13,83 EtOAc Tủa EA 14 7,51 Cao EA 679 15,32 n-butanol Cao n-butanol 130 13,76 Phần cịn lại, khơng tan dung môi Cao N1 500 16,5 Cao N2 750 17,5 Dịch chiết Dược liệu + EtOH - Chiết ngấm kiệt Dịch chiết cồn 96% - Cô dung môi Cao lỏng - loại ether dầu hỏa + ether dầu hỏa Dịch chiết ether Cao ether Cao lỏng + cloroform - loại cloroform Dịch chiết CF Cao CF Cao lỏng + ethyl acetat - loại ethyl acetat Dịch chiết EA Cao EA tủa EA Cao lỏng + n-butanol Dịch chiết n-butanol - loại n-butanol Cao n-butanol Tủa Để lắng, lọc Dịch lỏng Cô dung môi Cao nước Hình 0.1 Sơ đồ chiết xuất phân bố cao cồn 96% 3.2 Phân lập tủa EA Tủa EA tiến hành sắc ký cột cổ điển với điều kiện phần Phương pháp nghiên cứu Kết quả: Thu phân đoạn Ở phân đoạn có xuất hiện kết tinh trắng, đặt tên SG01 (560 mg) Kiểm tra UPLC thấy SG01 chưa tinh khiết Tiếp tục tinh chế sắc ký lỏng bán điều chế với điều kiện phần Phương pháp nghiên cứu Tiến hành chạy lặp lại nhiều lần cột HPLC điều chế điều kiện Phân đoạn chứa SG01 cô chân không, đông khô kết tinh lại 20 mg hợp chất SG01 tinh khiết 3.3 Phân lập cao EA SKC nhanh HPLC Tiến hành với điều kiện phần Phương pháp nghiên cứu Kết thu phân đoạn, phân đoạn dung mơi có xuất hiện tủa, lọc lấy tủa (500 mg) Kiểm tra tủa cho thấy chưa phải chất tinh khiết nên phân lập tiếp HPLC điều chế với điều kiện sắc ký sau: - Hệ thống sắc ký: máy sắc ký điều chế Waters 2767, đầu dò PDA 2996 - Cột sắc ký: cột bán điều chế Sunfire C18 (10 x 150 mm; μm) và tiền cột C18 (10 x 10 mm; μm) - Nhiệt độ cột: 25 oC - Mẫu thử: tủa phân đoạn của SKC nhanh, hòa tan lượng tối thiểu MeOH, lọc qua màng 0,45μm - Thể tích tiêm: 150 μL - Tốc độ dòng: 3,5 ml/phút - Bước sóng phát hiện: 295 nm - Pha động: nước (A) - methanol (B) - Chương trình chạy: isocratic nước - methanol (55 : 45) 22 phút Tiến hành chạy nhiều lần cột HPLC điều chế điều kiện Dịch thu được, cô bớt dung môi, đông khô và kết tinh lại, thu 12 mg hợp chất đặt tên SG02 15 mg hợp chất SG05 Bảng 0.2 Độ tinh khiết SG01 Độ tinh khiết của SG02 HPLC cho kết Hình 3.3 và Bảng 3.3 Hình 0.3 Sắc ký đồ SG02 Bảng 0.3 Độ tinh khiết SG02 Kiểm tra độ tinh khiết SG05 UPLC cho kết Hình 3.4 và Bảng 3.4 Hình 0.4 Sắc ký đồ SG05 Bảng Độ tinh khiết SG05 3.5 Xác định cấu trúc 3.5.1 Xác định cấu trúc SG01 - Phổ UV: SG01 cho đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 205,8 nm 289,9 nm Hình 3.5 Phổ UV SG01 10 - Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG1 cho phân mảnh [M+Na] với m/z 473,1 tương ứng với phân tử khối là 450 đvC Hình 3.6 Phổ MS SG01 - Phổ NMR Phổ 13C-NMR (PL-2) kết hợp phổ DEPT (PL-3): có 21 tín hiệu cacbon, có cacbon bậc IV, 12 cacbon methin (-CH) nhóm methyl (-CH3) 12 tín hiệu của vịng benzen nằm vùng C 96,2 – 168,6 ppm; nhóm cacbonyl (C=O) C 195,9 ppm nhóm oxymethin C 83,9 78,5 ppm, dự báo khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6 Bên cạnh cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1 nhóm methyl vùng trường cao C 17,8 ppm, carbon CH-O quanh C 70 ppm, carbon anome C 102,1 ppm C-1” của đường bị glycosid hóa) Trên phổ proton 1H-NMR (PL-1) của SG01, kết hợp với phổ COSY (PL-6), HSQC (PL-4): có hiện diện của proton của vòng benzen Tín hiệu proton benzen δH 5,94 ppm (d; J = 2,5 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 5,92 ppm (d; J = Hz) Tín hiệu proton benzen δH 6,87 ppm (dd J =2 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 4,08 ppm (d; J = 1,5 Hz) ghép cặp ortho với proton benzen δH 46,83 ppm (d J = Hz) Tín hiệu của proton H-2, H-3 doudlet δH 5,09 ppm (d, J = 10,5; 1H) và δH 4,59 ppm (d, J = 11 Hz), với số tương tác lớn thể hiện proton vị trí khác phía so với mặt phẳng phân tử H-1” HMBC (PL-5) quan sát thấy C-3, đường tạo liên kết glycosid với OH C-3; H1” J = 1,5 Hz, số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial OH-1” và OH-2” là liên kết axial Cũng HMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, vịng B gắn vào C-2 Từ thực nghiệm đối chiếu tài liệu tham khảo, xác định SG01 là astilbin 11 Hình 0.7 Cấu trúc SG01 Bảng 0.7 Các liệu phổ NMR SG01 SG01 Astilbin (CD3OD, 500 MHz) (CD3OD, 500 MHz) [43] Stt C (ppm) H (ppm) COSY HMBC C (ppm) H (ppm) 83,9 5,09 d (10,5), 1H H3 4, 1’, 6’, 3, 2’ 83,9 5,10 d (10,5), 1H 78,5 4,59, d (11), 1H H2 4, 1’, 2, 1” 78,5 4,60 d (10,5), 1H 195,9 - - - 195,9 - 165,5 - - - 165,5 - 97,3 5,94, d (2,5), 1H - 8, 7, 5, 10 97,4 5,94 d (2), 1H 168,6 - - - 168,5 - 96,2 5,92 d (2), 1H - 6, 7, 9, 10 96,2 5,92 d (2), 1H 164,1 - - - 164,1 - 10 102,5 - - - 102,5 - 1’ 129,1 - - - 129,2 - 2’ 115,5 6,97, d (2), 1H - 2, 6’, 4’ 115,5 6,98 d (2), 1H 3’ 146,5 - - - 146,5 - 12 4’ 147,3 - - - 147,3 - 5’ 116,3 6,83, d (8), 1H - 1’, 3’ 116,3 6,83 d (8), 1H 6’ 120,4 6,87 dd (2; 8), 1H - 1’, 4’, 2’, 120,5 6,86 dd (2; 8), 1H 1” 102,1 4,08, d (1.5), 1H H2” 3, 5”, 2”, 3” 102,1 4.07 d (1,5), 1H 2” 71,7 3,56, m, 1H H3”, H1” 3” 71,7 3,56 dd (1,5; 3), 1H 3” 72,1 3,68, dd (3; 9,5) 1H H4”, H2” 4” 72,1 3,68 dd (3; 9,6), 1H 4” 73,8 3,33, m, 1H H5”, H3” 2”, 3” 73,8 3,30 m, 1H 5” 70,5 4,28, m, 1H H6”, H4” 1” 70,5 4,28 dq (6; 9,6), 1H 6” 17,8 1,21, d (6), 3H H5” 5”, 4” 17,8 1,21 d ( 6), 3H 3.5.2 Xác định cấu trúc SG02 - Phổ UV: phổ UV, SG02 cho hấp thu cực đại 199 295 nm Hình 0.8 Phổ UV SG02 - Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG02 cho phân mảnh [M+Na] với m/z 457,1 tương ứng với phân tử khối 434 đvC Hình 0.9 Phổ MS SG02 13 - Phổ NMR Phổ 13C-NMR (PL-8) phổ DEPT (PL-9) cho biết có tổng số 19 tín hiệu carbon, tín hiệu C 130,0 116,4 ppm có cường độ tăng gấp đơi so với tín hiệu cacbon khác thể hiện có đối xứng cấu trúc phân tử, kết luận có tổng số 21 carbon, gồm cacbon bậc 4, 13 nhóm methin (-CH), nhóm methyl (CH3) 12 tín hiệu carbon benzen nằm vùng C 95,1 – 167,1 ppm; nhóm cacbonyl (-C=O) C 192,8 ppm nhóm oxymethin C 80 73 ppm, dự báo khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6 tín hiệu carbon đối xứng cách 13,6 ppm, thể hiện vịng B có nhóm Bên cạnh cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1 nhóm methyl vùng trường cao C 17,6 ppm, carbon CH-O quanh C 70 ppm, carbon anome C 98,5 ppm C-1” của đường bị glycosid hóa) Trên phổ proton 1H-NMR (PL-7) của SG02, kết hợp với phổ COSY (PL-12), HSQC (PL-10): có hiện diện của proton của vịng benzen Tín hiệu proton benzen δH 5,95 ppm (d; J = Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 5,92 ppm (d; J = Hz) Tín hiệu proton benzen δH 6,75 ppm (d J =2 Hz; 2H) ghép cặp meta với proton benzen δH 7,25 ppm (d; J = 2Hz; 2H) Tín hiệu của proton H-2, H-3 doudlet δH 5,61 ppm (d, J = 10,5; 1H) và δH 4,17 ppm (d, J = 11 Hz), với số tương tác bé thể hiện proton vị trí phía so với mặt phẳng phân tử H-1” HMBC (PL-11) quan sát thấy C-3, đường tạo liên kết glycosid với OH C-3; H-1” J = 1,5 Hz, số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial OH-1” và OH-2” là liên kết axial Cũng HMBC, H-2’ H-6’ quan sát thấy C-2, vịng B gắn vào C-2 Từ thực nghiệm, đối chiếu tài liệu tham khảo [26], [46], xác định SG02 là isoengeletin 14 Hình 0.10 Cấu trúc SG02 Bảng 0.8 Phổ NMR SG02 Isoengeletin SG02 (DMSO-d6, 300 MHz) [26], [46] (DMSO-d6, 500 MHz) Stt C (ppm) H (ppm) COSY HMBC C (ppm) H (ppm) 80,0 5,61 d (2,5) 1H H-3 C-2’, C-6’, C-1’ 80,1 5,60 br s 73,0 4,17 d (2,5), 1H H-2 C-4, C-1” 73,2 4,16 br s 192,8 - - - 192,9 - 164,0 - - - 164,1 - 96,2 5,92 d (2,0) 1H - C-7; C-5, C10, C8 96,3 5,92 d (2) 167,1 - - - 167,2 - 95,1 5,95 d (2,0) 1H - C-7, C-9, C10, C6 95,3 5,94 d (2) 162,6 - - - 162,7 - 10 100,1 - - - 100,3 - 1’ 125,8 - - - 125,9 - 2’ 127,8 7,25 d (8,5) 2H H3’ C-2, C-6’, C-4’ 127,9 7,24 d (8,3) 3’ 114,8 6,75 d (8,5), 2H H2’ C-4’, C-1’, C-5’ 114,9 6,74 d (8,3) 4’ 157,2 - - - 157,3 - 15 5’ 114,8 6,75 d (8,5), 2H H6’ C-4’, 1’, C-3’ 114,9 6,74 d (8,3) 6’ 127,8 7,25 d (8,5) 2H H5’ C-2, C-2’, C-4’ 127,9 7,24 d (8,3) 1” 98,5 4,75 d (1,5), 1H H-2” C-5”, C-3 98,7 4,78 d (1,5) 2” 70,22 3,45 m 1H H-1”, H-3” - 3” 70,15 3,17 m 1H H-4”, H-2” - 4” 71,11 3,03 m 1H H-5”, H-3” - 5” 68,91 2,34 m 1H H-4”, H-6” - 6” 17,6 0,80 d (6,5) 3H H-5” - Ghi chú: Có khơng tác giả trình bày tài liệu tham khảo 3.5.3 Xác định cấu trúc SG05 Phổ UV: SG05 cho hấp thu 205 và 294 nm Hình 0.11 Phổ UV SG05 - Phổ MS: Trên phổ MS (ESI+), SG05 cho phân mảnh [M-Na]+ với m/z 473,1 tương ứng với PTK là 450 đvC Hình 0.22 Phổ MS SG05 16 - Phổ NMR Phổ 13C-NMR (PL-14) kết hợp phổ DEPT (PL-15): có 21 tín hiệu cacbon, có cacbon bậc IV, 12 cacbon methin (-CH) nhóm methyl (-CH3) 12 tín hiệu của vịng benzen nằm vùng C 95,1 – 167,04 ppm; nhóm cacbonyl (C=O) C 193,05 ppm nhóm oxymethin C 73,3 79,9 ppm, dự báo khung cấu trúc flavonoid (C6-C3)-C6 Bên cạnh cũng thấy dấu hiệu của đường rhamnose (1 nhóm methyl vùng trường cao C 17,5 ppm, carbon CH-O quanh C 70 ppm, carbon anome C 98,8 ppm C-1” của đường bị glycosid hóa) Trên phổ proton 1H-NMR (PL-13) của SG02, kết hợp với phổ HSQC (16): có hiện diện của proton của vịng benzen Tín hiệu proton benzen δH 5,94 ppm (d; J = Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 5,91 ppm (d; J = Hz) Tín hiệu proton benzen δH 6,73 ppm (dd J =2 Hz) ghép cặp meta với proton benzen δH 4,75 ppm (d; J = 1,5 Hz) ghép cặp ortho với proton benzen δH 6,71 ppm (d J = 8,5 Hz) Tín hiệu của proton H-2, H-3 doudlet δH 5,54 ppm (d, J = 2,5 Hz) và δH 4,21 ppm (d, J = 2,5 Hz), với số tương tác bé thể hiện proton vị trí phía so với mặt phẳng phân tử H-1” HMBC (PL-17) quan sát thấy C-3, đường tạo liên kết glycosid với OH C-3; H-1” J = 1,5 Hz, số tương tác nhỏ chứng tỏ H-1” và H-2” là liên kết equatorial OH1” và OH-2” là liên kết axial Cũng HMBC, H-2’ và H-6’ quan sát thấy C-2, vịng B gắn vào C-2 Từ thực nghiệm đối chiếu với tài liệu tham khảo, xác định SG05 là isoastilbin Bảng 0.9 Phổ NMR SG05 (SG05 DMSO-d6, 500 MHz) Isoastilbin, DMSO-d6 400 MHz [37] Stt C (ppm) H (ppm) HMBC C (ppm) H (ppm) 79,9 5,54 d (2,5) 1H 9, 1’, 6’, 2’ 79,9 5,53 d (2,6) 73,3 4,21 d (2,5) 1H 4, 1” 73,3 4,22 d (2,6) 193,0 - - 192,6 - 163,9 - - 163,7 - 17 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 96,1 5,91 d (2) 1H 8, 10 96,2 5,93 d (2) 167,0 - - 167,4 - 95,1 5,94 d (2) 1H 6, 10 95,2 5,90 d (2) 162,4 - - 162,4 - 10 100,2 - - 100,1 - 1’ 126,3 - - 126,4 - 2’ 114,1 6,84 d (2) 1H 2, 6’, 4’ 114,1 6,86 d (1,6) 3’ 144,9 - - 144,8 - 4’ 145,1 - - 145,1 - 5’ 115,0 6,71 d (8,5) 1H 3’ 115,0 6,71 d (8,3) 6’ 117,5 6,73 dd (2; 8) 1H 4’, 2’, 1’, 117,5 6,73 dd (8,3; 1,6) 1” 98,8 4,75 d (1,5) 3, 5” 98,8 4,78 d (1,4) 2” 70,20 3,47 m 1H - 70,2 3,48 dd (3,4; 1,4) 3” 70,23 3,19 m 1H - 70,2 3,21 dd (9,4; 3,4) 4” 71,2 3,05 m 1H - 71,4 3,05 dd (9,4; 9,4) 5” 68,9 2,46 dd (6,5; 9,5) 1H - 68,8 2,50 overlapped 6” 17,5 0,84 d (6,5) 3H - 17,5 0,85 d (6,2) Hình 0.1.3 Cấu trúc SG05 18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 19 IV KẾT LUẬN Đề tài đạt kết sau: - Sơ thành phần hóa học, xác định thân rễ Thổ phục linh có chứa triterpenoid tự do, flavonoid, saponin, acid hữu và chất khử - Từ kg dược liệu chiết xuất cồn 96% phân lập chất tinh khiết: SG01 (astilbin, 20 mg), SG02 (isoengeletin, 12 mg) và SG05 (isoastilbin, 15 mg) chất báo cáo cơng trình nghiên cứu của nước ngoài isoengeletin isoastilbin lần báo cáo nước từ Thổ phục linh Lâm Đồng 19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh (2013), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr 25 – 50 [2] Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam, Nhà xuất y học, Chuyên luận dược liệu Thổ phục linh [3] Nguyễn Tiến Bân cộng (2003), Danh mục loài thực vật Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Tập 3, tr 465 – 468 [4] Đỡ Huy Bích và cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, 3, tr 883-886 [5] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 999 [6] Trần Thị Thanh Hằng (2010), Nghiên cứu thành phần hoá học Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.), họ Smilacaceae Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ hóa học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên, Thái Nguyên [7] Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ TP HCM, 1993, Q3, Tập 3, tr 486 – 494 [8] Mai Hương (2013), Nghiên cứu họat tính sinh học thành phần hóa học rễ thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) Việt Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Hà Nội [9] Nguyễn Thị Lan (2015), Nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng ức chế enzym αglucosidase phân đoạn dịch chiết n-hexan từ rễ củ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall Ex Roxb.), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học dược Hà Nội, Hà Nội [10] Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 498-499 [11] Đào Văn Phan và cộng (2003), “Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của Thổ Phục Linh (Smilax glabra Roxb., Liliaceae) thỏ”, Tạp chí nghiên cứu y học, 24(4), tr 15-19 [12] Đào Văn Phan và cộng (2004), “Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) súc vật thử nghiệm”, Tạp chí nghiên cứu y học phụ bản, 32(6), tr 6975 [13] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học, Nhà xuất Y học, tr 271-273 [14] Trịnh Thị Thanh Vân cộng (2015), “Nghiên cứu điều chế chế phẩm chống oxi hóa từ rễ thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) của Việt Nam, Vietnam journal of chemistry, 53(1) [15] Nguyễn Ngọc Xuân cộng (2003), “Ảnh hưởng của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) nồng độ glucose insulin máu chuột cống đái tháo đường di truyền chủng GK đảo tụy cô lập”, Tạp chí nghiên cứu y học, 26(6), tr 17-21 20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 21 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI [16] Armen takhtajan (2009), Flowering Plants second edition, Springer, p.xliv-xlv [17] Atolovich M.P.D Prenzler et al (2002), “Methods for testing antioxidant activity”, Analyst, 127, p.183-198 [18] B Lakshmi Narayannan et al (2012), “Anti-oxidant and anti-inflammatory activity of synthesized (substituted) chromen -2- one”, In ternational journal of pharmaceutical sciences and research, 127, p.183-198 [19] Chen Xinqi et Tetsuo Koyama (2000), Flora of China, 24, p 96–115 [20] Chuan-li Lu et al (2014), “Antioxidant and anti-inflammatory activities of PhenolicEnriched extracts of Smilax glabra”, Evidence-based complementary and alternative medicine [21] Daozong Xia et al (2013), “Protective effects of the flavonoid-rich fraction from rhizomes of Smilax glabra Roxb on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rats”, J Membrane Biol, 246, pp 479–485 [22] Denizot F, Lang R (1986), “Rapid colorimetric assay for cell gorwth and survival Modifiications to this tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability”, J Immunol Methodes, 89, p.493-497 [23] Gunhyuk Park et al (2014), “Antioxidant effects of the sarsaparilla via scavenging of reactive oxygen species and induction of antioxidant enzymes in human dermal fibroblasts”, Environmental toxicology and pharmacology, 38, pp 305-315 [24] Hai-qiang Sang et al (2014), “The protective effect of Smilax glabra extract on advanced glycation end products-induced endothelial dysfunction in HUVECs via RAGE-ERK1/2-NF-κB pathway”, Journal of Ethnopharmacology, volume 155, 1, pp 785-795 [25] Jicheng Shu et al (2015), “Phenylpropanoids and neolignans from Smilax trinervula”, Fitoterapia, 104, pp 64–68 [26] Jing Xu et al (2004), “Antiinflammatory Constituents from the Roots of Smilax bockii warb.”, Arch Pharm Res, Vol 28, No 4, pp 395-399 [27] K.T Chu and T.B Ng (2006), “Smilaxin, a novel protein with immunostimulatory, antiproliferative, and HIV-1-reverse transcriptase inhibitory activities from fresh Smilax glabra rhizomes”, Biochemical and Biophysical Research Communications, pp 118-124 [28] Kamonmas Srikwan and Arunporn Itharat (2014), “Total flavonoid content and antiallergic activity of Smilax glabra root extracts”, 1st Joint ACS AGFD- ACS ICSCT Symposium Thailand, pp 134-137 [29] Linda S M Ooi et al (2004), “New Mannose-Binding Lectin Isolated from the Rhizome of Sarsaparilla Smilax glabra Roxb (Liliaceae)”, Jounal of agricultural and food chemistry, 52 (20), pp 6091–6095 21 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 22 [30] Linda S M Ooi et al (2008),“Antiviral and Anti-proliferative Glycoproteins from the Rhizome of Smilax glabra Roxb (Liliaceae)”, The American Journal of Chinese Medicine, volume 36, Issue 01, 185 [31] Li-Wen Tian et al (2017), “Steroidal Saponins from the Genus Smilax and Their Biological Activities”, Natural Products and Bioprospecting, Volume 7, Issue 4, p 283–298 [32] Lu Chuan-li et al (2014), “Polysaccharides from Smilax glabra inhibit the proinflammatory mediators via ERK1/2 and JNK pathways in LPS-induced RAW264.7 cells” , Carbohydrate PolymerS [33] M H Woo et from the subterranean Parts 55(8), pp 1129 – 1135 al (1992), “Five of Smilax sieboldii”, new spirostanol glycosides Journal of Natural Products, [34] M Statour et al (2006), “Bioactive Steroidal Saponins from Smilax medica”, Planta Medica, 72(7), pp 667 – 670 [35] Marcos Soto-Hernandez et al (2017), Phenolic Compounds in Genus Smilax (Sarsaparilla), Phenolic Compounds - Natural Sources, Importance and Applications [36] Qing-Feng Zhang et al (2009), “Antioxidant activity of Rhizoma Smilacis Glabrae extracts and its key constituent-astilbin”, Food Chemistry, 115, p 297–303 [37] Qizhen Du et al (2005), “Purification of astilbin and isoastilbin in the extract of Smilax glabra rhizome by high-speed counter-current chromatography”, Journal of Chromatography, pp 98-101 [38] R R Bernardo et al (1996), “Steroidal Saponins from Smilax officinalis”, Phytochemistry, 43(2), pp 465 – 469 [39] S Y Li et al (2002), “New Phenolic Constituents from Smilax bracteata”, Journal of Natural Products, 65, pp 262 – 266 [40] Sameera R Samarakoon et al (2012), “Effect of standardized decoction of Nigella sativa seed, Hemidesmus indicus root and Smilax glabra rhizome on the expression of p53 and p21 genes in human hepatoma cells (HepG2) and mouse liver with chemically-induced hepatocarcinogenesis”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11 (1), pp 51-61 [41] Shuo Xu et al (2013), “Chemical constituents from the rhizomes of Smilax glabra and their antimicrobial activity”, Molecules, 18, pp 5265-5287 [42] T Kulisic et al (2004), “Use of different methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil”, Food chemistry, 85 (4), p 633-640 [43] T T V Trinh et al (2015), “Antioxidant Activity of Extracts and Astilbin from the Root of Smilax glabra of Vietnam”, Malaysian Journal of Chemistry, Vol 17, pp 12–19 22 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 23 [44] Tiantian She et al (2015), “Sarsaparilla (Smilax glabra rhizome) extract inhibits cancer cell growth by s phase arrest, apoptosis, and autophagy via redox-dependent erk1/2 pathway”, Cancer prevention research jounal, 8(5), pp 464-474 [45] Wen-Ai Xu et al (2013), “Study on the correlation between constituents detected in serum from Rhizoma Smilacis Glabrae and the reduction of uric acid levels in hyperuricemia”, Journal of Ethnopharmacology, 150, pp 747-754 [46] William Gaffield et al (1974), “Structural Relationships and Interconversions of Isomeric Astilbins”, J Org Chem., Vol.40, No 8, pp 1057 – 1061 [47] Willy Shah et al (2015), “Evaluation of acute toxicity effect of Smilax glabra extract on white albino rats”, Journal of Advanced Scientific Research, 6(2), pp 45-47 [48] Y Ju et Z J Jia (1992), “Steroidal saponins from the rhizomes of Smilax menispermoidea”, Phytochemistry, 31(4), pp 1349 – 1351 [49] Y Sashida et al (1992), “Steroidal saponins from Smilax riparia and S.china”, Phytochemistry, 31(7), pp 2439 – 2443 [50] Yijun Yi et al (1998), “A New Isoflavone from Smilax glabra”, Molecules, 3, pp 145–147 [51] YU Yun Lung, (2000), Isolation of Lectins from Smilax Glabra Rhizomes and Castanea Mollisima nuts, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Hồng Kông, Trung Quốc [52] Yueqin Cai et al (2015), “Medicinal effect and its JP2/RyR2-based mechanism of Smilax glabra flavonoids on angiotensin II-induced hypertrophy model of cardiomyocytes”, Journal of Ethnopharmacology [53] Zhang et al (2008), “Literature review of rhizoma Smilacis glabrae”, Hong Kong Pharmaceutical Jounal, vol 15, 2, pp 65-71 Trang web [54] https://en.wikipedia.org/wiki/Smilacaceae (tham khảo ngày 07/09/2017) 23 ... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP MỘT VÀI HỢP CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CỦA... nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học tác dụng dược lý của Thổ phục linh Để bổ sung sở khoa học, làm sáng tỏ tác dụng của Thổ phục linh, đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập vài hợp chất phân đoạn ethyl. .. tách cao cồn thành phân đoạn đơn giản - Phân lập vài hợp chất phân đọan EtOAc II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, dung mơi hóa chất dụng cụ nghiên cứu 2.1.1 Nguyên