Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cưa (phyllanthus urinaria l., euphorbiaceae)

Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cưa (phyllanthus urinaria l., euphorbiaceae)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

THÁI NGUYÊN - 2008

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Phạm Văn Thỉnh - Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh, Th.S Vũ Anh Tuấn, Th.S Hứa Văn Thao những người thầy đã động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn phòng hoạt chất sinh học của trường Đại học Y Thái Nguyên và cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm của Bác sĩ Hoàng Sầm, phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008

Tác giả

Ngô Đức Trọng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

NGÔ ĐỨC TRỌNG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

SKLM : Sắc kí lớp mỏng

UV : Ultraviolet spectrocopy MS : Mass Spectroscopy

EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy

HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

HIV : Human Immunodeficiency Virus đvC : Đơn vị Cacbon

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây chó đẻ

răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)……… ……….26

Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa………27 Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng

cƣa (Phyllanthus urinaria L)……… ……… … 29

Bảng 2.4: Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1 trong cây chó

đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)……… ……… ….30

Bảng 2.5: Phổ 1

H-NMR và 13C-NMR của chất PE-3………… ……….32

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây chó đẻ

răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của -sitosterol [15]….… 40

Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm

ACD/NMR của 5-hidroxymetylfufural 44

Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của PE-2 và số liệu phổ NMR trong phần mềm

ACD/NMR của axit gallic 48

Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của PE-3 và số liệu phổ trong phần mềm

ACD/NMR của chất kampherol 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae 3

Hình 2.1: Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phương

phương pháp khuyếch tán trên thạch 28

Hình 3.1: Phổ FT-IR của -sitosterol (PH-1) 36

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của -sitosterol (PH-1) 37

Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và ATP của -sitosterol (PH-1) 38

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-1 42

Hình 3.5: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-1 43

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-2 46

Hình 3.7: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-2 47

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của PE-3 50

Hình 3.9: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của PE-3 51

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒSơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu 26

MỤC LỤC

Lời cảm ơn Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các bảng

Danh mục các hình và sơ đồ

MỞ ĐẦU .1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN .3

1.1 Mô tả thực vật 3

1.2 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 4

1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus 4

1.2.2 Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus 5

1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus 6

1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit 6

1.3.2 Một số đại diện của khung axit 8

1.3.3 Một số đại diện của Lignan 9

1.3.4 Một số đại diện của khung flavonoit 11

1.3.5 Một số hợp chất phenolic khác 12

1.3.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit 15

1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus urinaria L 16

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 23

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 23

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 23

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 24

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 24

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất 24

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 25

2.3 Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) 25

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 62

1

MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người Từ trước khi có sự ra đời của thuốc tây, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên đã được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh và rất có hiệu quả Rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ thảo dược

Ngày nay những hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh Điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc cũng ngày càng tăng lên, được khoa học hiện đại soi sáng, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp Mặt khác việc dùng thuốc nam hầu như không gây ra tác dụng phụ

Có nhiều bộ môn khoa học nghiên cứu về cây thuốc ra đời Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn để làm thuốc chữa bệnh

Cây chó đẻ răng cưa là một cây thuốc đã được sử dụng từ lâu trên thế giới cũng như ở Việt Nam Trong Y học dân tộc cây này được nhân dân dùng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh như: đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, bệnh viêm gan,… rất có hiệu quả

2

Thực vật chó đẻ răng cưa có nhiều ứng dụng quan trọng nhưng gần đây mới được các nhà khoa học các nước quan tâm chọn làm đối tượng nghiên cứu, còn ở nước ta hiện có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và dược lí học của cây chó đẻ răng cưa

Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học của cây chó đẻ răng cưa, góp phần làm tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của Việt Nam

Chúng tôi chọn cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) làm đối tượng

nghiên cứu cho công trình nghiên cứu này Tên đề tài là: “Nghiên cứu hóa

học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L., Euphorbiaceae)”

Tên khoa học là: Phyllanthus urinaria L, thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae)

Phân bố địa lý: Cây chó đẻ răng cưa phân bố rộng khắp ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, điển hình như: Thái Nguyên, Bắc Ninh, Nghệ An, Hà Giang,… Trên thế giới loại cây này mọc nhiều ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Inđonexia, Myanma, Thái Lan,… Châu Mĩ như: Brazil, Argentina,…[5]

Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae)

4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển:

Cây chó đẻ răng cưa là một loại cỏ mọc hàng năm, cao chừng 30 cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành, thường có màu đỏ hơi tía

Cây có vị hơi ngọt Lá mọc so le lưỡng hệ hay có cuống rất ngắn Hoa mọc ở kẽ lá, đơn tính, màu đỏ nâu Hoa đực và hoa cái cùng gốc Hoa đực ở đầu cành, hoa cái ở cuối cành Hoa không có cuống hoặc có cuống rất ngắn Quả nang không cuống hình cầu hơi dẹt Đường kính quả có thể đạt tới 2mm Hạt ba cạnh hình trứng màu nâu nhạt có vân ngang [5]

1.2 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus

Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng

rộng rãi trong y học dân tộc của nhiều nước để chữa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan B…[7] Các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là

3 loài Phyllanthus urinaria L, Phyllanthus niruri L và Phyllanthus amarus

Schum et Thonn [4]

Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ đắng (Phyllanthus amarus Schum et

Thonn) [6]:

Chữa viêm gan do virus: Chó đẻ đắng sao khô 20g, sắc nước 3 lần

Trộn chung các nước sắc Thêm 50g đường, đun sôi cho tan đường Chia làm 4 lần uống trong ngày Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc

Chữa xơ gan cổ trướng thể năng: Chó đẻ đắng sao khô 100g sắc nước 3

lần Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30-40 ngày Khẩu phần ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ)

Riêng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) trong y học dân

tộc được nhân dân dùng để chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn rất có hiệu quả

Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Chó đẻ răng cưa sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g Sắc nước uống hàng ngày

Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi dã nát với một ít muối đắp ngoài da với liều lượng không hạn chế

1.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý của chi Phyllanthus

Năm 1961, phòng Đông Y Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa thấy kết quả tác dụng kháng sinh

như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga (1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm)

Năm 1977, một nhóm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hoá, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của Lương y Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là chó đẻ đắng, xuyên tâm liên, quả dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HBsAg (+) Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi Tỷ lệ đạt 26/98 bệnh nhân Ngoài ra, thuốc còn giúp cơ thể người dùng sản xuất kháng thể chống HBsAg (59/98 người) Liều điều trị trung bình 4-5 tháng [6]

Năm 1988 các tác giả Blunberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37

bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng chó đẻ răng cưa Phyllanthus amarus và

Phyllanthus niruri đạt kết quả âm tính 22/37 bệnh nhân sau 30 ngày Các tác

giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men

pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [5]

6

Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng tại Bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội), đã sử dụng chế phẩm LIV/94 (chó đẻ răng cưa là một trong 3 thành phần chính của thuốc) điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002) đạt kết quả tốt Thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân [6]

Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus

đã phát hiện một vài lignan, flavonoit và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV transcriptase ngược [21]

Các thí nghiệm in vitro của cây chó đẻ với kháng nguyên HBsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh cây chó đẻ có khả chống virus viêm gan B Cây chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn

đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Coli, Shigella

dysenteriae, S flexneri, S shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [1]

1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus

Cho đến nay người ta đã phát hiện chi Phyllanthus L họ thầu dầu

(Euphorbiaceae) có 700 loài, gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [11] Ở

Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus

urinaria L (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus niruri L (chó đẻ thân xanh) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (chó đẻ đắng hay diệp hạ châu đắng)

1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit

Từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5 tritecpen mới, cấu

trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 (29)-en-3β,24-diol; olean-12-en-3β,24-diol; oleana-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en-3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpen diol betulin [33]; lup-20(29)-en-3β,15α-diol [41]

7

Theo [39], từ loài Phyllanthus oxyphyllus đã tách được:

29-nor-3,4-seco-friedelan tritecpen (axit 29-nor-3,4-

29-nor-3,4-seco-friedelan-4(23),20(30)-dien-3-oic) và một secquitecpen mới là guaiane secquitecpen epoxyguaiane) Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ thử nghiệm IC50 = 0.017 ± 0.001 mM

1 29-nor-3,4-seco-friedelane tritecpen 2 Guaiane secquitecpen

Từ loài Phyllanthus reticulates đã phân lập được một hợp chất mới là

21α-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one và một vài triterpenoit khác, đã biết đó là: friedelin, sitosterol, friedelan-3β-ol, glochidonol và 21α-hydroxyfriedelan - 3 - on [47]

Theo tài liệu [46], từ loài Phyllanthus plyanthus ở Châu Phi các tác giả đã tìm ra được một số tritecpenoit: phyllanthol, phyllanthone, (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, δ-amyrin acetate, lupenone và (20S)-

3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol

3 (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol

8

Từ loài Phyllanthus acidus đã tách được hai pentacyclic tritecpenoit, đó

là: phyllanthol và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) [35]

Từ loài Phyllanthus niruri đã tách được một acyclic tritecpen, cấu trúc

của nó được dự đoán dựa trên các phương pháp phân tích phổ là:

3,7,11,15,19,23-hexamethyl-2Z,6Z,10Z,14E,18E,22E-tetracoshexen-1-ol [10] Từ loài Phyllanthus watsonii đã tách được hợp chất tritecpen mới: 26-

Nor-D:A-friedooleanane tritecpen cùng với lupenyl palmitate, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, lup-20(2) [29]

1.3.2 Một số đại diện của khung axit

Từ loài Phyllanthus amarus đã phân lập được axit thiobarbituric, axit

ascorbic [42] Từ dịch chiết n-hexan cũng của loài này ở Malaysia đã tách được axit oleanolic và axit ursolic [16], axit amariinic, axit repandusinic A, axit geraniinic B và một chất là 1-O-galloyl-2,4-dehydrohexahydroxydiphe noyl -glucopyranozơ elaeocarpusin [26]

Từ loài Phyllanthus emblica đã tách được axit phyllaemblic [52], axit

ascorbic [23]

Từ loài Phyllanthus fraternus đã tách được axit indole-3-butyric, axit

1-naphthaleneacetic [31] và axit trichadenic B có cấu trúc như axit D: A-friedooleanan-27-oic, được xác định dựa vào phương pháp phân tích X-ray [38]

4 Axit trichadenic B

9

1.3.3 Một số đại diện của Lignan

Trong loài Phyllanthus discoides người ta đã tách được phyllanthin

C14H17O2N, phyllantin C13H15O3N [27] và phyllantidin C13H15O2N [20]

Trong loài Phyllanthus niruri L có phyllanthin C24H34O6, hypophyllanthin C24H30O7, niranthin C24H30O7 (cấu trúc của niranthin được chỉ ra là (+)3,4,3′,4′,9,9′-hexamethoxy-8:8′-butyrolignan), nirtetralin C24H30O7

và phyllteralin C24H34O6 [8] Dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, cấu trúc của nirtetralin và phyltetralin được chỉ ra là 1-phenyl tetralins

10

Cũng từ phần dịch chiết n-hexan của loài này, người ta đã tách được triacontanal và triacontanol [40]

Các chất hypophyllanthin, phyllanthin cũng được phân lập trong cặn

n-hexan bằng phương pháp sắc kí lỏng trung áp (MPLC) từ loài Phyllanthus

niruri L ở vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh nước ta [4], đây là hai lignan

đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào gan bằng CCl4 và D- GalN/ TNF- [3], [45]

Theo tài liệu [34], từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 4

diarylbutane lignan mới, chúng được coi là sản phẩm chuyển hóa thuộc hệ

thống 5′ -desmethoxy niranthin Trong đó hai chất (9a) và (9b) là sản phẩm chuyển hóa từ axit veratrylidene piperonylidene succinic, (10a) được chuyển hóa từ axit veratrylidene 3,4,5-trimethoxy benzylidene succinic và (10b) được chuyển hoá từ (10a)

9a R=H; 9b R=CH3 10a R=H; 10b R=CH3

Từ loài Phyllanthus polyphyllus L đã tách được các lignan là

arylnaphthalide, phyllamyricin C, justicidin B và diphyllin [51]

Từ loài Phyllanthus anisolobus đã tách được ichtyotoxic lignan justicidin B

và lignan-glucozit phyllanthostatin A [43]

11

1.3.4 Một số đại diện của khung flavonoit

Từ dịch chiết etanol loài Phyllanthus emblica L đã phân lập được quecxetin

và catechin Đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa tốt [49]

11 Quecxetin 12 Catechin

Cũng về vấn đề nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, các nhà khoa học đã

khảo sát khả năng này từ dịch chiết methanol của 5 loài phyllanthus đặc biệt từ Ấn Độ là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria,

Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus Tất

cả các dịch chiết này đều cho kết quả tốt [22]

Từ loài Phyllanthus sellowianus đã phân lập được rutin và isoquercitrin

là hai flavonoit chiếm thành phần chủ yếu trong cây này [19]

13 Rutin 14 isoquercitrin

Theo tài liệu [36], từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 2 flavanon:

8-(3-metyl-but-2-enyl)-2-phenyl chroman-4-on (15) và

2-(4-hydroxyphenyl)-12

8-(3-metyl-but-2-enyl)-chroman-4-on (16) Hai chất trên được các tác giả

nhận định là có khả năng làm thuốc chữa bệnh Gút (Gout) và bệnh thận

4'5'6'1'' 2''

1.3.5 Một số hợp chất phenolic khác

Từ loài Phyllanthus niruri Linn đã tách được một số hợp chất phenolic

là: axit gallic, axit ellagic, ellagitannin, epicatechin, (+)-gallocatechin,

(−)-epigallocatechin, (−)-epicatechin 3-O-gallat và (−)-epigallocatechin 3-O-gallat [28] Hợp chất ellagitannin cũng được tách từ loài Phyllanthus amarus [26]

Các tác giả Đài Loan đã phân lập và nhận dạng một số hợp chất phenolic và nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của các chúng từ loài

phyllanthus emblica L [50] Nguyên liệu sau khi làm khô được ngâm chiết

trong metanol và sau đó được chiết lần lượt với etyl ete, etyl axetat, butanol và nước Phân đoạn etyl axetat cho thấy có hàm lượng lớn nhất của hợp chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) so với cả bốn phân đoạn Phân đoạn etyl axetat được tách bằng sephadex và thu được 6 hợp chất, chúng được nhận dạng là: geraniin, quercetin-3-β-D-glucopyranozit, kaempferol 3-β-D-glucopyranozit, isocorilagin, quercetin , và kaempferol Một số hợp chất trên

lần đầu tiên được tách từ loài Phyllanthus emblica Các hợp chất đã tách,

được làm sạch và đem khảo sát khả năng chống oxi hóa Kết quả cho thấy trong số 6 chất trên thì geraniin là chất có khả năng chống oxi hóa tốt nhất (ở nồng độ IC50 = 4.7 và 65.7 μM, thử nghiệm sự oxi hóa lipit)

13

Từ loài Phyllanthus amarus đã tách được axit shikimic (3- and 5-O-gallat),

flavan-3-ol (epigallocatechin 3-gallat), proanthocyanidin và hydrolysable tannin (corilagin, casuariin, geraniin) [17], [14]

19 Proanthocyanidins

Theo L.Yeap Foo, Herbert Wong [24], cũng từ loài này đã tách được một sản phẩm từ tannin thủy phân (hay ellagitannin đặc biệt) đó là phyllanthusiin D có cấu trúc được xác định là: 1-galloyl-2,4-(acetonyl-dehydrohexahydroxydiphenoyl) -3,6-hexahydroxydiphenoylglucopyranozit

Theo tài liệu [25] cũng từ loài này đã tách được amariin, là một sản phẩm thủy phân của di-dehydrohexahydroxydiphenoyl (DHHDP), cấu trúc của nó được xác định là 1-galloyl-2,4: 3,6-bis-DHHDP-glucopyranosit trong đó phần

Từ loài Phyllanthus polyphyllus L ở Đài Loan, Yew-Min Tzeng và các

cộng sự đã tách được benzenoit, axit 4-O-methylgallic [51], hợp chất này chủ yếu được tạo thành từ sự chuyển hóa axit gallic và nó có nhiều trong rượu vang đỏ, chè, trong nhiều loại trái cây Cũng từ loài này đã tách được 3 arylnaphthalide lignan có tên là: phyllamyricin C, justicidin B và diphyllin

Từ phần dịch chiết etylaxetat của loài Phyllanthus niruri L, ở Vùng

Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh đã phân lập được hai chất là: 2,4,6-

xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on (20) và 5,7,8 – 9,10- peoxi- 4- ethoxy benzo[2,3-d] coumarin (21), hai chất này cho đến nay

trihidroxi-chưa thấy thông báo có mặt trong các loài Phyllanthus [4]

O - CH2 -CH3

20 2,4,6- xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on

15

21 5,7,8 - trihidroxi-9,10- peoxi- 4- ethoxy benzo[2,3-d] coumarin

Hoạt tính chống oxy hóa của 5,7,8 – trihidroxi-9,10- peoxi- 4- ethoxy benzo[2,3-d] coumarin cùng với quercetin làm đối chứng đã được thử bằng

phương pháp Potterat trong cùng một điều kiện Cho thấy chất này thể hiện

hoạt tính chống oxy hóa yếu hơn so với quercetin (ở nồng độ 25 mg/l vẫn còn phản ứng dương tính) [4]

1.3.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit

Từ loài Phyllanthus amarus đã tách được 2 ankaloit mới là isobubbialine

và epibubbialine cùng với 3 ankaloit đã biết là phyllanthine, securinine và norsecurinine Cấu trúc của chúng được xác định trên cơ sở phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ khối lượng và phổ NMR [30]

Từ loài Phyllanthus niruroides ở bang Florida nước Mĩ các tác giả:

Babady-Bila, Thomas E Gedris và Werner Herz, đã phân lập được một hợp chất mới thuộc nhóm ankaloit là niruroidine, cấu trúc của nó được làm sáng tỏ dựa trên các phương pháp phổ [9]

Từ loài Phyllanthus simplex lần đầu tiên đã phân lập được một ankaloit là

simplexine (14-hydroxy-4-methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) và một ankaloit đã biết là phyllanthine [32] Chất này đã và đang được sử dụng làm thuốc Tây Y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ biến trên thị trường

Ngoài những nhóm hợp chất trên, từ loài Phyllanthus anisolobus đã

tách được hai γ -lacton: menisdaurilide và aquilegiolide [43]

16

1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus urinaria L

Từ loài Phyllanthus urinaria L đã tách được một số triterpen như:

stigmasterol, daucosterol, sigmasterol-3-O--glucosid, -sitosterol, glucosid, lupeol acetat, -amyrin, lup-20 (29)-en-3-ol [5], [53] Chất

-sitosterol cũng được phân lập từ dịch chiết n-hexan của loài Phyllanthus

niruri L ở tỉnh Bắc Ninh nước ta [4] Cấu trúc một số hợp chất điển hình đã

được xác định như sau:

Từ loài Phyllanthus urinaria L đã tách được một số axit hữu cơ như:

Axit succinic, axit ferulic, axit dotriancontanic, axit hecxacosanoic [11], [53]

17

26 Axit ferulic

Gần đây, cũng từ loài cây này, nhóm các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được 5 hợp chất, đó là: ester mono-[2-(4-carboxy-phenoxycarbonyl)-vinyl] terephthalat, axit (E)-3-(5’-hydroperoxy-2,2’-dihydroxy[1,1’-biphenyl]-4-yl)-2-propenoic, axit 3,4,5-trihydroxybenzoic, axit succinnic (hay

axit butanedioic) và axit 2,3,4,5,6-pentahydroxybenzoic Trong đó 25 và 26

là hai hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ loài Phyllanthus urinaria L

[48]

27

28

Từ loài Phyllanthus urinaria L đã phân lập được 4 lignan mới

là 5-demethoxyniranthin (29a C23H30O6), urinatetralin (30a

18

C22H24O6), dextrobursehernin (31a C21H22O6), urinaligran (32 C22H24O7) ,

cùng với 9 lignan đã biết là: phyllanthin (29b), niranthin (33), phyltetralin (30b), hypophyllanthin (34), nitetralin (35), lintetralin (36), isolintetralin (37), heliobuphthalminlactone (31b) và virgatusin (38) [12]

31b R1 + R2 = CH2

19 O

37 38

Cũng từ loài Phyllanthus urinaria L Zhang L Z và cộng sự đã tách

được một chất mới là ellagitannin [54]

20

Riêng loài Phyllanthus urinaria L được thu hái ở huyện Đô Lương,

Nghệ An -Việt Nam các nhà khoa học Việt nam lần đầu tiên đã phân lập được 4’-methoxyscu tellarein Chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây Stachys annua [7]

39 4’-methoxyscutellarein

Từ dịch chiết axeton của loài Phyllanthus urinaria L các nhà khoa học

Đài Loan đã tách được geraniin và 1,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucozơ [13] Các thí nghiệm in vitro đã chỉ ra hai chất này có hoạt tính chống lại vi rút bệnh mụn rộp ngoài da và không gây độc

Từ loài này người ta còn tách được axit ellagic, axit 3, 3’,4- O- methylellagic, axit gallic , 4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D- glucopyranozơ, methyl brevifolincarboxylate [5], [53]

40 Axit gallic 41 Methyl brevifolincarboxylate

21

Chất methyl brevifolin cacboxylat cũng được tách bằng phương pháp sắc kí cột từ dịch chiết n-butanol của cây này ở huyện Đô Lương, Nghệ An [7]

Theo tài liệu [37], từ loài Phyllanthus urinaria L ở Đài Loan đã

tìm được các hợp chất sau: phyllanthin (42), phyltetralin (43), 3,4-dehydrochebulate (44), metylgallat (45), rhamnocitrin (46), methyl

trimetyl-brevifolincarboxylat (47), β-sitosterol-3-O-β-d-glucopyranosid (48),

quercitrin (49)và rutin (50)

OH O

46 Rhamnocitrin (hay kampferol-7-methylete)

Cấu trúc các hợp chất (44) và (47) được xác minh bằng phương pháp

phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ Các hợp chất trên đã được nghiên cứu một cách kĩ lưỡng về khả năng chống oxi hóa và khả năng làm thuốc kháng

viêm Các chất (44), (45) và (47) có khả năng chống oxi hóa tốt (ở IC50 = 9.4, 9.8 và 8.9 μM, các lần thử nghiệm riêng rẽ) Còn trong các thí nghiệm in vitro

khác về hoạt tính kháng viêm thì ngoại trừ (48), các chất còn lại đều có hoạt

tính kháng viêm cao Tài liệu này lần đầu tiên thông báo thử nghiệm về khả

năng kháng viêm của loài Phyllanthus urinaria và do đó các chất đã được phân lập từ cây Phyllanthus urinaria có thể được sử dụng làm thuốc kháng

viêm trong điều trị

Từ loài Phyllanthus urinaria L đã tách được phyllurine (51) [44], cấu

trúc của phyllurine như sau:

Theo tài liệu [18], từ loài này đã phân lập được phyllanthurinolacton

(52), cấu trúc của nó như sau:

OH2N

23

CHƯƠNG II

THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại vùng giáp ranh giữa Huyện Đồng Hỷ và Thành Phố Thái Nguyên

Cây chó đẻ răng cưa còn gọi là cây diệp hạ châu, dân địa phương gọi là diệp hòe thái, các nhà khoa học ở khoa Sinh trường ĐHSP Thái Nguyên xác

định tên khoa học là “Phyllanthus urinaria L.” Họ thầu dầu (Euphorbiaceae)

Mẫu cây tươi sau khi thu hái gồm cả thân, lá và quả được đem sấy ở 800C trong 10 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 600C cho tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết trong etanol 90o

ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong 10 ngày

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đến dưới dạng xirô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat, n-butanol, metanol Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500

C dưới áp suất thấp Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây chó đẻ răng cưa chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp các phương pháp gồm:

24 - Sắc kí lớp mỏng (SKLM)

- Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng (MS) và các phổ phân giải cao Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất

Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hoá chất loại tinh khiết phân tích (PA)

Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC – Alufolien Kiesegel 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Các hệ dung môi khai triển SKLM:

25

Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng = 254nm và 365nm Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000

C Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA–9200

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 dạng viên nén KBr - Phổ LC/MS ghi trên máy ESI-LC/MS 1100 MSD Trap spectrometer - Phổ khối ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm eletron (EI- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L

- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6

2.3 Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) 2.3.1 Các dịch chiết

Toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat, đuổi hết nước và chiết bằng butanol, tiếp tục đuổi hết nước và chiết bằng metanol

Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa đã thu nhận được 4 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat,

chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi

Rf =

(g)

Khối lƣợng cặn cồn tổng

Cặn BuOH (PB) Cặn EtOAc

(PE)

Cặn MeOH (PM)

PE-1 PE-2 PE-3 PH-1

27

2.3.2 Khảo sát định tính các dịch chiết

Trên cơ sở dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [2] chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả ấy được chỉ ra ở bảng 2.2:

Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa

Kết quả

1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++

3 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++

7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì -

Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính

rất rõ; (-): Không có

2.3.3 Thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định

Thử định tính theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn

28

Hình 2.1: Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)

theo phương pháp khuyếch tán trên thạch

29

Các chủng vi sinh vật gồm đại diện các nhóm:

* Vi khuẩn Gr(-) Escherichia coli

* Vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus auresu * Vi khuẩn: Salmonella typhi

Chúng tôi đã tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng của dịch chiết cây chó đẻ răng cưa tại Cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên

Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của dược liệu tại bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên

Kết quả thực nghiệm thu được (xem hình 2.1)

Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L)

Dịch chiết

Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)

Staphylococcusauresu E.coli Salmonella typhi

30

* Chất PH-1 (β-Sitosterol)

Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (9:1) Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu được 19 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139-1410

C, Rf = 0,72 (trong hệ dung môi A) Tiến hành đo phổ chất PH-1 thu được các thông tin phổ như sau:

Phổ FT-IR (KBr); (cm-1): Ở  max = 3450 (cm-1) cho một vân hấp thụ rộng (H32,C3); một vân hấp thụ ở 3010- 1650 (cm-1) (liên kết đôi)

Phổ EI-MS; m/z(%): 414 [M+

] (20); 413[M-H]+(41); 398(28); 397(100); 395(32); 383(11); 361(11); 257(3); 255(6,3); 151(5,6); 139(11)

Phổ 1

H-NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 ppm (3H, s, CH3-18); 1,01 ppm (3H, s, CH3-19); 0,81 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-26); 0,88 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-27); 0,83 ppm (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 ppm (3H, d, j 10Hz, CH3-21); 3,52 ppm (1H, m, H-3); 5,42 ppm (1H, d, j 5Hz,H-6) Phổ 13C- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): Xem bảng 2.4

Bảng 2.4: Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1

trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)

STT của C

31

2.4.2 Dịch chiết etylaxetat (PE)

Từ 5g cặn chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa (ký hiệu PE) được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform : metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0-100% metanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu được 3 cặn thô Tinh chế hai cặn đầu thu được hai chất: PE-1và PE-2 Cặn thứ ba được tách tiếp bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit formic (5:4:1) thu được chất PE-3

2.4.2.1 Chất PE-1(5-hidroxymetylfurfural)

Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform : metanol (90:10) Những phân đoạn có cùng Rf =0,8 trong hệ dung môi C được gộp lại, thu được cặn thô Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 8 mg một chất dầu sệt mầu nâu

Tiến hành đo phổ chất PE-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic M+

= 126,8 Phổ 1

H-NMR (500MHz, DMSO);  (ppm): δH = 7,48 ppm (1H,d, CH-3); δH= 4,50 ppm (2H, d, CH2-6); δH= 6,60 ppm (1H,d, J=3,6 Hz, CH-4); δH= 9,54 ppm (1H,s,CHO-1)

Phổ 13

C- NMR (500MHz, DMSO);  (ppm): Cho các pic ở δC = 177,91 ppm (C1); δC = 151,70 ppm (C2); δC = 124,33 ppm (C3); δC =109,62 ppm (C4); δC = 162,13 ppm (C5); δC = 55,89 ppm (C6)

2.4.2.2 Chất PE-2 (axit gallic)

Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat Những phân đoạn tiếp theo giống nhau có cùng Rf = 0,7 (trong hệ dung môi C) được gộp lại, đem cất đuổi dung môi thu được một chất rắn kết tinh Tinh chế lại bằng cloroform thu được 40 mg tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250o

C Phổ 1

H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm): Cho một pic ở 6,91ppm Phổ 13

C-NMR (500MHz, DMSO); (ppm): δ = 120,48 ppm (C );