Nghiên cứu hoá học hướng tác dụng chống oxy hóa của sâm cau (curculigo orchioides gaertn , hypoxidaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN TRỌNG HIẾU NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh - 2019 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN TRỌNG HIẾU NGHIÊN CỨU HỐ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae) Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Luận văn Thạc sĩ Dược học Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM ĐƠNG PHƯƠNG TP Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Trọng Hiếu Luận văn thạc sĩ – Khóa: 2017 – 2019 Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU HỐ HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae) NGUYỄN TRỌNG HIẾU Người hướng dẫn: TS PHẠM ĐÔNG PHƯƠNG Mở đầu đặt vấn đề: Sâm cau sử dụng từ lâu đời để trị trường hợp vơ sinh, khó thụ thai làm thuốc tăng lực cho người mệt mỏi Hiện Việt Nam, Sâm cau thu hoạch nhiều nơi khác từ tỉnh phía bắc từ Yên bái, Lai Châu, Cao Bằng, Tuyên Quang…đến Tây Nguyên Tuy nhiên, Sân cau chưa nghiên cứu đầy đủ thành phần tác dụng Đề tài thực nhằm góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa thân rễ Sâm cau Đối tượng: Thân rễ Sâm cau (Rhizoma Curculiginis) thu mua Yên Bái Phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao toàn phần cồn 96% cồn 50%, phân đoạn cao chiết chất phân lập phương pháp DPPH Sử dụng phương pháp ngấm kiệt, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột nhanh, sắc ký cột cổ điển, sắc ký lớp mỏng chế hóa phương pháp tinh chế khác để phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp phổ học (UV, MS, NMR) Kết bàn luận: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa: Cao cồn 96% có tác dụng chống oxy hóa mạnh cao cồn 50% Chiết ngấm kiệt cồn 96%, phân bố với dung mơi có độ phân cực tăng dần thu phân đoạn: Cao n-hexan, cao cloroform, cao ethyl acetat cao nước Trong phân đoạn, cao EtOAc thể hoạt tính chống oxy hóa mạnh theo phương pháp DPPH, tiếp đến cao cloroform, cao n-hexan cao nước có hoạt tính chống oxy hóa yếu Phân lập, xác định cấu trúc thử hoạt tính chống oxy hóa: Từ cao EtOAc, phương pháp sắc ký cột nhanh, sắc ký cột cổ điển sắc ký lớp mỏng phân lập xác định chất là: Orcinol, curculigosid, curculigosid B orcinol glucosid Theo phương pháp DPPH, chất thể hoạt tính chống oxy hóa yếu Kết luận: Từ cao ethyl acetat dịch chiết cồn 96% phân lập xác định cấu trúc chất tinh khiết: Orcinol, curculigosid, curculigosid B orcinol glucosid Trong chất thể hoạt tính chống oxy hóa yếu theo phương pháp DPPH ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2017 - 2019 Speciality: Pharmacognosy - Traditional pharmacy Speciality code: 8720206 BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FORM THE RHIZOMES OF CURCULIGO SP (Rhizoma Curculiginis) NGUYEN TRONG HIEU Supervisors: Dr PHAM DONG PHUONG Introduction: Curculigo sp has been used widely for a long time in folk medicine to treat infertility, difficulty conceiving and making tonic for experiencing fatigue In Vietnam, Curculigo sp is harvested in many different places from the northern provinces such as Yen Bai, Lai Chau, Cao Bang, Tuyen Quang,… to Tay Nguyen However, Curculigo sp has not been fully studied for its chemical composition and effects This thesis is carried out to isolate the components which have antioxidant activities on DPPH method in rhizomes of Curculigo sp Materials: Rhizomes of Curculigo sp in Yen Bai province Methods: In vitro screening of extracts, fractions and isolated compounds for the antioxidant activities on the DPPH method Using percolation, liquid-liquid distribution, vancuum liquid chromatography, classical column chromatography, preparative thin layer chromatography and other purifications methods Structure determination was based on UV, MS and NMR spectrometric methods Result and discussion: Screening the antioxidant activity: The ethanol 96% extract shows higher than ethanol 50% The ethanol 96% extract was distributed into fractions: n-hexane, chloroform, ethyl acetate and water fractions Ethyl acetate fraction has the most potent antioxidant activity, followed chloroform fraction, nhexane and water fractions with very weak antioxidant activities on the DPPH method Isolation and structural determination: From ethyl acetate fraction, by vancuum liquid chromatography, classical column chromatography and preparative thin layer chromatography, substances were obtained: Orcinol, curculigosid, curculigosid B and orcinol glucosid According to the DPPH method, all of them exhibits weak antioxidant activities Conclutions: From the ethyl acetate of the 96% alcohol extract, isolated and identified the structure of pure substances: Orcinol, curculigosid, curculigosid B and orcinol glucosid All of them exhibited weak antioxidant activities on the DPPH method I MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC SƠ ĐỒ VIII ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CURCULIGO 1.1.1 Vị trí phân loại chi Curculigo 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Curculigo Gaertn 1.1.3 Hóa học loài thuộc chi Curculigo 1.1.4 Tác dụng sinh học cơng dụng lồi thuộc chi Curculigo 1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM CAU 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Phân bố, thu hái 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng sinh học 1.2.5 Công dụng, số thuốc thành phẩm có Sâm cau 13 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO 15 1.3.1 Mơ hình đánh giá thông qua khả cho electron 16 1.3.2 Mơ hình đánh giá thơng qua khả cho nguyên tử hydro 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.1.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 18 2.1.3 Trang thiết bị thí nghiệm 19 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 II 2.2.1 Khảo sát thực vật 20 2.2.2 Thử tinh khiết 20 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa 21 2.2.4 Nghiên cứu hóa học 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .29 3.1 KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU 29 3.1.1 Khảo sát hình thái thực vật 29 3.1.2 Khảo sát vi học 30 3.1.3 Thử tinh khiết 32 3.2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA 33 3.2.1 Chiết xuất khảo sát tác dụng chống oxy hóa cao cồn 96% 50% 33 3.2.2 Chiết xuất khảo sát tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn cao cồn 96% 36 3.3 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 41 3.3.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 41 3.3.2 Chiết xuất phân tách phân đoạn 42 3.3.3 Phân lập hợp chất cao ethyl acetat 42 3.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 55 3.3.5 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 62 3.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP DPPH 74 3.5 BÀN LUẬN 75 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .77 4.1 KẾT LUẬN 77 4.2 ĐỀ NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC 84 III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt 13 C-NMR H-NMR Ý nghĩa Chữ nguyên 13 C-Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 13C Cộng hưởng từ hạt nhân proton n-BuOH n-butanol n-butanol COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan 1H-1H d doublet Đỉnh đôi DCM Dichloromethane dichloromethan dd doublet of doublets Đỉnh đôi kép DĐVN Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat HMBC Heteronulear Multiple Bond Correlation Phổ HMBC HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC HTCO Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa EC50 Effective concentration 50% Hiệu bảo vệ 50% J coupling constant Hàng số ghép J m multiplet Nhiều đỉnh, đỉnh bội IV MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectroscopy Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PĐ Phân đoạn Phân đoạn ppm parts per million Phần triệu s singlet Đỉnh đơn SKC Sắc ký cột cổ điển Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng TBA Acid thiobarbituric Acid thiobarbituric TCA Acid tricloacetic Acid tricloacetic TP Toàn phần Toàn phần TT Thuốc thử Thuốc thử tR Retention time Thời gian lưu UV Ultra violet (Phổ) tử ngoại VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký (cột) chân không VS Vanilin-Sulfuric Thuốc thử Vanilin-sulfuric V DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số loài chi Curculigo Bảng 1.2 Một số chế phẩm có Sâm cau thị trường 14 Bảng 2.2 Thành phần mẫu đo thử chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 22 Bảng 3.3 Độ ẩm, độ tro tồn phần tro khơng tan acid hydroclorid thân rễ Sâm cau 32 Bảng 3.4 Hàm lượng chất chiết thân rễ Sâm cau 33 Bảng 3.5 HTCO cao toàn phần phương pháp DPPH 35 Bảng 3.6 HTCO cao phân đoạn cồn 96% phương pháp DPPH 38 Bảng 3.7 Bảng giá trị EC50 cao phân đoạn cồn 96% thân rễ Sâm cau 40 Bảng 3.8 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật 41 Bảng 3.9 Kết thăm dò pha động cột VLC cao EA 43 Bảng 3.10 Các phân đoạn cao EA thu qua sắc ký cột nhanh 44 Bảng 3.11 Các phân đoạn cao EA3 thu qua sắc ký cột cổ điển 46 Bảng 3.12 Các phân đoạn cao EA4 thu qua sắc ký cột cổ điển 48 Bảng 3.13 Các phân đoạn cao EA5 thu qua sắc ký cột cổ điển 49 Bảng 3.14 Các phân đoạn cao EA6 thu qua sắc ký cột cổ điển 52 Bảng 3.15 Kết phân lập hợp chất tinh khiết cao EtOAc 53 Bảng 3.16 So sánh phổ COE2 với orcinol 64 Bảng 3.17 So sánh phổ COE6 với curculigosid B 66 Bảng 3.18 So sánh phổ COE7.1 với curculigosid 70 Bảng 3.19 So sánh phổ COE8 với orcinol glucosid 73 Bảng 3.20 Thành phần mẫu đo thử chống oxy hóa chất phân lập theo phương pháp DPPH 74 Bảng 3.21 HTCO chất phân lập phương pháp DPPH 75 ... này, tất chất khử tham gia vào phản ứng hóa học chất chống oxy hóa, mà hợp chất có khả bảo vệ mục tiêu sinh học q trình oxy hóa xem chất chống oxy hóa [45] Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa. .. thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa thân rễ Sâm cau Đối tượng: Thân rễ Sâm cau (Rhizoma Curculiginis) thu mua Yên Bái Phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao toàn... đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp phổ học (UV, MS, NMR) Kết bàn luận: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa: Cao cồn 96% có tác dụng chống oxy hóa mạnh