Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của cây nghể bụi (polygonum posumbu buch ham ex d don)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch.-Ham ex D Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch.-Ham ex D Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan là cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn là trung thực và chưa được công bố cơng trình nào khác Nguyễn Việt Dũng TĨM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020 Ngành: Dược liệu - Dược cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch.-Ham ex D Don) Nguyễn Việt Dũng Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Mở đầu đặt vấn đề Cây Nghể bụi (Polygonum posumbu) thường mọc nơi đất ẩm ven rừng, ven śi, bờ sơng ngịi, mương rạch, ruộng bỏ hoang, phân bố nhiều Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam Tại Vân Nam Trung Quốc, người ta dùng toàn để trị lỵ, viêm dày, ruột, tiêu chảy, phong thấp, đau xương khớp, rắn cắn, mẩn ngứa da Ở Việt Nam chưa có tài liệu ghi chép kinh nghiệm sử dụng dân gian chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học này Đó là lý thực đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chớng oxy hóa Nghể bụi (Polygonum posumbu Buch.-Ham ex D Don) Đối tượng Toàn Polygonum posumbu thu hái Quảng Nam vào tháng năm 2019 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chớng oxy hóa phân đoạn thử nghiệm DPPH Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng lỏng , sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển và phương pháp tinh chế khác để phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn có hoạt tính chớng oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc dựa vào phổ MS NMR Kết bàn luận Hoạt tính chớng oxy hóa cao giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (87,3%) > cao cồn 80% (65,7%) > cao cloroform (44,9%) > cao nước (14,2%) > cao n-hexan (12,1%) Bột dược liệu (6,5 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 80%, cô thu hồi thu được 3,7 L cao cồn lỏng Chiết phân bố lỏng lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần, loại dung môi thu được cao n-hexan (1,7 g), cao cloroform (18,2 g), cao ethyl acetat (149,7 g) và cao nước (468,3 g) Từ 18,2 g cao cloroform thu được hợp chất (acid 3,3’-di-O-methylellagic) 60 g cao ethyl acetat kỹ thuật VLC, sephadex, kết tinh phân đoạn thu được chất tinh khiết là: rhamnazin, isorhamnetin, quercetin, acid succinic, acid gallic, myricetin, distichin, quercitrin, catechin Xác định IC50 hợp chất so sánh với vitamin C, kết HTCO giảm dần sau: acid gallic (9,28 µM) > quercetin (11,09 µM) > myricetin (12,33 µM) > quercitrin (15,36 µM) > vitamin C (25,5 µM) > isorhamnetin (30,12) > rhamnazin (36,67 µM) > acid 3,3’-diO-methylellagic (108,6 µM) Kết luận hợp chất từ phân đoạn cloroform hợp chất từ cao ethyl acetat đã được phân lập Trong acid 3,3’-di-O-methylellagic, rhamnazin, isorhamnetin, myricetin, distichin, quercitrin, catechin lần được phân lập loài P posmbu, distichin lần được phân lập chi Polygonum Quercetin, acid gallic, myricetin, quercitrin thể hoạt tính mạnh so với vitamin C (tính theo µM) thử nghiệm DPPH; rhamnazin, isorhamnetin, catechin có khả chớng oxy hóa gần tương đương với vitamin C; acid 3,3’-di-O- methylellagic thể hoạt tính yếu so với vitamin C khoảng lần acid succinic HTCO ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2018 – 2020 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206 BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM THE AERIAL PARTS OF POLYGONUM POSUMBU BUCH.-HAM EX D DON Nguyen Viet Dung Supervisors: Dr Vo Van Leo Introduction Polygonum posumbu often grows in moist soil, rivers, canals, abandoned fields and is widely distributed in China, India and Vietnam In Yunnan China, people use the aerial parts to treat dysentery, gastritis, intestinal inflammation, diarrhea, rheumatism, osteoarthritis, snakebites, skin rashes In Vietnam, there are no records of experience and no studies on the chemical composition and biological acitivity of this plant As a result, our aim in this rearch is to isolate compounds for the antioxidant activity of Polygonum posumbu Materials The aerial parts of P posumbu were collected in Quang Nam, in March, 2019 Methods In-vitro screening of fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on DPPH assay Distribution of liquid-liquid extraction, vaccum liquid chromatography, silica column chromatography and other refined methods for the isolated compounds and fractions have strong antioxidant activity Structure elucidation was based on NMR and MS method Results and discussion The antioxidant activities of fractions decrease in order: ethyl acetat fraction (87,3%), ethanol 80% (65,7%), chloroform fraction (44,9 %), water fraction (14,2%), n-hexan fraction (12,1%) Dried whole plant of P posumbu (6.5 kg) was extracted with 80% ethanol to obtain 3,7 L of ethanol extract The extract was diluted with water and distributed with solvents to obtain fractions: n-hexan (1,7 g), chloroform (18,2 g) and ethyl acetate (149,7 g) and water fraction (468,3 g) From 18.2 g of chloroform fraction obtained compound (3,3’-di-O-methylellagic acid) From ethyl acetate fraction, by vacuum liquid chromatography and sephadex column, compounds were obtained: rhamnazin, isorhamnetin, quercetin, acid succinic, gallic acid, myricetin, distichin, quercitrin and catechin Determination of IC50 of compounds and comparison with vitamin C, the results of the antioxidant activity were as follows: gallic acid (9,28 µM) > quercetin (11,09 µM) > myricetin (12,33 µM) > quercitrin (15,36 µM) > vitamin C (25,5 µM) > isorhamnetin (30,12) > rhamnazin (36,67 µM) > acid 3,3’-di-O-methylellagic (108,6 µM) Conclutions One compound from the chloroform fraction and compounds from the ethyl acetat fraction were isolated In which, 3.3’-di-O-methylellagic acid, rhamnazin, isorhamnetin, myricetin, distichin, quercitrin, catechin were isolated for the first time from P posumbu, distichin was isolated for the first time in the genus Polygonum Quercetin, gallic acid, myricetin, and quercitrin showed stronger antioxidant activity than vitamin C (µM) in the DPPH assay; rhamnazin, isorhamnetin, catechin have antioxidant capacity equivalent to vitamin C; 3,3’-di-O-methylellagic acid exhibited approximately times weaker than vitamin C and succinic acid did not exhibit antioxidant capacity MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi LỜI CẢM ƠN viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ CHI POLYGONUM 1.1.1 Thực vật học chi Polygonum 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý loài thuộc chi Polygonum 16 TỔNG QUAN VỀ LOÀI POLYGONUM POSUMBU 24 1.2.1 Thực vật học 24 1.2.2 Thành phần hóa học 26 1.2.3 Tác dụng dược lý 26 1.2.4 Công dụng y học cổ truyền 27 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXY HĨA VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 28 1.3.1 Gốc tự 28 1.3.2 Chất chớng oxy hóa flavonoid 31 1.3.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chớng oxy hóa 33 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37 2.1.1 Nguyên liệu 37 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 37 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 38 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 38 2.2.2 Thử độ tinh khiết 38 2.2.3 Định danh dược liệu phương pháp giải trình tự ADN 39 2.2.4 Khảo sát sơ thành phần hóa học 39 2.2.5 Xác định hàm lượng chất chiết được 39 2.2.6 Chiết xuất và tách phân đoạn phân bố lỏng - lỏng 39 2.2.7 Phân lập chất tinh khiết theo định hướng chớng oxy hóa 40 2.2.8 Kiểm tra độ tinh khiết 40 2.2.9 Xác định cấu trúc chất phân lập được 40 2.2.10 Thử tác dụng chớng oxy hố mơ hình DPPH 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 45 3.1.1 Định danh phương pháp giải trình tự ADN 45 3.1.2 Đặc điểm hình thái 45 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu 46 THỬ TINH KHIẾT 51 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC 52 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 52 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 52 3.4.2 Sàng lọc hoạt tính chớng oxy hóa từ phân đoạn nghể bụi 55 3.4.3 Chiết xuất và tách phân đoạn phân bố lỏng – lỏng 56 3.4.4 Phân tách phân đoạn từ cao EtOAc 59 3.4.5 Phân lập hợp chất kiểm tra độ tinh khiết từ cao phân đoạn 64 3.4.6 Xác định cấu trúc chất phân lập được 75 ĐÁNH GIÁ HTCO CỦA CÁC CHẤT TINH KHIẾT 92 CHƯƠNG BÀN LUẬN 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC 109 i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một sớ lồi chi Polygonum Bảng 1.2 Flavonoid loài thuộc chi Polygonum Bảng 1.3 Các hợp chất quinon có chi Polygonum Bảng 1.4 Các hợp chất stilben chi Polygonum 11 Bảng 1.5 Triterpenoid steroid chi Polygonum 12 Bảng 1.6 Phenyl propanoid lignan chi Polygonum 13 Bảng 1.7 Một số thành phần khác chi Polygonum 14 Bảng 1.8 Các hợp chất có chứa oxygen nitrogen hoạt động (ROS RNS) 28 Bảng 2.9 Pha mẫu đo đĩa 96 giếng 42 Bảng 3.10 Mức độ tương đồng hai mẫu BLAST NCBI 45 Bảng 3.11 Kết kiểm tra độ tinh khiết dược liệu P posumbu 51 Bảng 3.12 Kết xác định hàm lượng chất chiết được P posumbu 52 Bảng 3.13 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật 53 Bảng 3.14 HTCO cao phân đoạn phương pháp đo quang 55 Bảng 3.15 Kết thử HTCO cao phân đoạn 58 Bảng 3.16 Các phân đoạn thu được từ cột VLC cao E 60 Bảng 3.17 Kết thử nghiệm HTCO cao cao phân đoạn từ cột VLC 63 Bảng 3.18 Các phân đoạn chạy sephadex tủa E5T 68 Bảng 3.19 Các phân đoạn thu được từ sephadex phân đoạn E8 72 Bảng 3.20 Bảng so sánh phổ NMR PPC1 acid 3,3’-di-O-methylellagic 75 Bảng 3.21 Bảng so sánh phổ NMR PPE1 rhamnazin 77 Bảng 3.22 Bảng so sánh phổ NMR PPE2 isorhamnetin 78 Bảng 3.23 Bảng so sánh phổ NMR PPE3 quercetin 80 Bảng 3.24 Dữ liệu phổ NMR PPE4 81 Bảng 3.25 Bảng so sánh phổ NMR PPE5 acid gallic 82 Bảng 3.26 Bảng so sánh phổ NMR PPE6 myricetin 84 Bảng 3.27 Bảng so sánh phổ NMR PPE7 distichin 86 Bảng 3.28 Bảng so sánh phổ NMR PP11 quercitrin 88 Bảng 3.29 Bảng so sánh phổ NMR PP12 catechin 90 Bảng 3.30 Kết đo HTCO, xác định IC50 vitamin C 92 Bảng 3.31 Kết đo HTCO, xác định IC50 PPC1 92 ... nghiên cứu thành phần hóa học và tác d? ??ng sinh học này Đó là lý thực đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác d? ??ng chớng oxy hóa Nghể bụi (Polygonum posumbu Buch. -Ham ex D Don) Đối... GIÁO D? ??C VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y D? ?ỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VIỆT D? ?NG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC D? ??NG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch. -Ham ex D Don). .. – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC D? ??NG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch. -Ham ex D Don) Nguyễn Việt D? ?ng Người hướng d? ??n khoa học: TS Võ Văn Lẹo