Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của rễ củ bạch chỉ nam (radix millettiae pulchrae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ BÁCH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ BẠCH CHỈ NAM (Radix Millettiae pulchrae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ BÁCH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ BẠCH CHỈ NAM (Radix Millettiae pulchrae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Chuyên ngành Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 527187023 Thầy hướng dẫn: TS Mã Chí Thành Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ này, xin bày tỏ lòng chân thành đặc biệt tới Thầy Tiến sĩ Mã Chí Thành - Người định hướng, trực tiếp hướng dẫn tận tình, động viên tơi suốt khoảng thời gian thực đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn tới thầy, cô Bộ môn Dược liệu- Khoa DượcĐại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt cho tơi kiến thức chuyên sâu, quí báu, hỗ trợ nhiều cho tơi hồn thành luận văn thạc sĩ Tơi muốn bày tỏ biết ơn sâu sắc tới Khoa Dược- Bệnh viện Y học cổ truyền Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp dỡ tơi hồn thành nghiên cứu Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè hỗ trợ tơi suốt q trình học tập thực nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh – 2020 Đinh Thị Bách i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Mã Chí Thành Các kết thu luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tồn trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Đinh Thị Bách ii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỰC VẬT HỌC 1.1 Vị trí phân loại 1.2 Đặc điểm họ Đậu (Fabaceae) 1.3 Đặc điểm chi Millettia (Chi Thàn mát) 1.4 Đặc điểm loài Millettia pulchra Kurz THÀNH PHẦN HÓA HỌC 2.1 Thành phần hóa học chi Millettia 2.1.1 Flavonoid 2.1.2 Alkaloid: 2.2 Thành phần hóa học lồi Millettia pulchra Kurz 2.3 Tác dụng dược lý loài Millettia pulchra Kurz 2.3.1 Tác dụng kháng viêm 2.3.2 Tác dụng kháng ký sinh trùng 2.3.3 Kháng khuẩn 2.3.4 Kháng nấm 2.3.5 Tác dụng khác CÔNG DỤNG 3.1 Tính vị cơng 3.2 Công dụng 3.3 Các thuốc có Bạch nam TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO - CHẤT CHỐNG OXY HÓA 10 4.1 Khái niệm gốc tự 10 4.2 Quá trình hình thành gốc tự [13] 10 iii 4.3 Gốc tự tác động đến bệnh tật người 11 4.4 Tác động chống oxy hóa flavonoid 12 4.5 Một số qui trình thử nghiệm in vitro khả ức chế gốc tự DPPH 12 4.5.1 Qui trình thử nghiệm vào năm 2004 T.Kulisic cộng [38]: 12 4.5.2 Qui trình thử nghiệm vào năm 2012 G.Alagu cộng [18] thực hiện: 13 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA 13 5.1 Nguyên tắc thử nghiệm DPPH: 13 5.2 Thử nghiệm đo khả hấp thụ gốc oxy ORAC (oxygen Radical Absorbance Capacity) 14 5.3 Thử nghiệm đo lường chất chống oxy hóa bẫy hoàn toàn gốc tự TRAP (Total Radical - Trapping Antioxydant Paramether) 15 5.4 Thử nghiệm xác định hàm lượng MDA 15 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 16 1.1 Nguyên liệu 16 1.2 Dung mơi hóa chất 16 1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 16 1.4 Nơi thực đề tài 17 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Kiểm tra nguyên liệu 17 2.2 Phương pháp thử độ tinh khiết [3] 17 2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 17 2.3.1 Phương pháp định tính sơ thành phần hóa thực vật 17 2.3.2 Phương pháp chiết xuất 18 2.3.3 Phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng 18 2.3.4 Phương pháp sắc ký 18 iv 2.3.5 Phương pháp kết tinh phân đoạn 18 2.3.6 Phương pháp xác định cấu trúc chất 18 2.4 Thử tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH 18 2.4.1 Chuẩn bị thí nghiệm 18 2.4.2 Thiết kế thí nghiệm 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ 21 3.1 Đặc điểm thực vật 21 3.1.1 Mơ tả hình thái thực vật: 21 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu: 21 3.1.3 Soi bột 22 3.1.4 Xác định độ tinh khiết 23 3.2 Xác định sơ thành phần hóa thực vật 23 3.3 Chiết xuất, khảo xát tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn 24 3.3.1 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn 24 3.3.2 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn 25 3.3.3 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất phân đoạn EtOAc (Et) (Ea) 27 3.3.4 Xác định cấu trúc hợp chất 36 3.3.4.1 Hợp chất MP1(karanjin) 36 3.3.4.2 Hợp chất MP2 (pongamol) 38 3.3.4.3 Hợp chất MP3( mới) 40 3.3.4.4 Hợp chất MP4( mới) 42 3.3.4.5 Hợp chất MP5 (fujikinetin) 45 3.3.4.6 Hợp chất MP6(Macckiain) 47 3.3.4.7 Hợp chất MP7(acid 4-O-methyl karanjic) 49 3.3.4.8 Hợp chất MP8 50 v 3.3.4.9 Hợp chất MP9(Pseudobatigenin) 52 3.3.4.10 Hợp chất MP10 (3-O-methylbutein) 54 3.3.4.11 Hợp chất MP11(Genistein) 57 3.3.4.12 Hợp chất MP12 (Daidzein) 59 3.3.4.13 Hợp chất MP13 (Calycosin) 61 3.4 Kết thử DPPH chất tinh khiết 64 CHƯƠNG BÀN LUẬN 68 4.1 Về đặc điểm thực vật học 68 4.2 Về thành phần hóa học 68 4.3 Về tác dụng chống oxy hóa 69 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 5.1 Kết luận 71 5.1.1 Về thực vật học sơ định tính thành phần hóa học 71 5.1.2 Về hóa học 71 5.1.3 Tác dụng chống oxy hóa 72 5.2 Đề nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC vi TÓM TẮT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Khóa tốt nghiệp thạc sĩ - Năm Học 2018-2020 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ BẠCH CHỈ NAM (Radix Millettiae pulchrae) Đinh Thị Bách Giảng viên hướng dẫn: TS Mã Chí Thành Mở đầu đặt vấn đề Bạch nam loại dược liệu có tác dụng dược lí cơng dụng tốt Theo kinh nghiệm cổ truyền, Bạch nam có tác dụng để trị cảm mạo, sốt nóng, nhức đầu, Ngày nay, với khuynh hướng trở với hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên,các thành phần, đặc biệt chất chống oxy hóa trị ung thư Bạch nam nói riêng thuốc khác nói chung ngày quan tâm nhiều Vì đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa rễ củ Bạch nam (Radix Millettiae pulchrae)” tiến hành nhằm mục đích chiết xuất phân lập, tinh chế xác định cấu trúc hợp chất rễ Bạch nam, phục vụ cho cơng tác điều chuẩn hóa dược liệu nghiên cứu tác dụng dược lí sau Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu: Rễ củ Bạch nam (Milletta pulchra Kurz Fabaceae) thu hái An Giang (11/2018) Phương pháp nghiên cứu; chiết xuất phương pháp ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng- lỏng, sắc kí cột phương pháp tinh chế khác Kết Từ 6,0 kg dược liệu Bạch nam, chiết 3,0 lít cao cồn 96% đậm đặc Bằng phương pháp chiết phân bố với dung môi khác thu phân đoạn cao n-hexan (50,0 g), ethyl acetat (17,6 g) n-butanol (147,0 g) Từ phân đoạn ethyl acetat, hợp chất tinh khiết phân lập xác định karanjin (1150 g), vii pongamol (4,0 mg), MP3 (1,58 mg), MP4 (9,7 mg), fujikinetin (3,0 mg), macckiain (15,7 mg), acid 4-O-methyl-karanjic (5,5 mg), acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2Hchromen-6-carboxylic (3,2 mg), pseudobaptigenin (10 mg), 3-O-methylbutein (4,4 mg), genistein (30 mg), daidzein (15 mg), calycosin (5,9 mg) chất tinh khiết chưa xác định cấu trúc MP14 (0,3 mg), MP15 (1,0 mg), MP16 (0,3 mg), MP17 (0,3 mg) Kết luận Từ phân đoạn cao ethyl acetat rễ củ Bạch nam phân lập 17 hợp chất tinh khiết Cấu trúc hợp chất xác định là: karanjin, pongamol, fujikinetin, macckiain, acid 4-O-methyl-karanjic, acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6carboxylic, pseudobaptigenin, 3-O-methylbutein, genistein, daidzein calycosin có hợp chất xác định cấu trúc MP3, MP4 chất tinh khiết chưa xác định cấu trúc MP14, MP15, MP16, MP17… Trong đó, hợp chất karanjin thành phần có hàm lượng cao Bạch nam Các hợp chất làm tiền đề cho nghiên cứu hoạt tính sinh học (chống oxi hoá, kháng viêm, độc tế bào), tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu Bạch nam viii Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-11.4 Phổ 13C – CPD (MeOD – d4; 100 MHz) hợp chất MP11 (trích vùng δC 82– 146) PL-11.5 Phổ HSQC (MeOD – d4 ; 100/400 MHz) hợp chất MP11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL55 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-11.6 Phổ HSQC (MeOD – d4; 100/400 MHz) vùng δ H 6,9 – 7,7; δ C 112– 134 ppm MP11 PL-11.7 Phổ HMBC (MeOD – d4; 100/400 MHz) hợp chất MP11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL56 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-11.8 Phổ HMBC (MeOD – d4 ; 100/400 MHz) vùng δ H 6,65 – 7,75; δ C 110 – 134 ppm MP11 PL-11.9 Phổ 1H –1H COSY(MeOD – d4 ; 400 MHz) hợp chất MP11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL57 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 12 PHỔ NMR HỢP CHẤT MP12(Daidzein) PL- 12.1 Phổ 1H –NMR (MeOD – d4; 400 MHz) hợp chất MP12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL58 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12.2 Phổ 1H –NMR (MeOD – d4; 400 MHz) hợp chất MP12 (trích vùng δ H 6,30 – 7,55) PL-12.3 Phổ 13C – CPD (MeOD – d4; 100 MHz) hợp chất MP12 PL-12.4 Phổ 13C – CPD (MeOD – d4; 100 MHz) hợp chất MP12 (trích vùng δ C 105– 135) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL59 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12.5.PhổHSQC (MeOD – d4; 100/400 MHz) hợp chất MP12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL60 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12.6 Phổ HSQC (MeOD – d4; 100/400 MHz) vùng δ H 6,1 – 7,5; δ C 100– 135 ppm MP12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL61 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12.7 Phổ HMBC (MeOD – d4; 100/400 MHz) hợp chất MP12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL62 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12.8 Phổ HMBC (MeOD – d4; 100/400 MHz) vùng δ H 6,55 – 7,45; δC 108 – 132 ppm MP12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL63 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12.9 Phổ 1H –1H COSY(MeOD – d4; 400 MHz) hợp chất MP12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL64 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 13 PHỔ NMR HỢP CHẤT MP13(Calycosin) PL-13.1 Phổ 1H –NMR (MeOD – d4; 400 MHz) hợp chất MP13 PL-13.2 Phổ 1H –NMR (MeOD – d4; 400 MHz) hợp chất MP13 (trích vùng δ H 6,55 – 9,30) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL65 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13.3 Phổ 13C – CPD (MeOD – d4; 100 MHz) hợp chất MP13 PL-13.4 Phổ 13C – CPD (MeOD – d4; 100 MHz) hợp chất MP13 (trích vùng δ C 116– 182) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL66 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13.4 Phổ 13C – CPD (MeOD – d4; 100 MHz) hợp chất MP13 (trích vùng δC 78– 144) PL-13.5 Phổ HSQC (MeOD – d4; 100/400 MHz) hợp chất MP13 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL67 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13.6 Phổ HSQC (MeOD – d4; 100/400 MHz) vùng δ H 6,9 – 7,3; δ C 105– 145 ppm MP13 PL-13.7 Phổ HMBC (MeOD – d4; 100/400 MHz) hợp chất MP13 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL68 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13.8 Phổ 1H –1H COSY(MeOD – d4; 400 MHz) hợp chất MP13 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL69 ... TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ BÁCH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ BẠCH CHỈ NAM (Radix Millettiae pulchrae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Chuyên... NGHIỆP Khóa tốt nghiệp thạc sĩ - Năm Học 2018-2020 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ BẠCH CHỈ NAM (Radix Millettiae pulchrae) Đinh Thị Bách Giảng viên hướng dẫn:... học nghiên cứu tác dụng sinh học khác số lồi có tác dụng kháng ung thư vú, chống oxy hóa Ở Việt Nam, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Bạch nam cịn Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu thành