Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá và thân cây đậu biếc clitoria ternatea l fabaceae

i BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH * NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ VÀ THÂN CÂY ĐẬU BIẾC Clitoria ternatea L Fabaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2020 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH * NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ VÀ THÂN CÂY ĐẬU BIẾC Clitoria ternatea L Fabaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO TP Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nguyễn Hồng Nhung iii TĨM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020 Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ VÀ THÂN CÂY ĐẬU BIẾC (Clitoria ternatea L Fabaceae) Nguyễn Hồng Nhung Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Mở đầu đặt vấn đề Việc nghiên cứu chất mang hoạt tính sinh học cao có khả chống oxy hóa có lồi cây, cỏ tác dụng thiết thực đời sống hàng ngày vấn đề quan tâm tồn xã hội Gần đây, có loại sử dụng loại cảnh đẹp lạ, Đậu Biếc (Clitoria ternatea L.) Tuy nhiên, bên cạnh việc dùng để làm cảnh, đem lại số tác dụng chữa bệnh giải nhiệt, chống nhiễm trùng phổi, ho, viêm lở da Về hóa thực vật, có diện flavonoid, saponin, alkaloid triterpenoid Để góp phần tìm hiểu thêm giá trị mà thuốc đem lại, lý thực đề tài “Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa thân Đậu biếc (Clitoria ternatea)” Đối tượng Thân Đậu Biếc thu hái thành phố Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu vào tháng 10/2019 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn phần mặt đất Đậu Biếc phương pháp DPPH Sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 80%, chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột pha thuận, sắc ký rây phân tử phương pháp tinh chế khác để phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp phổ học (UV, MS, NMR) Kết bàn luận Ở nồng độ thử nghiệm 100 50 µg/ml, cao có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự cao ethyl acetat ≈ cao chloroform > cao nước > cao n-hexan Bột dược liệu (10 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 80%, cô thu hồi dung môi, loại chlorophyll, chiết phân bố lỏng-lỏng, loại dung môi thu cao n-hexan (3,2 g), cao chloroform (26,5 g), cao ethyl acetat (98,5 g) cao nước (250,0 g) Từ 50 g cao ethyl acetat qua trình phân lập thu hợp chất: kaempferol-3-O-neohesperidosid (6700 mg), kaempferol (17,8 mg), lobatchrosin (12,3 mg), astragalin (1000 mg) isoquercitrin (22,5 mg) Trong đó, hợp chất lobatchrosin lần phân lập từ chi Clitoria Kaempferol-3-O-neohesperidosid, lobatchrosin, astragalin khơng có hoạt tính chống oxy hóa Kaempferol isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa mức độ trung bình Kết luận Từ cao phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh phân lập hợp chất: kaempferol-3-O-neohesperidosid (6700 mg), kaempferol (17,2 mg), lobatchrosin (12,3 mg), astragalin (1030 mg) isoquercitrin (22,5 mg) Trong đó, hợp chất lobatchrosin lần phân lập từ chi Clitoria Kaempferol-3-O-neohesperidosid, lobatchrosin, astragalin hoạt tính chống oxy hóa Kaempferol isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa trung bình iv ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2018– 2020 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206 BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM THE LEAVES AND THE STEMS OF BUTTERFLY PEA (CLITORIA TERNATEA L.) Nguyen Hong Nhung Supervisors: Dr Vo Văn Leo Introduction Researching substances with high biological activity and antioxidant properties in plants and grasses that have practical effects in daily life and that is also a concern of the whole society Recently, there is a plant that has been used as a beautiful and exotic bonsai, the tree Pea (Clitoria ternatea L.) However, besides being used as an ornamental, the tree also offers a number of therapeutic effects such as cooling, preventing lung infections, coughing, and skin sores In phytochemical terms, there are flavonoids, saponins, alkaloids and triterpenoids in the plant In order to contribute to learning more about the value of this medicinal plant, the study of the chemical composition of Clitoria ternatea" was carried out Materials Stems and leaves of Clitoria ternatea L were collected from Bac Lieu city, Bac Lieu province in Ortober, 2019 Methods The antioxidant activities of extracts, fractions and isolated compounds were tested by DPPH assay in vitro Percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography,… and other purification methods were used for extracting and separating Structure determination was based on UV, MS and NMR spectrometric methods Results and discussion Screening to choose the highest antioxidant fraction at the concentration of 100 and 50 μg/ml, the antioxidant activities of fractions decrease in order: ethyl acetate fraction, chloroform fraction, water fraction, n-hexan fraction Dried aerial parts of Clitoria ternatea L (10 kg) was extracted with 80% ethanol, solvent was removed by evaporating under reduced pressure to give the ethanol extract The extract was diluted with water and distributed into fractions: n-hexan (3.2 g), chloroform (26.5 g), ethyl acetate (98.5 g) and water (250.0 g) From the ethyl acetate fraction (the highest antioxidant fraction), compounds: kaempferol-3-O-neohesperidosid (6700 mg), kaempferol (17.8 mg), lobatchrosin (12.3 mg), astragalin (1000 mg) and isoquercitrin 22.5 mg) Among them, lobatchrosin have been isolated from Clitoria genus for the first time Kaempferol-3-O-neohesperidoside, lobatchrosin, astragalin have no antioxidant activity Kaempferol and isoquercitrin has a medium antioxidant activity Conclutions compounds: kaempferol-3-O-neohesperidoside (6700 mg), kaempferol (17.2 mg), lobatchrosin (12.3 mg), astragalin (1030 mg) and isoquercitrin were isolated from the ethyl acetate fraction which is the highest antioxidant fraction According to published data, until now lobatchrosin have been isolated from Clitoria genus for the first time Kaempferol-3-Oneohesperidoside, lobatchrosin, astragalin have no antioxidant activity Kaempferol and Isoquercirin showed medium antioxidant activity v MỤC LỤC TÓM TẮT iii MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm chi Clitoria 1.1.3 Thực vật học loài Đậu Biếc 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC LỒI ĐẬU BIẾC 1.3 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY ĐẬU BIẾC 1.3.1 Tác dụng dược lý 1.3.2 Công dụng Đậu Biếc 11 1.4 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA 12 1.4.1 Đại cương gốc tự 12 1.4.2 Các chất chống oxy hóa 12 1.4.3 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Nguyên liệu 19 2.1.2 Dung mơi, hóa chất, dụng cụ sử dụng 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Khảo sát thực vật học 21 2.2.2 Thử tinh khiết 21 2.2.3 Nghiên cứu thành phần hoá học 21 2.2.4 Thử tác dụng chống oxy hố mơ hình DPPH 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 27 3.1.1 Đặc điểm hình thái 27 3.1.2 Đặc điểm vi học 28 vi 3.1.3 Soi bột 32 3.2 THỬ TINH KHIẾT 32 3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC 33 3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 33 3.4.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 33 3.4.2 Xác định HTCO cao phân đoạn dịch chiết 34 3.4.3 Chiết xuất tách phân đoạn 36 3.4.4 Phân lập cao CT-E 37 3.4.5 Phân lập kiểm tra độ tinh khiết hợp chất từ cao CT-E 40 3.4.6 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 51 3.5 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CHẤT TINH KHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP DPPH 66 CHƯƠNG BÀN LUẬN 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC PL.1 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chi Clitoria [4] Bảng 2.1 Cách pha mẫu đo phương pháp DPPH 25 Bảng 3.1 Kết thử tinh khiết dược liệu Đậu biếc 32 Bảng 3.2 Hàm lượng chất chiết dược liệu Đậu biếc .33 Bảng 3.3 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật Đậu biếc .33 Bảng 3.4 Kết thử nghiệm HTCO cao chiết 35 Bảng 3.5 Kết sắc ký cột nhanh cao CT-E 38 Bảng 3.6 Kết sắc ký cột cổ điển phân đoạn E3.5 40 Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ tinh khiết CT2 UPLC-PDA 41 Bảng 3.8 Kết sắc ký rây phân tử tủa từ phân đoạn E4 42 Bảng 3.9 Kết kiểm tra độ tinh khiết CT3 UPLC-PDA 44 Bảng 3.10 Kết kiểm tra độ tinh khiết CT4 UPLC-PDA 46 Bảng 3.11 Kết sắc ký cột cổ điển phân đoạn E10 .46 Bảng 3.12 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn E10.4 47 Bảng 3.13 Kết kiểm tra độ tinh khiết CT5 UPLC-PDA 48 Bảng 3.14 Kết kiểm tra độ tinh khiết CT1 UPLC-PDA 51 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR CT2 53 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ NMR CT3 55 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR CT4 58 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR CT1 61 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ NMR CT5 65 Bảng 3.20 Kết thử HTCO vitamin C 31 Bảng 3.21 Kết thử HTCO CT1 31 Bảng 3.22 Kết thử HTCO CT2 31 Bảng 3.23 Kết thử HTCO CT3 32 Bảng 3.24 Kết thử HTCO CT4 32 viii Bảng 3.25 Kết thử HTCO CT5 32 Bảng 3.26 Tổng kết HTCO chất tinh khiết phân lập 66 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh loài Đậu biếc Hình 1.2 Cấu trúc hóa học số flavonoid tiêu biểu phân lập từ Đậu biếc Hình 1.3 Phản ứng trung hịa gốc DPPH 16 Hình 2.1 Hình ảnh nguyên liệu Đậu biệc thực nghiên cứu 19 Hình 3.1 Hình thái phần mặt đất loài Đậu biếc 27 Hình 3.2 Vi phẫu sơ đồ cấu tạo Đậu biếc 28 Hình 3.3 Vi phẫu chi tiết gân 29 Hình 3.4 Vi phẫu chi tiết phiến 29 Hình 3.5 Biểu bì Đậu biếc 30 Hình 3.6 Vi phẫu sơ đồ cấu tạo thân Đậu biếc 31 Hình 3.7 Vi phẫu chi tiết thân 31 Hình 3.8 Các cấu tử bột dược liệu phần mặt đất Đậu biếc .32 Hình 3.9 Sắc ký đồ cao phân đoạn với thuốc thử DPPH 35 Hình 3.10 Sơ đồ phân tách cao phân đoạn từ dịch chiết thân Đậu biếc 37 Hình 3.11 Sắc ký đồ phân đoạn E1 – E14 39 Hình 3.12 Sắc ký đồ đánh giá HTCO phân đoạn E1 – E14 SKLM 39 Hình 3.13 sắc ký đồ phân đoạn E3.1 – E3.3 41 Hình 3.14 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết CT2 SKLM .41 Hình 3.15 Sắc ký đồ UPLC-PDA kiểm tra độ tinh khiết CT2 42 Hình 3.16 Sắc ký đồ phân đoạn E4.1 – E4.3 .43 Hình 3.17 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết CT3 SKLM .43 Hình 3.18 Sắc ký đồ UPLC-PDA kiểm tra độ tinh khiết CT3 44 Hình 3.19 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết CT4 SKLM .45 ix Hình 3.20 Sắc ký đồ UPLC-PDA kiểm tra độ tinh khiết CT4 45 Hình 3.21 Sắc ký đồ phân đoạn E10.1 – E10.7 47 Hình 3.22 Sắc ký đồ phân đoạn E10.4.1 – E10.4.2 47 Hình 3.23 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết CT5 SKLM .48 Hình 3.24 Sắc ký đồ UPLC-PDA kiểm tra độ tinh khiết CT5 49 Hình 3.25 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết CT1 SKLM .50 Hình 3.26 Sắc ký đồ UPLC-PDA kiểm tra độ tinh khiết CT1 50 Hình 3.27 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao ethyl acetat Đậu biếc .51 Hình 3.28 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY CT2 53 Hình 3.29 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY CT3 56 Hình 3.30 cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY CT4 59 Hình 3.31 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY CT1 63 Hình 3.32 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY CT5 66 Hình 3.33 Biểu đồ so sánh IC50 chất thể HTCO 67 PL-18 Phụ lục 3.10 Phổ HSQC (DMSO, 125/500 MHz) vùng 3,0 – 3,6 x 55 – 80 ppm CT4 Phụ lục 3.11 Phổ HMBC (DMSO, 125/500 MHz) vùng 10 – 13 x 95 – 170 ppm CT4 PL-19 Phụ lục 3.12 Phổ HMBC (DMSO, 125/500 MHz) vùng – 8,5 x 90 – 180 ppm CT4 Phụ lục 3.13 Phổ HMBC (DMSO, 125/500 MHz) vùng 2,5 – x 55 – 105 ppm CT4 PL-20 Phụ lục 3.14 Phổ COSY (DMSO, 500 MHz) vùng 6,1 – 8,1 ppm CT4 Phụ lục 3.15 Phổ COSY (DMSO, 500 MHz) vùng 3,0 – 6,0 ppm CT4 PL-21 Phụ lục Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) CT1 PL-22 Phụ lục Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) vùng 95 – 180 ppm CT1 Phụ lục Phổ 13C-NMR (MeOD, 100 MHz) vùng 17– 80 ppm CT1 Phụ lục Phổ 1H-NMR (MeOD, 400MHz) CT1 PL-23 Phụ lục Phổ 1H-NMR (MeOD, 400MHz) vùng 5,2 – 8,1 ppm CT1 Phụ lục Phổ 1H-NMR (MeOD, 400MHz) vùng 0,9 – 4,1 ppm CT1 PL-24 Phụ lục Phổ HSQC (MeOD, 100/400 MHz) vùng 5,1 – 8,1 x 90 – 135 ppm CT1 Phụ lục 10 Phổ HSQC (MeOD, 100/400 MHz) vùng 0,9 – 4,1 x 15 – 80 ppm CT1 PL-25 Phụ lục 4.10 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) vùng 5,9 – 8,1 x 90 – 175 ppm CT1 Phụ lục 4.11 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) vùng 5,1 – 5,9 x 60 – 135 ppm CT1 PL-26 Phụ lục 4.12 Phổ HMBC (MeOD, 100/400 MHz) vùng 0,9 – 4,1 x 15 – 105 ppm CT1 Phụ lục 4.13 Phổ COSY (MeOD, 400 MHz) CT1 PL-27 Phụ lục 5.2 Phổ 13C-NMR (DMSO, 100 MHz) CT5 Phụ lục 5.3 Phổ 13C-NMR (DMSO, 100 MHz) vùng 60 – 180 ppm CT5 PL-28 Phụ lục 5.4 Phổ 1H-NMR (DMSO, 400 MHz) CT5 Phụ lục 5.5 Phổ 1H-NMR (DMSO, 400 MHz) vùng 2,8 – 3,7 ppm CT5 PL-29 Phụ lục 5.6 Phổ HSQC (DMSO, 100/400 MHz) CT5 Phụ lục 5.7 Phổ HMBC (DMSO, 100/400 MHz) vùng 5,8 – 7,9 x 90 – 180 ppm CT5 PL-30 Phụ lục 5.8 Phổ HMBC (DMSO, 100/400 MHz) vùng 2,9 – 5,6 x 60 – 135 ppm CT5 Phụ lục 5.9 Phổ COSY (DMSO, 500 MHz) CT5 PL-31 Phụ lục Bảng 0.1 Kết thử HTCO vitamin C Ống Nồng độ cuối (µg/ml) Chứng Độ hấp thu trung bình 0,419 HTCO (%) 25,00 0,042 89,89 12,50 0,044 89,57 6,25 0,062 85,27 3,13 0,249 40,45 1,56 0,332 20,78 0,78 0,372 11,23 0,39 0,387 7,48 0,20 0,400 4,38 IC50= 3,68 µg/ml= 20,90 µM Phụ lục Bảng 0.2 Kết thử HTCO CT1 Nồng độ cuối (µg/ml) Độ hấp thu trung bình 0,419 200,00 0,372 11,23 100,00 0,416 0,64 Ống Chứng HTCO (%) Phụ lục Bảng 0.3 Kết thử HTCO CT2 Nồng độ cuối (µg/ml) Độ hấp thu trung bình 0,419 200,00 0,043 89,65 100,00 0,054 87,10 50,00 0,060 85,75 25,00 0,063 84,95 12,50 0,259 38,22 6,25 0,343 17,99 3,13 0,398 4,86 1,56 0,411 1,83 Ống Chứng HTCO (%) IC50= 15,40 µg/ml= 53,80 µM PL-32 Phụ lục Bảng 0.4 Kết thử HTCO CT3 Nồng độ cuối (µg/ml) Độ hấp thu trung bình 0,419 200,00 0,413 1,43 100,00 0,435 -3,98 Ống Chứng HTCO (%) Phụ lục 10 Bảng 0.5 Kết thử HTCO CT4 Nồng độ cuối (µg/ml) Độ hấp thu trung bình 0,419 200,00 0,377 9,87 100,00 0,406 2,95 Ống Chứng HTCO (%) Phụ lục 11 Bảng 0.6 Kết thử HTCO CT5 Nồng độ Độ hấp cuối thu trung (µg/ml) bình Chứng 0,419 Ống HTCO (%) 200,00 0,046 89,02 100,00 0,053 87,35 50,00 0,070 83,29 25,00 0,232 44,63 12,50 0,324 22,67 6,25 0,371 11,46 3,13 0,396 5,49 1,56 0,404 3,58 IC50= 29,35 µg/ml= 63,25 µM ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH * NGUYỄN HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA L? ? VÀ THÂN CÂY ĐẬU BIẾC Clitoria ternatea L Fabaceae. .. số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA L? ? VÀ THÂN CÂY ĐẬU BIẾC (Clitoria ternatea L Fabaceae) Nguyễn Hồng Nhung Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Văn L? ??o Mở đầu... l? ??p Hoa hồng) Liên Fabanae (Liên Đậu) Bộ Fabales (Bộ Đậu) Họ Fabaceae (Họ Đậu) Chi Clitoria L Loài Clitoria ternatea L (Đậu Biếc) 1.1.2 Đặc điểm chi Clitoria Thảo dược l? ?u năm bụi nhỏ, thân leo