Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá muntingia calabura l

I- Tên đề tài: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L.. Trong nghiên cứu này dịch chiết ethanol 70% EMC70, etha

Cán bộ hướng dẫn khoa học : Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày 11 tháng 11 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

1 PGS TS Nguyễn Tiến Thắng Chủ tịch

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phạm Hữu Tuấn Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 18/04/1993 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 1541880011

I- Tên đề tài:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L

II- Nhiệm vụ và nội dung:

Nhiệm vụ: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học của lá

cây trứng cá

Nội dung: Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, định tính thành phần hóa học bằng phương

pháp hóa, khảo sát năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường

huyết, khả năng giải độc gan, khả năng điều trị tiêu chảy, định tính một số thành phần

hóa học nhờ sắc ký cao áp ghép khối phổ

III- Ngày giao nhiệm vụ: (Ngày bắt đầu thực hiện LV ghi trong QĐ giao đề tài)

15/02/2017

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2017

V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên)

Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các bạn

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống

TÓM TẮT

Cây trứng cá (Muntingia calabura) được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam

và thường dùng để làm bóng mát nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu Trong nghiên cứu này dịch chiết ethanol 70% (EMC70), ethanol 90% (EMC90) và dịch chiết nước (AMC) từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ thành phần hóa học và khảo sát một số hoạt tính sinh học bao gồm: Khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường huyết, khả năng trị tiêu chảy, khả năng giải độc gan đồng thời định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp LC-MS/MS Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, tannin và steroid trong các dịch chiết EMC70 và EMC90, trong khi AME chứa saponin và amino acid tự do Kết quả định tính cũng cho thấy hàm lượng pholyphenol, flavonoid và tannin tổng số trong dịch chiết EMC70 là cao nhất Khả năng kháng

khuẩn của EMC70 và EMC90 là tương đương nhau đối với các chủng E.coli-ETEC,

Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua và Staphylococcus aureus Dịch chiết EMC90 có khả năng hạ đường huyết tốt nhất trong tổng số 2 loại

dịch chiết còn lại tại nồng độ 200 mg/kg Khả năng ức chế tiêu chảy của dịch chiết EMC70 tại nồng độ 750 mg/kg lên tới 78,87 % và tương đương với đối chứng loperamide 3 mg/ml Khả năng giải độc gan của 3 loại dịch chiết được xác định dựa trên chỉ số men gan ALT và AST Dịch chiết EMC70 tại nồng độ 50 mg/kg với kết quả giá trị ALT giảm đáng kể so với lúc trước khi được chữa trị Phân tích HPLC-

MS của dịch chiết EMC70 cho kết quả hướng tới sự hiện diện của chrysoeriol có khả năng bảo vệ gan nhiễm độc cũng như tác động tích cực trong điều trị bệnh tiểu đường Một số chất khác thuộc nhóm flavonoid cũng được tìm thấy trong dịch chiết này Kết

quả tổng hợp cho thấy cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, tiềm năng

kháng khuẩn đối với một số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột, khả năng trị tiêu chảy, điều hòa đường huyết và bảo vệ gan của dịch chiết ethanol

ABTRACT

Muntingia calabura L was grown in southern Vietnam Until now there are

not many scientific articles published on the bioactivity of Muntingia calabura

leaves In this study, ethanol 70% extract (EMC70), ethanol 90% extract (EMC90)

and aqueous extract (AMC) from Muntingia calabura leaves are used to test

phytochemical and evaluation of bioactivities such as antioxidant, antimicrobial activity, hypoglycemia, anti-diarrhea and hepatoprotective activity Determination of compounds by high performance liquid chromatography ‒ mass spectrometry (HPLC/MS) The result of phytochemical screening showed that phenolics, flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90 AMC with saponins and free amino acids Result of EMC70 in total polyphenol content, total flavonoid content and total tannin content were highest Antimicrobial activity of EMC70 and ECM90

were the same in E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria

innocua and Staphylococcus aureus Anti-diarrhea activity of EMC70 was reached

78.87% and it was equivalent to the group was treated by loperamide 3 mg/ml Hepatoprotective activity of EMC70, EMC90 and AMC was determined based on ALT and AST EMC70 resulted in a significant reduction in ALT at 50 mg/kg compared with prior to treatment Qualitative HPLC/MS analysis of EMC70 was showed the results toward the presence of chrysoeriol that is capable of protecting the liver from toxicity as well as positive effects in treatment of diabetes Other flavonoid compounds were found in this extract The results in this study were showed that

Muntingia calabura had antioxidant activity, potential antimicrobial activity,

anti-diarrhea activity, hypoglycemia and hepatoprotective activity of ethanol extracts

MỤC LỤC

TRANG

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DÁNH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về cây Muntingia calabura 4

1.1.1 Nguồn gốc 4

1.1.2 Phân loại 4

1.1.3 Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura 4

1.1.4 Công dụng 6

1.1.5 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura 6

1.1.6 Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian 8

1.1.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 9

1.2.Tổng quan về chất chống oxi hóa 11

1.2.1 Khái niệm chất chống oxi hóa 11

1.2.2 Cơ chế chống oxi hóa của các hợp chất tự nhiên 11

1.2.3 Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả năng chống oxi hóa 11

1.3 Vi sinh vật chỉ thị 12

1.3.1 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia 12

1.3.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Listeria 13

1.3.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella 15

1.3.4 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus 17

1.4 Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 19

1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 19

1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 19

1.5 Giới thiệu về bệnh tiểu đường 22

1.5.1 Khái niệm 22

1.5.2 Phân loại 23

1.5.3 Thuốc trị tiểu đường glibenclamide 24

1.6 Giới thiệu về bệnh tiêu chảy 25

1.6.1 Khái niệm 26

1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh 26

1.6.3 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy 28

1.6.4 Cơ chế gây tiêu chảy bằng tác nhân castor oil 29

1.6.5 Thuốc trị tiêu chảy loperamide 29

1.7 Giới thiệu các bệnh về gan và acetaminophen 30

1.7.1 Các bệnh về gan 30

1.7.2 Các loại enzyme của gan 30

1.7.3 Cơ chế gây độc gan của acetaminophen 31

1.7.4 Thuốc giải độc gan Silymarin 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1.Thời gian và địa điểm 34

2.1.1 Thời gian 34

2.1.2 Địa điểm 34

2.2 Đối tượng nghiên cứu 34

2.2.1 Nguyên liệu thực vật 34

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 34

2.2.3 Đối tượng động vật 34

2.2.4 Hóa chất, dụng cự và thiết bị 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1 Thu hái và xử lý mẫu 35

2.3.2 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 35

2.3.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học 38

2.3.4 Hàm lượng flavonoid tổng số 39

2.3.5 Hàm lượng phenolic tổng số 39

2.3.6 Hàm lượng tannin tổng số 39

2.3.7 Phương pháp FRAP 39

2.3.8 Khả năng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH 40

2.3.9 Phương pháp xác định năng lực khử 40

2.3.10 Hoạt tính kháng khuẩn 40

2.3.11 Xác định độc tính cấp diễn 40

2.3.12 Mô hình chuột tiểu đường cấp tính 41

2.3.13 Mô hình chuô ̣t bi ̣ nhiễm độc acetaminophen 41

2.3.14 Mô hình chuột tiêu chảy castor oil 41

2.3.15 Phương pháp sắc ký cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS) 41

2.3.16 Xử lý số liệu 41

2.4 Bố trí thí nghiệm 41

2.4.1 Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura 43

2.4.2 Thí nghiệm 2: Định tính một số thành phần hóa học có trong cây 43

2.4.3 Thí nghiệm 3: Hàm lượng flavonoid tổng số 46

2.4.4 Thí nghiệm 4: Hàm lượng phenolic tổng số 46

2.4.5 Thí nghiệm 5: Hàm lượng tannin tổng số 47

2.4.6 Thí nghiệm 6: Khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp FRAP 47

2.4.7 Thí nghiệm 7: Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH 48

2.4.8 Thí nghiệm 8: Xác định năng lực khử 49

2.4.9 Thí nghiệm 9: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura 51

2.4.10 Thí nghiệm 10: Xác định độc tính cấp diễn 52

2.4.11 Thí nghiệm 11: Mô hình chuột tiểu đường cấp tính 53

2.4.12 Thí nghiệm 12: Mô hình chuột bi ̣ nhiễm độc acetaminophen 54

2.4.13 Thí nghiệm 13: Mô hình chuột tiêu chảy castor oil 55

2.4.14 Thí nghiệm 14: Định tính bằng phương pháp sắc ký sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ HPLC 56

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 57

3.1 Bước đầu góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 57

3.1.1 Khảo sát vi phẩu và soi bột dược liệu 57

3.1.2 Độ tinh khiết của dược liệu 61

3.1.3 Hàm lượng cắn thu được từ dịch chiết lá cây trứng cá 62

3.2 Thành phần hóa học có trong cây Muntingia calabura 62

3.3 Định lượng flavonoid phenolic và tannin 65

3.4 Khả năng chống oxy hóa 65

3.4.1 Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP 65

3.4.2 Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp xác định năng lực khử 67

3.4.3 Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH 68

3.5 Hoạt tính kháng khuẩn 72

3.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muntingia calabura 72

3.5.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC 76 3.6 Độc tính cấp diễn 79

3.7 Khả năng điều hòa đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính 80 3.8 Khả năng trị tiêu chảy trên mô hình castor oil 82

3.9 Khả năng giải độc gan trên mô hình acetaminophen 85

3.10 Phân tích sắc kí HPLC-MS 89

KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 93

4.1 Kết luận 93

4.2 Đề nghị 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1 Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật 20

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu theo dõi 52

Bảng 3.1 Độ ẩm của lá cây và bột dược liệu 61

Bảng 3.2 Định tính thành phần hóa học có trong Muntingia calabura L 63

Bảng 3.3 Hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin tổng số 65

Bảng 3.4 Kết quả tính toán giá trị FRAP 66

Bảng 3.5 Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP 66

Bảng 3.6 Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa theo theo năng lực khử 68

Bảng 3.7 Kết quả IC50 chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH 70

Bảng 3.8 Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH 70

Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với các chủng vi sinh vật khác 74

Bảng 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn từ cây Muntingia calabura L tại nồng độ 100 mg/ml 75

Bảng 3.11 Nồng độ ức chế tối thiểu EMC70 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml 77

Bảng 3.12 Nồng độ ức chế tối thiểu EMC90 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml 77

Bảng 3.13 Nồng độ ức chế tối thiểu AMC ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml 78

Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số hợp chất từ dịch chiết cây Muntingia calabura bằng phương pháp sắc ký HPLC-MC 89

DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG

Hình 1.1 Ảnh chụp cây Muntingia calabura L 5

Hình 1.2 Mô phỏng hình thái cây Muntingia calabura L 5

Hình 1.3 Mô phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa 6

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa 11

Hình 1.5 Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử 12

Hình 1.6 Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB 13

Hình 1.7 Hình thái Listeria monocytogenes trên kính hiển vi điện tử 14

Hình 1.8 Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên môi trường thạch thường 14

Hình 1.9 Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử 15

Hình 1.10 Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey 16

Hình 1.11 Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.12 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk 18

Hình 1.13 Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm 20

Hình 1.14 Cơ sở đánh giá các loại phân 26

Hình 1.15 Sơ đồ chuyển hóa acetaminophen trong cơ thể 32

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát 42

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận cắn chiết từ cây Muntingia calabura 43

Hình 2.3 Quy trình định tính dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura 44

Hình 2.4 Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP 47

Hình 2.5 Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH 48

Hình 2.6 Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo năng lực khử 50

Hình 2.7 Quy trình thực hiện khả năng kháng khuẩn 51

Hình 2.8 Mô hình chuột tiểu đường cấp tính 53

Hình 2.9 Mô hình giải độc gan acetaminophen 54

Hình 2.10 Mô hình tiêu chảy castor oil 55

Hình 3.1 Lông tiết 57

Hình 3.2 Mặt cắt biểu bì lá 57

Hình 3.3 A Mặt cắt ngang thân B Mặt cắt dọc thân 58

Hình 3.4 Mặt cắt dọc hoa cây Muntingia calabura 58

Hình 3.5 A Cấu tạo nhị hoa B Chỉ nhị C Bao phấn 59

Hình 3.6 Hình thái hạt phấn 59

Hình 3.7 Bề mặt cánh hoa 60

Hình 3.8 Cấu tạo noãn 60

Hình 3.9 Bột dược liệu 61

Hình 3.10 Hàm lượng của 3 loại cắn thu được từ lá cây Muntingia calabura 62

Hình 3.11 A Định tính saponin B Định tính flavonoid (thử nghiệm shinoda), C Định tính alkaloid trên AMC, D Định tính amino acid trên AMC, E Định tính phenolic, F Định tính steroid 64

Hình 3.12 Đường chuẩn Fe2+-TPTZ 66

Hình 3.13 Khả năng khử của 3 dịch chiết EMC70, EMC90, AMC và đối chứng acid ascorbic 67

Hình 3.14 Đường chuẩn acid ascorbic nồng độ từ 20 đến 70 µg/ml 68

Hình 3.15 Hoạt tính quét gốc tự do ở các nồng độ từ cây Muntingia calabura 69

Hình 3.16 Hoạt tính chống oxi hóa của acid ascorbic 69

Hình 3.17 Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do của EMC70 ở các nồng độ khác nhau 70

Hình 3.18 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC 73

Hình 3.19 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri và Shigella boydii 73

Hình 3.20 A Hoạt tính kháng khuẩn của EMC90 (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri, B AMC (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes, C EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC, D EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus 76

Hình 3.21 Chỉ số đường huyết của các nhóm chuột uống cao chiết, nhóm tăng đường, đối chứng và glibenclamide 10 mg/kg 80

Hình 3.22 Tỷ lệ ức chế tiêu chảy 82

Hình 3.23 Thời gian tiêu chảy 83

Hình 3.24 Chỉ số men gan ALT của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70, EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng 86

Hình 3.25 Chỉ số men gan AST của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70,

EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng 87

Hình 3.26 Sắc ký đồ HPLC-MS dịch chiết EMC70 từ lá cây Muntingia calabura 90

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây thuốc dân gian từ lâu đã được nhiều người quan tâm đến Từ những năm đầu thế kỷ XX con người ta đã biết sử dụng thực vật như một nguồn thuốc chữa bệnh bằng kinh nghiệm dân gian Theo đà phát triển của lịch sử, kho tàng kinh nghiệm dân gian phòng chống bệnh tật ngày càng phong phú và đa dạng Đây là nguồn tài nguyên thực vật có giá trị cao trong việc phòng chữa nhiều loại bệnh thay cho một số loại thuốc Tây y Trong chẩn đoán và điều trị bệnh, một số loại thuốc Tây y luôn đi kèm với nhiều tác dụng phụ không mong muốn như nôn mửa, rối loạn tiêu hóa, chóng mặt, nhức đầu, có nguy cơ tái bệnh,… Bên cạnh một hiện trạng thực tế là việc kháng thuốc kháng sinh ngày càng trở nên phổ biến ở các nước phát triển thì việc tìm đến các loại thảo dược thiên nhiên để chữa bệnh thay cho các loại thuốc tây là điều tất yếu và dần đang trở thành một xu thế Trong những năm trở lại đây, từ xu hướng sử dụng các loại cây thuốc dân gian để chữa bệnh, các nước phát triển đầu tư vào nghiên cứu nhiều loại cây thuốc dân gian nhằm tách chiết cũng như trích ly các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học để tìm ra hướng ứng dụng và điều chế nhiều loại thuốc mới

Cây mật sâm (trứng cá) trên một số nghiên cứu trên thế giới có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn cùng với kháng viêm Tại Việt Nam, cây trứng cá chủ yếu được trồng khắp nơi để làm bóng mát với số lượng đáng kể, nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu đến Thậm chí, ở nhiều nơi còn bắt đầu chặt phá loài cây này Tannin, một thành phần hóa học được biết đến với khả năng ức chế quá trình tiêu chảy được tìm thấy nhiều trong cây trứng cá nhưng cho tới hiện nay vẫn chưa có bất

cứ nghiên cứu nào liên quan tới khả năng này Nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu tiềm năng trong chữa trị một số bệnh cũng như khẳng định tầm quan trọng cây trứng

cá trong từ điển trị liệu Đông y Chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá

Muntingia calabura L.” nhằm tìm hiểu sâu hơn về tác dụng sinh học, cũng như hướng

ứng dụng thực tiễn cùng với khả năng chữa bệnh của cây trứng cá theo một góc nhìn khoa học

3 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học

Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cây Muntingia calabura

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các dịch chiết từ lá cây Muntingia calabura Đánh giá khả năng hạ đường huyết của cây Muntingia calabura trên mô hình

động vật

Đánh giá khả năng trị tiêu chảy của cây Muntingia calabura trên mô hình

động vật

Đánh giá khả năng bảo vệ gan chống lại chất độc từ cây Muntingia calabura

Định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp HPLC/MS

4 Ý nghĩa khoa học

Lá cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, kháng một số vi

khuẩn gây hại ở đường ruột, có tiềm năng bảo vệ gan và ổn định đường huyết

Bên cạnh đó, hoạt tính lá cây Muntingia calabura có tiềm năng phòng ngừa

và hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy mà các nghiên cứu trong và ngoài nước chưa thấy nghiên cứu về tác dụng sinh học này

5 Ý nghĩa thực tiễn

Nguyên liệu lá cây Muntingia calabura trong nghiên cứu có tác dụng điều

hòa đường huyết, giải độc gan cũng như chống lại một số chủng gây bệnh đường ruột

hỗ trợ điều trị tiêu chảy nên có thể ứng dụng làm thực phẩm chức năng Một sản phẩm hướng ứng dụng của lá cây này là làm trà thảo mộc ngăn ngừa béo phì và các biến chứng về tim mạch, ngăn ngừa các bệnh về gan và tốt cho hệ tiêu hóa Sản phẩm này mang lại hiệu quả về mặt kinh tế vì có nguồn nguyên liệu phong phú, giá rẻ Nghiên cứu cũng chứng minh được hoạt tính dược lý của bộ phận lá nên cũng góp phần tạo

nên thu nhập cho người dân trồng loại cây này

6 Phạm vi nghiên cứu

Khảo sát chỉ giới hạn trên đối tượng là bộ phận lá

Các khảo sát chỉ thực hiện trên 3 loại dung môi ethanol 70%, ethanol 90% và nước

Giới hạn khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chỉ trên 9 chủng vi sinh vật chỉ thị Khảo sát khả năng giải độc gan chỉ dựa trên 2 loại enzyme alanine transaminase và aspartate transaminase

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây Muntingia calabura L

1.1.1 Nguồn gốc

Cây trứng cá hay còn gọi là cây mật sâm có tên khoa học là Muntingia

calabura, thuộc họ Elaeocarpaceae (Morton, 1987), loài duy nhất của giống Muntingia, là cây có hoa ở phía nam Mexico, Caribean, trung Mỹ và đông nam Mỹ,

các quần đảo Bắc Mỹ, các mẫu cây còn được tìm thấy ở Jamaica Ngoài ra nó còn được trồng ở khu vực ấm áp như Ấn Độ hay một số quốc gia trong khu vực Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Philippines và Việt Nam (Jensen, 1999) Lá, vỏ cây

và hoa có giá trị làm thuốc chữa bệnh

1.1.2 Phân loại

1.1.3 Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura

Muntingia calabura là loài cây mọc phát triển nhanh chóng chiều cao có thể

đạt được từ 7,5 - 12 m, cùng với cành dang rộng xung quanh Lá dài 5 – 12,5 cm thuông dài nhọn ở cuối lá, mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt sau lá có nhiều lông tơ nhỏ mịn Hoa nhỏ mọc nơi lá, gắn vào các nhánh, hoa rộng 1,25 – 2 cm, hoa mau tàn khoảng một ngày, thường rụng vào buổi chiều Cây mọc nhiều trái nhỏ 1 – 1,25 cm,

Hình 1.1 Ảnh chụp cây Muntingia calabura

(David H Lorence)

Hình 1.2 Mô phỏng hình thái cây Muntingia calabura

(J.S Kerner)

quả Muntingia calabura có màu xanh, vàng và đỏ khi chín, bề mặt nhẵn bóng và

mỏng, quả chứa nhiều hạt nhỏ li ti có vị ngọt và mùi thơm đặc trưng (Morton, 1987)

1.1.4 Công dụng

Cây trứng cá được sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau nhưng chủ yếu

được dùng nhiều trong thực phẩm và trong y học Quả Muntingia calabura được ăn

trực tiếp khi vừa hái khỏi cây Chúng cũng có thể được nấu chín trong bánh nướng hoặc làm thành mứt quả Lá cây có thể được ứng dụng làm trà hoặc làm tăng hương

vị của trà khi ngâm trong nước ấm (Zakaria và ctv, 2007)

1.1.5 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura

1.1.5.1 Saponin

Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch

và tạo bọt Phát hiện trong mẫu có saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt (Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao, 2012)

1.1.5.2 Flavonoid

Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan không giống

Hình 1.3 Mô phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa

nhau Flavonoid glycosid, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu

cơ, tan được trong nước, cồn, aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước Flavonoid được phân loại dựa trên vị trí của gốc aryl đính vào Flavonoid được xác định bằng các thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm acid clohydric

và thử nghiệm Benidict

Flavonoid có vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…), tham gia quá trình lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa

Một số hợp chất Flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như

catechin Chúng là một trong những hợp chất flavonoid có khả năng ức chế Vibrio

cholera, Streptococcus mutans, Shigella và một số vi sinh vật khác Catechin hoạt

động bằng cách vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, cơ chế hoạt động là do khả năng tạo

phức không thuận nghịch với các amino acid ái nhân trong protein từ đó làm bất hoạt chức năng gây bệnh của protein trong vi sinh vật Galangin có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram dương cũng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV-1 và Coxsackie B type I (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010)

1.1.5.3 Tannin

Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid), có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt) Có thể chia tannin làm hai loại tannin thủy phân được (Tannin pyrogalic)

và tannin không thủy phân được (Tannin pyrocatechic) Tannin thủy phân được thì được thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đường (glucose) và phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối sắt III, dễ tan trong nước, ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn Tannin không thủy phân được thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thường là chất

trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng hợp của hai loại), tủa xanh với muối sắt III, ví dụ: Vỏ Quế, Ô môi, Ðại hoàng Tannin thường được định tính bằng thử nghiệm Gelatin, thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm FeCl3, thử nghiệm KMnO4

Tannin có vai trò bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng, công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy

1.1.6 Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian

Theo y học cổ truyền, lá cây trứng cá có thể được sử dụng như trà để điều trị viêm, sưng và hạ sốt Lá trứng cá cũng có thể giúp bảo vệ tim khỏi các cơn đau do có chứa chất chống oxy hóa ngăn ngừa viêm động mạch dẫn đến nhồi máu cơ tim Cây trứng cá chứa một lượng lớn oxit nitric, một hóa chất tự nhiên giúp làm giãn mạch máu, giúp máu lưu thông, hạ huyết áp Quả trứng cá có chứa nhiều hợp chất kháng khuẩn mạnh, biến nó trở thành nguồn chất kháng khuẩn mới nên nó đặc biệt tốt cho

điều trị nhiễm trùng tụ cầu khuẩn, Staphylococcus epidermidis, Proteus vulgaris,

Kocuria rhizophila, Corynebacterium diphtheriae và các vi khuẩn khác nên người

xưa thường dùng dịch chiết đắp lên các vết thương tránh nhiễm trùng (Nhật Linh, 2015) Đây là điều quan trọng vì hiện nay có rất nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh Ở Campuchia cũng như ở Việt Nam cụ thể là tỉnh Khánh Hòa, rễ cây được dùng phối hợp với các vị thuốc khác làm thuốc điều kinh và trị các bệnh về gan Qua nhiều thế

kỷ, nhiều quốc gia sử dụng quả trứng cá để ngăn chặn cơn đau liên quan với bệnh gout, ăn 9-12 quả trứng cá ba lần một ngày có tác dụng tốt cho điều trị cơn đau Quả trứng cá có chứa một số lượng lớn vitamin C là một chất chống oxy hóa mạnh giúp

chống lại cảm lạnh và thậm chí cả bệnh tim mạch Quả trứng cá còn giảm đáng kể lượng đường trong máu nên thường được dùng làm thực phẩm lý tưởng cho các bệnh nhân bị tiểu đường (Nguyễn Vy, 2015) Dịch chiết lá trứng cá làm trà giúp bảo vệ tim khỏi các cơn đau tim vì lá có chứa chất chống oxy hóa ngăn ngừa viêm động mạch dẫn đến nhồi máu cơ tim Trà từ hoa trứng cá khử trùng tốt cho vết thương trên da và

cũng có tác dụng tốt trong điều trị đau bụng Hoa Muntingia calabura được cho là có hoạt tính kháng khuẩn Nước chiết từ hoa Muntingia calabura có tác dụng giảm co thắt, dịch chiết Muntingia calabura còn được dùng để giảm nhức đầu và các triệu

chứng đầu tiên của cảm lạnh (Nhật Linh, 2015)

1.1.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Theo phương thuốc dân gian của người Peru, lá Muntingia calabura khi nấu

lên hoặc sắc thuốc có thể giảm loét dạ dày, giảm sưng tuyến tiền liệt hay giảm bớt cơn đau đầu, các triệu chứng cảm lạnh (J.F Morton, 1987; Zakaria, 2007b) Bên cạnh

đó, dịch chiết lá cây còn có thể dùng như trà để uống (Zakaria, 2007e) Khoa học đã

và đang chứng minh dịch chiết lá cây Muntingia calabura có hoạt tính giảm đau,

kháng viêm và hạ sốt (Yusof, 2011; Sani, 2012; Zakaria, 2006a; 2007; 2007a; 2007f;

2008) Hơn nữa, lá Muntingia calabura có hoạt tính kháng oxi hóa (Siddiqua, 2010; Zakaria, 2007b; 2011), 22 hợp chất được phân lập từ lá cây Muntingia calabura có khả năng chống đông máu (Su et al, 2003) Ngoài ra, hoạt tính kháng khuẩn được

nghiên cứu từ dịch chiết methanol (Yasunaka, 2005) hay các dịch chiết nước,

chloroform (Zakaira, 2006b) Trong những nghiên cứu khác, dịch chiết lá Muntingia

calabura có hoạt tính chống loét dạ dày (Ibrahim et al, 2012; Balan et al, 2013), trị

tiểu đường (Sridhar et al, 2011) và bảo vệ tim mạch (Nivethetha et al, 2009) Dịch

chiết methanol cùng phân đoạn butanol có khả năng chống tăng huyết áp (Shih et al, 2006; 2009) Ngoài ra theo các báo cáo khoa học khác thì lá cây trứng cá còn có khả năng kháng ung bướu (Parka và ctv, 2003), giảm đau nhức (Sulaiman và ctv, 2006), kháng viêm và hạ sốt (Zakaria, 2007) Các khả năng giảm đau, kháng viêm và hạ sốt được phát hiện khi sử dụng dịch chiết nước từ cây

Dịch chiết methanol của quả từ cây Muntingia calabura có khả năng kháng khuẩn đối với chủng Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và

Shigella flexneri (Sibi và ctv 2013)

Một số hợp chất được tìm thấy từ dịch chiết ethanol từ thân cây Muntingia

calabura bao gồm β-Sitosterol, 1,2,3-Benzenetriol, Stigmastan-3,5-diene và

4-Isopropylthiouracil, dịch chiết ethanol từ thân cũng có hoạt tính kháng khuẩn đối với

Staphylococcus aureus, nấm Aspergillus niger và nấm Candida albicans

(Krishnaveni và ctv 2015)

Một số hợp chất mới được tìm thấy trong cây trứng cá bao gồm 2 dihydrochalcones là 2,3-dihydroxy-4,3’,4’,5’-tetramethoxydihydrochalcone và 4,2’,4’-trihydroxy-3’-methoxydihydrochalcone và 1 hợp chất thuộc nhóm flavanone mới đó là (2R,3R)-(-)-3,5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavanone (Chen và ctv 2007)

Phân đoạn ethanol từ là cây Muntingia calabura trong nghiên cứu của Su và ctv 2003

còn tìm thấy sự hiện diện của một số hợp chất chủ yếu thuộc 2 nhóm flavanone and flavone bao gồm (2R,3R)-7-methoxy-3,5,8-trihydroxyflavanone, những hợp chất đã biết như (2S)-5-hydroxy-7-methoxyflavanone, 2’,4’-dihydroxychalcone, 4,2’,4’-trihydroxychalcone, 7-hydroxyisoflavone và 7,3’,4’-trimethoxyisoflavone Cũng được tìm thấy trong loài cây này 3 chất thuộc nhóm flavon và 1 chalcone bao gồm 5,7-dihydroxy-3,8-dimethoxyflavone, 2’,4’-dihydroxychalcone, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone và 3,5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone được tìm thấy trong phân đoạn ethanol (Adila và ctv 2013) Các hợp chất 5-hydroxy-3,7,8-trimethoxyflavone, 3,7-dimethoxy-5-hydroyflavone, 2’,4’-dihydroxy-3’-methoxychalcone, và calaburone trong phân đoạn petroleum ether được cho là có khả năng ức chế quá trình viêm tại nồng độ thử nghiệm là 50 mg/kg (Mohamad và ctv 2013)

Từ những số liệu được công bố trước đó có thể thấy rằng Muntingia calabura

đặc biệt là dịch chiết từ lá cây đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới và đã thu được nhiều kết quả tốt liên quan đến hoạt tính sinh học nhất là từ dịch chiết lá nhưng tại Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu về loài này

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa

1.2.Tổng quan về chất chống oxi hóa

1.2.1 Khái niệm chất chống oxi hóa

Có ảnh hưởng lên phản ứng dây chuyền củ a các gốc tự do Có khả năng ta ̣o nên các gốc tự do bền và kém hoạt động hơn Nhâ ̣n điện tử tự do của các gốc tự do hoa ̣t động biến gốc tự do hoa ̣t động thành gốc tự do kém hoa ̣t động (Gunnell và ctv 2002)

1.2.2 Cơ chế chống oxi hóa của các hợp chất tự nhiên

Các chất chống oxy hóa trong tế bào có thể ngăn cản sự ta ̣o thành của các gốc tự do hoạt động và kết thúc phản ứng dây chuyền gốc tự do (dâ ̣p tắt gốc tự do) Các chất chống oxy hóa là nhóm của các vitamin, chất vô cơ, enzyme và những chất

có nguồn gốc tự nhiên giúp bảo vệ tế bào khi các gốc tự do - những chất là căn nguyên gây ra các tổn hại tế bào (Atta và ctv 2002)

1.2.3 Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả năng chống oxi hóa

1.2.3.1 Vitamin E (α- tocoferol)

Chức vụ thiên nhiên của vitamin E là bảo vệ cơ thể chống những tác du ̣ng độc ha ̣i của những FR Vitamin E gắn nơi màng lipid, và chính nhờ chức vu ̣ gắn gốc phenol mà nó có tính chất có tính chống oxy hóa Nó được xem là hàng phòng thủ trước tiên chống la ̣i quá trình peroxyd hóa lipid

1.2.3.2 Vitamin C (acid ascorbic)

Vitamin C hiện nay là một trong những chế phẩm bổ sung vitamin phổ biến nhất, nó đóng một vai trò hết sức quan trọng trong mọi hoa ̣t động của cơ thể Chức năng của vitamin C là giúp cho cấu trúc collagen ổn định, vitamin C cần thiết cho sự lành vết thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể Vitamin C cũng là một chất chống oxy hóa rất quan trọng Vitamin C hoa ̣t động như một chất chống oxy hóa trong môi trường nước của cơ thể – cả nội bào lẫn ngoa ̣i bào

Các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nhiều trong thực vật, điển hình là nhất

là các hợp chất polyphenol (phenolic acid, flavonoid: flavon, flavonol, isoflavon, anthocyanin, catechin, proanthocyanidinn, tanin và các nhóm hợp chất phenol khác…)

1.3 Vi sinh vật chỉ thị

1.3.1 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia

1.3.1.1 Đặc điểm

Escherichia là một loài vi khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không

sinh bào tử Nhiệt độ thích hợp 370C, pH 7.2-7.4 Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của người và động vật Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây

nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa Đơn cử là Escherichia coli

(Trần Văn Cường, 2009)

Hình 1.5 Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử

Escherichia phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy phổ thông Môi

trường thạch thường: hình thành khuẩn lạc tròn ướt, lồi, bóng láng, màu trắng xám hơi đục, đường kính 2-3mm Môi trường MacConkey khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn, lồi, không làm chuyển màu môi trường Môi trường thạch máu khuẩn lạc

Escherichia to, bóng, lồi, màu xám nhạt Một số chủng có khả năng gây hiện tượng

tan máu Môi trường Simmon citrat khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục Môi trường Endo khuẩn lạc màu đỏ Môi trường EMB khuẩn lạc có ánh kim tím

Đặc điểm sinh hóa dòng Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên dòng Escherichia cụ thể là E coli lên men sinh hơi các loại đường lactose,

fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường duncitol, saccarose và salixin Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn Cường, 2009)

1.3.1.2 Khả năng gây bệnh

Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, vertoxin, neurotoxin

Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009)

1.3.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Listeria

1.3.2.1 Đặc điểm

Hình 1.6 Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB

Listeria là trực khuẩn Gram dương không có vỏ, không sinh bào tử, hiếu khí tùy nghi Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5 µm, chiều dài khoảng 1- 2 µm phát triển ở nhiệt độ 370C đến 400C (Võ Thành Hưng, 2013)

Trên thạch thường vi khuẩn mọc tạo thành những khuẩn lạc nhỏ, tròn, xám

lơ, bóng không tạo bào tử

1.3.2.1 Khả năng gây bệnh

Listeria monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua

cơ chế thực bào Nếu Listeria monocytogenes vẫn còn sống sau giai đoạn đầu xâm

Hình 1.8 Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên môi trường

thạch thường

Hình 1.7 Hình thái Listeria monocytogenes trên kính hiển vi điện tử

nhiễm này, nó được cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt được gọi là internalin, đáng chú ý là internalin A (InlA), internalin B (InlB) inlA tương tác với E – Carherin

tạo điều kiện cho Listeria monocytogenes đi vào tế bào biểu mô, InlB nhận diện Clq –R (hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế

bào của vật chủ như tế bào gan, nguyên sợi bào và các tế bào biểu mô

Listeria monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tháng

tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ

miễn dịch kém (Võ Thành Hưng, 2013)

1.3.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella

1.3.3.1 Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm, mảnh dài 1-3 micromet, rộng 0,5-0,6

micromet, không có tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ, không sinh bào tử,Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện

hiếu khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 370C (Chang Tran, 2014)

Trong môi trường lỏng Shigella làm đục đều môi trường Trên môi trường đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2mm, tròn

lồi, mặt nhẵn bờ đều (Chang Tran, 2014)

Hình 1.9 Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử

Hình 1.10 Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey

Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella

dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm Không sinh H2S, Urease âm tính, phản ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrat âm tính (Chang Tran, 2014)

1.3.3.2 Khả năng gây bệnh

Các shigella đều có độc ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2 chúng làm

thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng tiết dịch

Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính

kháng nguyên yếu Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột Ngoại độc

tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC,

hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với

tế bào Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương và thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng như đau bụng quặn, đi ngoài

nhiều lần, phân có nhiều nhầy và thường có máu Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm

nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ

chức ruột Các Shigella đều có nội độc tố Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc

tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản

ứng tại ruột Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của

Vibrio cholerae 01 và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014)

1.3.4 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus

Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường

kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành

cụm (tụ) trông giống như chùm nho Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm:

Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius và Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri

1.3.4.1 Đặc điểm

Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên

các môi trường nuôi cấy thông thường Staphylococcus có khả năng phát triển được

ở khoảng nhiệt độ dao động từ 100C tới 450C và môi trường có nồng độ muối cao tới 10% (Trần Quang Cảnh, 2012)

Hình 1.11 Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử

Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau

24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng (đối với các loại Staphylococcus khác) (Trần Quang Cảnh, 2012)

Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc

Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có

màu vàng Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng

và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm,

có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm

quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc một số dòng S aureus có thể không tạo các vòng sáng

quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012)

1.3.4.2 Khả năng gây bệnh

Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực nội bào: Staphylococcus aureus còn sản xuất

nhiều yếu tố độc lực có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn Vỏ polysaccharide:

một số chủng Staphylococcus có thể tạo vỏ polysaccharide Vỏ này cùng với protein

A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào Hầu hết các chủng

Staphylococcus aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A)

có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho

các đại thực bào Quá trình gắn trên giúp Staphylococcus aureus tránh không bị thực

Hình 1.12 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird

Parker bổ sung egg yolk

bào bởi đại thực bào Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc (Trần Quang Cảnh, 2012)

Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực ngoại bào: Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm

thì Staphylococcus còn sản xuất một số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực

mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này, cụ thể như hyaluronidase là một enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì Enzyme này gây tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell

do tụ cầu Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng Hầu hết các chủng

Staphylococcus đều sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase) Enzyme này

phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng (Trần Quang Cảnh, 2012)

1.4 Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

Chất kháng khuẩn thực vật là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010)

1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào,

Hình 1.13 Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm

gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế bào Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary metabolites) các hợp chất thứ cấp từ thực vật tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv 2013)

Các hợp chất từ thực vật có tác động kháng khuẩn không chỉ là đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm mà còn với cả nấm, trong đó các chủng Gram âm là nhạy cảm dễ bị các hợp chất thực vật tác động lên nhất, có tới 5 hướng mà các hợp chất thực vật có thể tác động tới các chủng Gram âm Trường hợp điển hình là của thymol, hợp chất này có tác động tới cả màng tế bào của tế bào chất bên ngoài và bên trong bằng cách tích hợp vào nhóm đầu cực của lớp đôi lipid dẫn tới sự chênh lệch, làm tăng tính bán thấm của màng tế bào và gây chết, tuy nhiên thymol cũng có thể tham gia vào việc quy định các gen tham gia vào tổng hợp protein màng ngoài, ức chế enzyme liên quan đến bảo vệ chống lại stress nhiệt, tổng hợp ATP, các con đường trao đổi chất citric Tiềm năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của PSMs có thể

bị ảnh hưởng và phụ thuộc bởi rất nhiều yếu tố như tính năng của tế bào đích (vi khuẩn, nấm, Gram dương, Gram âm), điều kiện môi trường, khả năng hòa tan, nồng

độ, nhiệt độ, độ pH ảnh hưởng quan trọng tới tác động kháng khuẩn của PSMs cũng như các hỗn hợp của chúng (Radulovíc và ctv, 2013)

tế bào

(Toda và ctv 1992)

Acid phenolic Acid cinnamic (Fernandez và

ctv 1996) Quinon Hypericin Kết dính bề

mặt tế bào, bất hoạt enzyme

(Duke, 1985)

Flavonoid Chrysin Kết dính bề

mặt tế bào

(Perrett và ctv 1995)

tế bào

Rojas và ctv (1992)

Abyssinon bất hoạt

enzyme

(Taniguchi và Kubo, 1993)

nghiên cứu

(Kubo và ctv 1993)

Tannin Ellagitannin Kết tụ protein

Kết dính bề mặt tế bào Làm mất chất nền

Rối loạn vách

tế bào Phá vỡ màng

tế bào

(Schultz, 1988) (Scalbert 1991), (Haslam, 1996)

tế bào

(Cichewicz và ctv 1996)

vách tế bào và DNA

(Atta và Choudhary, 1995) Lectin và

polypeptide

Fabatin Tạo cầu nối

disulfid

(Zhang và Lewis, 1997)

8S-Heptadeca-diene-4,6-diyne-1,8-diol

2(Z),9(Z)-Chưa được nghiên cứu

(Estevez và ctv 1994)

1.5 Giới thiệu về bệnh tiểu đường

1.5.1 Khái niệm

Tăng đường huyết là tình tra ̣ng có quá nhiều glucose trong máu do sự dư thừa glucose tại các mô của cơ thể Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có thể coi là tăng đường huyết nếu mức đường trong máu cao hơn 1,26 g/l (lúc đói) hoặc hơn 2g/l (vào những

thời điểm khác trong ngày) Tình trạng này nếu nặng và kéo dài sẽ gây tổn thương cho các mạch máu và mô (Lê Hoa, 2016)

Tăng đường huyết không gây ra triệu chứng cho đến khi giá trị đường huyết cao có ý nghĩa - trên 200 mg / dL (mg / dL), hoặc 11 millimoles / lít (mmol / L) Các triệu chứng củ a tăng đường huyết phát triển từ từ trong vòng vài ngày hoặc vài tuần Đường trong máu càng ở mức cao, càng có nhiều các triệu chứng trở thành nghiêm trọng Các triệu chứng thường lâm sàng là thường xuyên đi tiểu, mờ mắt, mệt mỏi, nhức đầu Nếu tăng đường huyết không được điều trị, nó có thể gây ra Xeton xây dựng lên trong máu và nước tiểu, hơi thở có mùi trái cây, buồn nôn và ói mửa, đau

bụng, khó thở, khô miệng, lẫn lộn, hôn mê Gây ra các bệnh tim ma ̣ch, thiệt ha ̣i thần kinh (neuropathy), thận hư (thâ ̣n) hoặc suy thâ ̣n, thiệt ha ̣i cho các ma ̣ch máu của võng

mạc (bệnh lý võng ma ̣c tiểu đường), có khả năng dẫn đến mù lòa, đu ̣c ống kính mắt (đu ̣c thủy tinh thể), các bệnh về nhiễm trùng, xương và các vấn đề chung như loãng xương Nếu lượng đường trong máu tăng cao đủ cho một thời gian dài, nó có thể dẫn đến hai điều kiện nghiêm trọng (Lê Hoa, 2016)

1.5.2 Phân loại

Tiểu đường type I: Bệnh tiểu đường toan xê tôn (ketoacidosis) Bệnh tiểu đường ketoacidosis phát triển khi có quá ít insulin trong cơ thể Nếu không có đủ insulin, đường (glucose) không thể nhâ ̣p vào các tế bào cho năng lượng Lượng đường trong máu tăng cấp độ, và cơ thể bắt đầu phá vỡ các chất béo cho năng lượng Điều này tạo ra acid độc hại được biết đến như xeton Dư thừa tích tu ̣ ketone trong máu và cuối cùng "tràn qua" vào nước tiểu Nếu không điều trị, ketoacidosis tiểu đường có thể dẫn đến hôn mê và bệnh tiểu đường đe dọa tính mạng

Tiểu đường type II: Hội chứng tăng thẩm thấu bệnh tiểu đường (hyperosmolar) Tình trạng này xảy ra khi sản xuất ra insulin, nhưng nó không hoa ̣t động đúng cách Đường huyết có thể trở nên rất cao - lớn hơn 600 mg/dL (33 mmol/L) Bởi vì insulin hiện tại không làm việc đúng cách, cơ thể không thể sử du ̣ng đường hoặc chất béo cho năng lượng Glucose trong nước tiểu, gây đi tiểu tăng lên