Khảo sát thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của hai cây rau má lá sen hydrocotyle bonariensis comm ex lam và hydrocotyle vulgaris l (apiaceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI CÂY RAU MÁ LÁ SEN HYDR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI CÂY

RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS

COMM EX LAM VÀ HYDROCOTYLE VULGARIS L

(APIACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI CÂY

RAU MÁ LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS

COMM EX LAM VÀ HYDROCOTYLE VULGARIS L

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS NGUYỄN NGỌC SƯƠNG

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHŨ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

*****

LỜI CAM ĐOAN

Luận án Tiến sĩ Khoa học Hóa học “Khảo sát thành phần hóa học và một số hoạt

tính sinh học của các cây rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và

Hydrocotyle vulgaris L., (Apiaceae)” do tôi thực hiện, các số liệu kết quả trung

thực Theo sự hiểu biết của tôi, cũng như các tài liệu tham khảo và phần mềm Scifinder, các kết quả nghiên cứu trong luận án này là mới, chưa được các tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tp Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 09 năm 2012

Nghiên cứu sinh

Tôn Nữ Liên Hương

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin ngỏ lời cảm ơn đến:

- PGS.TS Nguyễn Ngọc Sương Cô kính yêu đã tận tình hướng dẫn, quan tâm

khích lệ và tạo điều kiện thuận lợi giúp cho tôi hoàn thành luận án này

- GS.TS Nguyễn Kim Phi Phụng Cô kính yêu đã tận tình hướng dẫn và dành

thời gian sửa chữa, đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận án, luôn quan tâm động viên tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học trong nhiều năm qua

- GS.TSKH Nguyễn Công Hào đã quan tâm và đóng góp nhiều ý kiến quý

báu cho các chuyên đề tiến sĩ và luận án

- GS.TS Nguyễn Minh Đức và PGS.TS Trương Thế Kỷ đã quan tâm và

đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho các chuyên đề tiến sĩ và luận án

- PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh và PGS TS Trần Công Luận đã quan tâm

và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận án

- PGS TS Trần Lê Quan, TS Tôn Thất Quang, TS Nguyễn Trung Nhân

đã động viên, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện luận án

- Tất cả quý Thầy Cô trong Bộ Môn Hóa Hữu Cơ đã tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi thực hiện luận án

- Phòng NMR, Phòng Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Hóa học, Viện

KH-CN VN, Hà Nội, Phòng Phân Tích Trung Tâm, phòng Hợp chất Thiên nhiên và

Bộ môn Sinh học phân tử thuộc trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM

- Phòng Sau Đại Học trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM

- Toàn thể bạn hữu trong Khoa Khoa học tự nhiên và Trường ĐH Cần Thơ

và Khoa Hóa Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM

- Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, luôn bên cạnh động

viên, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án này

Tôn Nữ Liên Hương

MỤC LỤC

Trang

 MỞ ĐẦU

 NỘI DUNG

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT 1 1.1.1 Hydrocotyle bonariensis Comm ex L., Cây rau má lá sen hoa chùm 1 1.1.2 Hydrocotyle vulgaris L., Cây rau má lá sen hoa phân tầng 2 1.2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 2 1.2.1 Hydrocotyle asiatica [hay Centella asiatica (L.) Urb.] 3

1.2.2 Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam 4

1.2.3 Hydrocotyle leucocephala Cham 4

1.2.4 Hydrocotyle ramiflora Maximowicz 5 1.2.5 Hydrocotyle rannunculoides L.f 5 1.2.6 Hydrocotyle rotundifolia Roxb (water pennywort) 5 1.2.7 Hydrocotyle sibthorpioides Lam 5

1.2.8 Hydrocotyle umbellala Linn 6 1.2.9 Hydrocotyle vulgaris L 6 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH 15

1.3.1 Hydrocotyle asiatica L 16

1.3.2 Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam 20

1.3.3 Hydrocotyle nepalensis Hook 20

1.3.4 Hydrocotyle sibthorpioides Lam 20

1.3.5 Hydrocotyle umbellata Linn 20

1.3.6 Hydrocotyle vulgaris L 20

1.3.7 Các loài Hydrocotyle khác 21

1.4 NHẬN XÉT 21

1.4.1 Nhận xét về thành phần hoá học 21

1.4.2 Nhận xét về hoạt tính sinh học 21

1.4.3 Phân tích đánh giá tình hình nghiên cứu trong nước 21

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 22

2.1 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22

2.1.1 Hóa chất và thiết bị dùng trong tách chiết, cô lập chất 22

2.1.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong thử nghiệm hoạt tính sinh học 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Tách chiết, cô lập và định danh các hợp chất hữu cơ 24

2.2.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các nhóm hợp chất hữu cơ 25

2.3 THỰC NGHIỆM 28

2.3.1 Khảo sát nguyên liệu 28

2.3.2 Điều chế các loại cao 29

2.3.3 Khảo sát tinh dầu 30

2.3.4 Trích ly, cô lập một số hợp chất hữu cơ trong hai loài Hydrocotyle 31

2.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh học 45

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC 52

3.1.1 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất alkaloid 52

3.1.2 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất cerebroside và chất béo 56

3.1.3 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất coumarin, dioxolane, lignan 73 3.1.4 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất flavonoid 81

3.1.5 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất carbohydrate 91

3.1.6 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất steroid 95

3.1.7 Khảo sát cấu trúc hoá học các hợp chất terpenoid 110

3.2 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÁC TINH DẦU 116

3.2.1 Khảo sát thành phần hoá học của tinh dầu cây H bonariensis 117

3.2.2 Khảo sát thành phần hoá học của tinh dầu cây H vulgaris 120

3.2.3 Nhận xét thành phần hoá học của tinh dầu hai cây H bonariensis và H vulgaris 121

3.3 KẾT LUẬN VỀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA HAI CÂY THUỘC CHI HYDROCOTYLE 122

3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC 125

3.4.1 Thử nghiệm Brine-shrimp 125

3.4.2 Thử nghiệm gây độc tế bào ung thư (in vitro) 126

3.4.3 Thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định 128

3.4.4 Thử nghiệm khả năng làm lành vết thương trên chuột 129

3.4.5 Thử nghiệm khả năng kháng oxy hoá 129

3.4.6 Nhận định chung về hoạt tính của nhóm chất trích từ rau má lá sen 130

3.5 NHẬN XÉT VỀ HOÁ THỰC VẬT CỦA CHI HYDROCOTYLE 131

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 135

KẾT LUẬN 135

KIẾN NGHỊ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 139

 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 140

 TÀI LIỆU THAM KHẢO 149

 PHỤ LỤC

CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

[α]D : năng lực triền quang (Specific Optical Rotation)

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

khối phổ ion hóa bằng va chạm điện tử

khối phổ biến đổi Fourier

sắc ký khí ghép khối phổ

tương quan giữa H-H

tương quan giữa H-C qua 2, 3 nối

tương quan giữa H-C qua một nối HR-ESI-MS : (High Resolution ElectroSpray Ionization-Mass Spectrometry

khối phổ ion hóa bằng kỹ thuật phun điện phân giải cao

sắc ký lỏng ghép khối phổ

phổ cộng hưởng từ hạt nhân

RP-18 : (Reversed Phase C-18), silica gel pha đảo

UV-Vis : (Ultraviolet visible Spectroscopy), phổ tử ngoại- khả kiến

Các ký hiệu mũi

Các giá trị thử nghiệm

EC50 : (50% Eliminatory Concentration), nồng độ loại trừ 50%

hữu triền : quay phải

tả triền : quay trái

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

Trang

 HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hydrocotyle bonariensis Comm ex L., Cây rau má lá sen hoa chùm 2 Hình 1.2 Hydrocotyle vulgaris L., Cây rau má lá sen hoa phân tầng 2

Hình 2.3 Xử lý chuột để thử nghiệm hoạt tính làm lành vết phỏng (cấp độ 2) 47 Hình 3.1 Cấu trúc hoá học và năng lực triền quang của leucocerebroside -Lb4

Sơ đồ 2.1 Qui trình điều chế các cao và cô lập chất từ toàn cây H bonariensis 49

Sơ đồ 2.2 Qui trình điều chế các cao và cô lập chất từ lá cây H bonariensis 50

Sơ đồ 2.3 Qui trình điều chế các cao và cô lập chất từ toàn cây H vulgaris 51

Bảng 2.1 Độ ẩm của các bộ phận của hai cây H bonariensis và H vulgaris 29 Bảng 2.2. Khối lượng và thu suất của các loại cao (so với nguyên liệu khô

Bảng 2.3 Sắc ký cột cao ether dầu hỏa của toàn cây H bonariensis, sơ đồ 2.1 35 Bảng 2.4 Sắc ký cột cao chloroform của toàn cây H bonariensis, sơ đồ 2.1 35

Bảng 2.5 Sắc ký cột cao ethyl acetate của toàn cây H bonariensis, sơ đồ 2.1 36

Bảng 2.6 Sắc ký cột cao methanol của toàn cây H bonariensis, sơ đồ 2.1 36

Bảng 2.7 Sắc ký cột cao ether dầu hỏa của lá cây H bonariensis, sơ đồ 2.2 40

Bảng 2.8 Sắc ký cột cao chloroform của lá cây H bonariensis, sơ đồ 2.2 40

Bảng 2.9 Sắc ký cột cao ethyl acetate của lá cây H bonariensis, sơ đồ 2.2 40

Bảng 2.10 Sắc ký cột diaion cao butanol của lá cây H bonariensis, sơ đồ 2.2 41

Bảng 2.11 Sắc ký cột cao ether dầu hỏa của lá cây H vulgaris, sơ đồ 2.3 44

Bảng 2.12 Sắc ký cột cao chloroform của lá cây H vulgaris, sơ đồ 2.3 44

Bảng 2.13 Sắc ký cột cao ethyl acetate của lá cây H vulgaris, sơ đồ 2.3 44

Bảng 2.14 Sắc ký cột diaion cao butanol của lá cây H vulgaris, sơ đồ 2.3 45 Bảng 2.15 Sắc ký cột pha đảo phân đoạn V.B4 của cao butanol (3,74 g)

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb C1.1 so sánh với

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb Flaw3 so sánh với (S)-xylopinine 56

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của Hb-Ea5 so sánh với cerebroside (2) có cùng

Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-A3 và phổ mô phỏng 79 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Flaw1 so sánh với esculetine 80 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Bu1 so sánh với quercetin 82 Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Flaw2 so sánh với kaempferol 84

Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của Hb-Bu2, Hv-A1 so sánh với quercetin

Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR của Hv-Bu3 so sánh với hesperidin 90

Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của Hv-Ch4 so sánh với etyl β-D-glucopyranoside 92

Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR của Hb-PE so sánh với β -sitosterol 96 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR của Hb-EA1.4 so sánh với spinasterol 98 Bảng 3.21 Số liệu phổ NMR của Hv-PE4, Hb-C2 so sánh với stigmasterol 99

Bảng 3.22 Số liệu phổ NMR của Hb-C3 so sánh với stigmastan-3,6-dione 102

Bảng 3.23 Số liệu phổ NMR của Hb-C10, Hv-C5 so sánh với daucosterol 103

Bảng 3.24 Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb-Ea8 và các chất so sánh 106

Bảng 3.25 Số liệu phổ NMR của Hb-M5 so sánh với dioscin 109

Bảng 3.26 Số liệu phổ NMR của Hb-Eter so sánh với squalene 111

Bảng 3.27 Số liệu phổ NMR của Hb-A1 so sánh với lupeol 112

Bảng 3.28 Số liệu phổ NMR của Hb-C11 so sánh với ursolic acid 115

Bảng 3.29 Tính chất vật lý và thu suất (%) so với nguyên liệu tươi ban đầu của tinh dầu hai cây H bonariensis và H vulgaris 116

Bảng 3.30 Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H.bonariensis 118 Bảng 3.31 Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H vulgaris 114

Bảng 3.32 Giá trị LC50 của các m u trong thử nghiệm Brine-shrimp 126

Bảng 3.33 Kết quả thử nghiệm độc tính với tế bào ung thư (in vitro) của tinh

dầu, cao trích và chất cô lập được từ H bonariensis và H Vulgaris 127

Bảng 3.34 Kết quả thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu hai cây 128

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay nhiều kỹ thuật hiện đại được ứng dụng trong phân tích hóa hữu cơ, sinh hóa đã góp phần hữu hiệu cho việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, do vậy, ngày càng có nhiều kết quả nghiên cứu mới giải quyết tiếp những vấn đề trước đây chưa hoàn chỉnh và phục vụ tốt hơn cho cuộc sống

Trong số nhiều loài thực vật, chúng tôi lưu ý đến các cây thuộc chi

Hydrocotyle, chẳng những vì sự phong phú về chủng loại mà còn vì tính năng đa

dụng của chúng trong đời sống Một số cây thuộc chi Hydrocotyle mọc dễ nơi ẩm

mát và còn được trồng phổ biến làm rau ăn không những ở nước ta và ở nhiều nước khác cùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm Một số cây trong chi này còn có khả năng phát triển ở những nơi khí hậu giá lạnh như Canada, ở những nơi khô cằn như miền duyên hải nước Úc… Một số cây thuộc chi này vừa là thực phẩm vừa là dược phẩm

- không chỉ theo các tài liệu y học cổ truyền mà cả trong các y văn hiện đại Các nghiên cứu hóa học và dược học trên nguồn cây này đã được tiến hành từ rất sớm và cho đến thời gian gần đây theo hướng tập trung chuyên sâu trên một vài cây có

nhiều công dụng, điển hình như Hydrocotyle asiatica, Hydrocotyle sibthorpioides

Trong những năm gần đây, ở vùng đồng bằng sông Cửu Long có các loài rau má lá tròn gần giống lá sen, có hương thơm, vị đắng thường được trồng làm kiểng, sử dụng lá làm rau ăn, được gọi là rau má lá sen, rau má Nhật, rau má Thái

Các loài này có tên khoa học là Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và

Hydrocotyle vulgaris L., chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học

Với ý định tìm hiểu về chi thực vật rất gần gũi với cuộc sống này chúng tôi chọn thực hiện đề tài khảo sát thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của

các cây rau má lá sen, Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và Hydrocotyle

vulgaris L thuộc chi Hydrocotyle, (Apiaceae)

Nội dung chính được thực hiện trong luận án này là khảo sát thành phần hóa học của hai cây, phân tích xác định các hợp chất hữu cơ bậc hai và thành phần tinh dầu Bên cạnh đó, một vài thử nghiệm hoạt tính sinh học cũng được thực hiện trên các cao trích, tinh dầu và một vài hợp chất tinh khiết cô lập được Chúng tôi chọn thử nghiệm hoạt tính gây độc trên một vài dòng tế bào ung bướu, tính kháng khuẩn,

kháng oxy hóa và sơ bộ khảo sát khả năng làm lành vết thương (in vivo) nhằm góp

phần tìm hiểu về tiềm năng sử dụng của các cây này, căn cứ theo hoạt tính đã biết của các cây rau má đã được nghiên cứu

Việc khảo sát thành phần hóa học của các cây rau má lá sen, Hydrocotyle

bonariensis Comm ex Lam và Hydrocotyle vulgaris L góp phần làm sáng tỏ hóa–

thực vật của chi Hydrocotyle, hiện có rất ít thông tin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT

Đề tài nghiên cứu trên 2 loài cây thuộc chi Hydrocotyle chưa được khảo sát

kỹ về thành phần hóa học, gồm: Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và

Hydrocotyle vulgaris L

Chi Hydrocotyle, thuộc họ Ngò, Apiaceae, là tập hợp hơn 30 loài, có những

đặc điểm chung là cây thảo, lá tròn hoặc có khía, thân bò và phân nhánh từ đốt rễ Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Võ Văn Chi, Trần Hợp,[1,4,6]

ở Việt

Nam có hơn mười loài của chi này Trong số các loài thuộc chi Hydrocotyle, gần

đây người dân vùng đồng bằng sông Cửu long quen dần với sự xuất hiện của các loài rau má với đặc điểm lá tròn như lá sen và có khía tai bèo, cuống lá màu trắng ở giữa tâm lá, có hương thơm nhẹ

Chúng tôi đã thu thập được hai loài rau má lá sen có hình thái thực vật rất gần nhau, chỉ khác biệt về hoa, được gọi tên thường là rau má lá sen phiến lớn, hoa chùm và rau má lá sen phiến nhỏ, hoa phân tầng Hai loài này đã được nhận danh là

Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam và Hydrocotyle vugaris L bởi Dược sĩ

Phan Đức Bình, công tác ở ban Biên tập Tạp chí Thuốc và Sức khỏe, Thành phố Hồ Chí Minh, và Thạc sỹ Nguyễn Thị Kim Huê, bộ môn Sinh học, trường Đại học Cần Thơ Mô tả chi tiết của các cây này giúp dễ phân biệt được chúng, như sau

1.1.1 Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam., Cây rau má lá sen phiến lớn [85]

Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam (Hình 1.1)

Tên thông thường: Rau má lá sen phiến lớn, rau má Thái

Cỏ lưu niên, dạng thân rễ, mọc bò, tại mỗi đốt có nhiều rễ và cho ra 1–2 lá vươn thẳng lên, cọng lá nhẵn dài 15–20 cm Lá hình lọng, phiến tròn, mỏng, rộng 3–12 cm, có thuỳ cạn, mép lá khía tai bèo, cuống lá đính ở giữa chứ không phải ở mép như các cây khác Tán hoa đường kính 1–6 cm gồm nhiều tia tụ tạo vòng rộng, cọng cuống chính có thể dài tới 40 cm; cuống nhỏ dài 0,2–2 cm Hoa nhỏ, 5 cánh màu trắng hoặc vàng kem, lá đài nhọn màu lục

Cây này sống dễ nơi ẩm ướt nhưng cũng chịu được môi trường khô

Xuất xứ ở nam Mỹ, Úc

Loài này có hương thơm đặc trưng, vị đắng và được người dân vùng đồng bằng sông Cửu Long dùng làm rau ăn

1.1.2 Hydrocotyle vulgaris L Cây rau má lá sen phiến nhỏ, hoa tán phân tầng [6]

Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris L (Hình 1.2)

Tên thông thường: Rau má lá sen phiến nhỏ, rau má Nhật

Cỏ lưu niên, sống trong môi trường ẩm ướt, tập trung thành quần thể lớn Phiến lá hình tròn, đường kính khoảng 0,8–3,5 cm, có khía tai bèo, có 6–9 gân lá chính, xoè ra từ chỗ nối của lá với cuống lá, ngay tâm lá Hoa lưỡng tính, màu trắng, hồng nhạt, hoặc hơi xanh, đường kính 1 mm Trong một cụm hoa có từ 3–6 hoa đơn, mỗi hoa cách nhau khoảng 3 mm, đôi lúc có 1–3 vòng hoa bên dưới

Cây thích hợp với môi trường ẩm ướt hoặc đất sét Xuất xứ: Châu Âu, Châu Phi, vùng bắc Mỹ Ở nước ta cây này thường được trồng làm kiểng, lá không thơm như loài rau má lá sen phiến lớn

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Chi Hydrocotyle thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), gồm nhiều loài lưu niên,

thường có mùi thơm với thân cây rỗng, sống dễ trong môi trường ẩ m Cho đến

nay, chỉ có một số ít loài trong chi Hydrocotyle được nghiên cứu thành phần hóa học như: rau má mơ – Hydrocotyle asiatica L (Centella asiatica Linn.), rau má

Hình 1.1:

Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam

Cây rau má lá sen phiến lớn, hoa chùm tán

Hình 1.2:

Hydrocotyle vulgaris L

Cây rau má lá sen hoa tán phân tầng

nhỏ – H sibthorpioides Lam., H rotundifolia Roxb., rau má Nam Mỹ – H

ranunculoides L f., H ramiflora Maxim., H umbellata Linn Trong số này, loài Hydrocotyle asiatica L được quan tâm nghiên cứu nhiều về mặt hóa học cùng hoạt

tính sinh học và có nhiều kết quả được ứng dụng rộng rãi

Do cả hai loài Hydrocotyle bonariensis và Hydrocotyle vulgaris đều chưa

được nghiên cứu thành phần hóa học ở Việt Nam, và trên thế giới chỉ có một vài

công bố về thành phần flavonoid của Hydrocotyle vulgaris, nên chúng tôi đã tìm hiểu thành phần hóa học của vài loài khác thuộc chi Hydrocotyle qua các công trình

đã công bố ở trong và ngoài nước để làm tiền đề định hướng nghiên cứu

1.2.1 Hydrocotyle asiatica L (hay Centella asiatica Linn.)

Thành phần hóa học của cây có ít nhiều thay đổi theo từng vùng phân bố.[1,6] Các hợp chất chi phương, mạch carbon dài với 2 liên kết ba trong phân tử (nhóm chất acetylenic) đã được cô lập từ loài cây này Năm 1973, Schulte K.E.[60]

cô lập được các hợp chất mạch thẳng có cấu trúc diyn (acetylenic) như:

pentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol (1); 10-acetoxypentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol (2); 3,8-diacetoxypentadeca-1,9-dien-4,6-diyn (3); 1-acetoxypentadeca-2,9-dien-4,6- diyn-1-ol (4) Năm 1975, Bohlmann Ferdinand và cộng sự[13] đã phát hiện thêm 14

hợp chất dẫn xuất acetylenic khác (5–18)

Theo tài liệu của Jacinda T James,[31]

nhiều hợp chất triterpenoid có trong cây đã được cô lập và đề nghị cấu trúc: Trong những năm 1959-1967, với nguyên liệu thu ở Madagasca những nghiên cứu của Pinhas H., của Polonsky J cùng cộng

sự[54]

đã cô lập được acid asiatic (45), acid madecassic (46) và các saponin gọi là asiaticoside (cấu trúc không mô tả rõ), madecassoside (65) Ngoài ra, từ nguyên liệu

ở Ấn độ, năm 1963-1969, Rastogi R.P cô lập các hợp chất triterpenic như methyl

asiatate (58), brahmol (66), cùng với acid brahmic (tên gọi khác của acid madecassic, 46) và brahminoside (tên gọi khác của madecassoside, 65); và năm

1968, Dutta T và cộng sựcô lập được acid isothankunic (48)

Năm 1989, Sahu Niranjan và cộng sự[59]

cô lập acid terminolic (51) và xác định cấu trúc asiaticoside A (57), asiaticoside B (68) Năm 1995, Muslim Tanvir và

cộng sự,[50]

cô lập được acid

2α,3β-dihydroxy-5-hydroxymethy-24-norolean-12-en-28-oic (52) Năm 2001, từ nguyên liệu ở Sri Lanka, Hisashi Matsuda cùng cộng

sự[26]

cô lập, xác định cấu trúc acid madasiatic (47), acid

3β,6β,23-trihydroxyolean-12-en-28-oic (53), hai saponin có aglycon là acid madecassic gọi là centellasaponin

B, C (63, 64) và hai saponin khung oleanan với nối đôi tại C-13 và C-18, gọi là centellasaponin A, D (70, 71) Năm 2005, Jiang Z.Y và cộng sự[33] cô lập các

saponin với cấu trúc aglycon là acid asiatic đặt tên là asiticoside C, D, E, F (59, 60,

61, 62) Năm 2007, Yu Q.L và cộng sự [79] cô lập được scheffuloside B (67) là

saponin có mạch aglycon là acid 2α,3β, 23-trihydroxyurs-20-en-28-oic (49)

Theo Đỗ Tất Lợi,[2] từ loài này, năm 1960, Rastogi R.P đã cô lập được

quercetin (33), quercetin glucoside (35), kaempferol (37), kaempferol

3-O-glucoside (38) Trong cây còn chứa tannin, carotenoid, vitamin C, acid glutamic,

serin, alanin và alkaloid (C22H33O8N, do Chopra và cộng sự cô lập năm 1956, gọi tên là hydrocotylin, tuy nhiên không tìm được tài liệu gốc mô tả cấu trúc hợp chất)

Tinh dầu của cây thu ở Malaysia[9]

có 41 cấu tử, trong đó các sesquiterpene

là thành phần chính (80%) với germacrene-D (101) chiếm 10%, ngoài ra có các

monoterpene, camphor (107), α-selinene (111) và caryophylen oxide (120) Nghiên

cứu với cây mọc ở Sri Lanca,[49]

tinh dầu có trans-β-farnesene (109; 53,0%),

α-copaene (115; 14,0%), β-caryophyllene (102; 12,5%) và α-humulene (112; 9,0%)

Ngoài ra, năm 1996, Srivastava R và cộng sự[69] cô lập được stigmasterol

(96) và hai hợp chất khác là 11-oxoheinicosanylcyclohexan (99) và acid dotriaconta-8-en-1-oic (100)

1.2.2 Hydrocotyle bonariensis

đây có một khảo sát hóa học đã cô lập sáu saponin triterpenoid (86)-(91).[70]

1.2.3 Hydrocotyle leucocephala Cham

Năm 2006, Freddy R và cộng sự[22] công bố trong cây H leucocephala có

chứa các hợp chất acetylenic, monoterpenoid, ceramide và cerebroside Ba hợp chất acetylenic là (8R,9R,10R)-heptadeca-1-en-4,6-diyn-3,8,9,10-tetraol (17);

22,23-dihydroxy-3-oxo-17,22-secooleana-12,16-dien-hợp chất oleanan glycoside khác gọi tên là các ranuncoside 1-7 (79)-(85)

1.2.6 Hydrocotyle rotundifolia Roxb., (water pennywort)

Năm 2002, Minija Janardhanan và cộng sự[48] cho biết tinh dầu của H

rotundifolia chiếm hàm lượng 0,05% cây tươi, trong đó hợp chất myristicin (104)

chiếm 16,66% lượng tinh dầu

1.2.7 Hydrocotyle sibthorpioides Lam

Đối với loài H sibthorpioides, cho đến nay có ít nhất 3 nhóm hợp chất hóa

học được tìm thấy gồm: các flavonoid, tinh dầu và saponin triterpene

Năm 1982, Shigematsu Nobuharu và cộng sự[64]

cô lập được quercetin (33),

isorhamnetin (34), quercetin 3-O-galactoside (36), và quercetin 3-O-

-D-(6"-caffeoyl)galactoside (40) Năm 2004, Li Jiang và cộng sự[41] xác định được lượng

flavone tổng trong cây H sibthorpioides var sibthorpioides Lam và H

sibthorpioides Lam var batrachium (Hance)

Loài này có mùi thơm nên đã có nhiều nghiên cứu tinh dầu được thực hiện Năm 1982, Asakawa Yoshinori và cộng sự[9]

cho biết thành phần chính trong tinh

dầu H sibthorpioides là trans β-farnesene (109) Năm 2002, Minija J và cộng sự[48]

nghiên cứu cây H sibthorpioides L thu hái ở Ấn độ cho biết những thành phần

chính trong tinh dầu toàn cây, với hàm lượng theo thứ tự giảm dần, là dillapiole

(103), fenchone (105), anisole (106), α-humulene (112), α-bergamotene (113), eudesmene (116), α-bisabolol (117), globulol (119) Năm 2005, Yu-Kuan Chou[85]

β-khảo sát tinh dầu cây H sibthorpioides thu hái ở Đài loan định danh được 34 cấu tử

gồm các monterpenoid, sesquiterpenoid và thành phần chính là các sesquiterpene

(31,74%), trong đó hợp chất α-santalene (114) chiếm hàm lượng cao nhất (11,94%)

Năm 2003, Yukimi Sasaki và cộng sự[80]

đã cô lập và xác định cấu trúc của 7 hợp chất saponin có khung sườn oleanan, đặt tên là các hydrocotyloside I-VII

(72)-(78), cùng với hợp chất saponin gọi tên là udosaponin B (69), {acid

3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranoside]-olean-12-en-28-oic

28-O-β-D-glucopyranoside}

1.2.8 Hydrocotyle umbellata Linn

Năm 2005, Warinthorn Chavasiri và cộng sự[84] cô lập được một triterpene

glycoside là methyl oleanolate 3-O-[-β-D-glucopyranosyl-(1→6)][-β-D-gluco

pyranosyl-(1→6)][-β-D-glucopyranoside] (92) cùng hai hợp chất sterol là stigmasterol (96) và stigmasta-7,25-dien-3-ol (98)

1.2.9 Hydrocotyle vulgaris L

Năm 1981, Voigt Gabriele và cộng sự[25,73]

cô lập được từ cây tươi H

vulgaris các flavonol glycoside là: quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (36),

quercetin 3-O-robinobioside (hay quercetin

3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)][-β-D-galactopyranoside) (41), quercetin galactopyranoside] (43), kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (39), kaempferol 3-O-robinobioside (42) và kaempferol 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→6)][-β-D-

3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→6)][-β-D-galactopyranoside] (44)

CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT ĐÃ CÔ LẬP

Cấu trúc hóa học của các hợp chất đã cô lập được từ các loài thuộc chi

Hydrocotyle được trình bày theo nhóm hợp chất như sau:

OAc

15 1-Acetoxypentadeca-2,9-dien-4,6-diyn

10 9 2

OAc

(4)

15 10-Metoxypentadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol

4 6 8

9 2

(16)

OAc O

OH

OH OH

8 10

8 10

17

1 2

3 4

(8R,9R,10R)-1-Heptadeca-1-en-4,6-diyn (8R,9R,10R)-8-Acetoxyheptadeca-1-en-4,6- -3,8,9,10-tetraol (17) diyn-3,9,10-triol (18)

HO

OAc

OH OH

8 10

R1

O OH

OH O

OH HO

* Các hợp chất flavonoid

O

O O HO

OH OH

Quercetin 3-O-  D-galactopyranoside

(36)

Quercetin 3-O-  D-glucopyranoside

(35)

2 3 5

1' 2'

O OH OH HO

OH OH O

O O HO

OH OH

2 3 5

1' 2'

OH O

OH HO

OR OH

1' 2'

O

HO HO

OH OH

O

O O HO

OH

2 3 5

1' 2'

OH O

OH OH HO

OH

O

O

OH HO

OH O

O OH HO

OH

Quercetin 3-O- -L-rhamnopyranosyl- (1 6)-  -D galactopyranoside (41)

2 3 5

1' 2'

O

O HO

HO

OH O

OH HO HO

OH

1"' 6"

HO

OH

OHO O

OH OH

3 4'

1"' 6"

HO

OH

OHO O

OH OH

3 4'

1"' 6"

* Các hợp chất acid triterpene

HO

COOH HO

Acid madecassic

(46, acid brahmic)

2 3

24 23

28

29 30

Acid madasiatic

(47)

2 3

24 23

28

29 30

OH

6 12

HO

COOH H

Acid 2    ,23-trihydroxy -urs-20-en-28-oic

OH

20

2 3

24 23

28

29 30

Acid 2    ,23-trihydroxy -olean-13(18)-en-28-oic

OH

20

2 3

24 23

28

29 30

13 18

(50, Centellasapogenol A)

HO

COOH HO

Acid 2  ,3  ,6 

,23-tetrahydroxy-olean-12-en-28-oic

OH OH

HO

Acid 2  ,3  -dihydroxy-5-(hydroxy methyl)-24-norolean-12en-28-oic

HO

COOH

Acid 3  12-en-28-oic

13 12

(53, Acid arjunolic)

OH

OH

OH OH OH O

OH

OH

OH OH OH O

23 3

(56)

* Các saponin triterpenoid

- Khung sườn ursan

+ Các hợp chất có liên quan với acid asiatic:

13

21

- Khung sườn oleanan:

+ Khung sườn acid terminolic

16 15 28

Ranuncoside (I-VII)

12

20 21

16 15 28

CH2OR3

Bonarienoside (I-VI)

12

20 21

16 15 28

GlcA Ara

Glc

Hợp chất R 1 R 2 R 3 Mạch glycosid (chung) (86) H Mb (2-methylbutynoyl) H GlcA 4 Ara

O HO

OH O

O

OH

HO HO

HO HO

HO OH OH

Methyl oleanolate 3-O-[-β-D-glucopyranosyl-(1→6)][-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]

10 13

OH

OH

O O OH OH

OH OH

2 3

9

12 18

(2S,3R)-1-O-(7Z,10Z,13Z-Hexadecatrienoyl)- (2S, 3R)-1-O-(9Z, 12Z-Octadecadienoyl)-

3-O-β-galactopyranosyl glycerol (93) 3-O-β-galactopyranosyl glycerol (94)

O

H H

α-Bisabolol (117) 3-Acetoxycapsidiol (118) Globulol (119) Caryophyllene oxide (120)

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

Các cây được khảo sát dược tính bằng các phương pháp khoa học hiện đại là

H asiatica, H sibthorpioides, H japonica, H nepalensis Một số cây như H

H

O O

O O

O O

O

Fenchone (105) Anisole (106) Camphor (107) Geranyl acetate (108)

β-Caryophyllene (102) Dillapiole (103) Myristicin (104)

rannunculoides, H umbellata, H vulgaris, đã được khảo sát hóa học nhưng chưa

được thử nghiệm sinh học.[2,12,14,17,53]

1.3.1 Hydrocotyle asiatica L

Tên gọi khác: Centella asiatica (L.), Gotu kola, rau má

1.3.1.1 Sử dụng theo y học cổ truyền[1,2,4,6]

Rau má là loại rau ăn được, đồng thời còn là vị thuốc dân gian Thuốc từ rau

má không độc, phụ nữ có thai vẫn dùng được, tuy nhiên cần thận trọng liều lượng Ngày dùng 30–40 gam tươi vò nát lấy nước uống hoặc sắc uống giúp lợi sữa

Rau má được dùng như phương thuốc trị bệnh đi tiêu lỏng: rau má (cả dây,

cả lá) rửa thật sạch thêm ít muối nhai sống

Phương thuốc trị đau bụng kinh nguyệt, đau lưng: rau má hái lúc ra hoa, phơi khô, tán nhỏ, ngày uống 1 lần vào buổi sáng, mỗi lần 2 thìa cà phê gạt ngang

Phương thuốc trị rôm sảy, mẩn ngứa: hàng ngày ăn rau má trộn dầu giấm, hoặc rau má hái về xay vắt lấy nước, thêm đường vào uống

1.3.1.2 Theo nghiên cứu khoa học

* Sử dụng cao trích:

Theo Đỗ Tất Lợi,[2]

rau má được dùng làm giảm huyết áp cao, tăng cường trí nhớ và gia tăng tuổi thọ Rau má cũng rất hữu dụng cho những người khó ngủ vì bệnh; là một thuốc lợi tiểu nhẹ, giúp giảm bớt sự căng phình mạch máu và sự ứ tụ lưu chất Rau má có tính kháng viêm và có tác dụng nhanh trong việc trị phỏng

Các chế phẩm từ rau má Centella asiatica đã được nghiên cứu bào chế ở các

nước như Ấn độ, Pháp, Trung quốc…, rất thông dụng với nhiều công dụng khác nhau: thuốc mau lành vết thương, thuốc đắp lên chỗ viêm tấy u loét, thuốc trị bệnh

về da, trị thấp khớp, viêm khớp, các chứng bệnh về ruột, bệnh run cơ

- Làm lành vết thương: hoạt tính này của rau má H asiatica đã được khám

phá và ứng dụng từ Thế chiến II Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng nhận rằng

cao trích từ rau má H asiatica hoạt hóa một số tế bào biểu bì và thúc đẩy keratin

hóa nên làm mau liền sẹo.[23,46,65,66]

Thuốc thoa Madecassol (Bayer) của Pháp sản xuất là một dược phẩm làm liền sẹo nhanh và trị phỏng

- Hiệu quả với hệ thần kinh: Thử nghiệm in-vitro một vài phân đoạn chọn lọc của cao etanol từ cây H asiatica cho thấy cao này có hoạt tính thúc đẩy tăng trưởng

nhanh các bó sợi tế bào thần kinh của người, giúp nhanh hồi phục các bó sợi thần kinh hư tổn.[46,67,68]

Appa Rao và các cộng sự[8] quan sát được sự gia tăng đáng kể chỉ số thông minh (IQ) đối với trẻ chậm phát triển trí tuệ và trẻ có chỉ số IQ từ 90–

110, sau khi dùng thuốc từ 6 tháng cho đến 1 năm, mà trong thành phần điều chế có

bột cây H asiatica Thí nghiệm trên 30 trẻ chậm phát triển trí óc, trong 12 tuần

dùng thuốc bột từ cây này, với liều lượng 0,5 g/ ngày, cho thấy có sự phát triển khả quan cả về hành vi lẫn trí tuệ

- Cao alcol từ cây H asiatica qua thử nghiệm in vivo có tác dụng làm giảm

acetylcholine và histamine trong các hormone của chuột bạch Cao này ức chế rất

hiệu quả sự lây lan virus, làm giảm lượng virus Herpex simplex type 1 và type 2.[77]

- Cao trích từ Rau má được thử nghiệm trên nhiều loại tế bào ung thư, tỏ ra

có độc tính kháng lại loại tế bào ung thư lymphoma, ung thư phổi.[12,14,69]

- Cao rau má là một trong các thành phần thuốc điều trị sỏi thận,[27] viêm khớp.[44]

* Công dụng của các hợp chất được cô lập

- Trong việc làm liền sẹo:

Theo Maquart F.X.,[46] từ các kết quả của nghiên cứu in vivo trên đơn lớp tế

bào nuôi cấy, và khi điều trị lâm sàng, đều cho thấy asiatic acid và các triterpene

trong cây Centenla asiatica (Hydrocotyle asiatica) có hiệu quả trong tổng hợp

collagen, giúp vết thương mau lành Tuy nhiên nghiên cứu chưa tính đến mức nồng

độ cần chọn lọc của các asiatic acid và triterpen này để nạp vào vết thương

Năm 1996, P.K Inamdar và cộng sự[55] nghiên cứu khả năng trị lành vết

thương của lá cây Centenla asiatica, thực nghiệm xác định được các phân đoạn có

hoạt tính là phân đoạn chứa các hợp chất: acid asiatic, acid madecasic, asiaticoside

và madecassoside

Các nghiên cứu của Shukla[65,66]

từ cây Hydrocotyle asiatica thu hái tại Srilanka trong khoảng thời gian sau đó, 1999, cũng cho thấy madecassol và ba

thành phần nêu trên là acid madecassic, acid asiatic và asiaticoside giúp tăng sức đề

kháng, mau liền vết thương, điều trị phỏng rất hiệu quả Nghiên cứu về tiến trình

làm liền sẹo đã nhấn mạnh vai trò của asiaticoside trong việc tăng mức độ các chất

kháng oxy hóa (thuộc nhóm enzyme và nhóm nonenzyme)

- Hiệu quả bảo vệ tế bào thần kinh

Theo kết quả nghiên cứu ở Hàn quốc của Inhee Mook-Jung và cộng sự[29]

1999, các dẫn xuất asiaticoside có hiệu quả bảo vệ tế bào neuron chống lại

β-amyloid gây độc tế bào neuron (in vitro) Từ 28 dẫn xuất thử nghiệm, có 3 hợp

chất là asiaticoside, acid asiatic và một hợp chất nữa thể hiện kết quả ức chế mạnh

β-amyloid, nên các hợp chất này có thể được đề cử để nghiên cứu phát triển thuốc

điều trị bệnh Alzheimer

Theo nghiên cứu của Soumyanath Amala[68] công bố năm 2005, acid asiatic

trích được từ cao ethanol của Hydrocotyle asiatica trong thử nghiệm in vitro với

dòng tế bào thần kinh người SH-SY5Y đã có tác dụng ngay từ nồng độ thấp 1 M,

giúp tăng trưởng nhanh bó sợi, nên cao này có thể dùng phục hồi các neuron hư tổn

- Tác dụng an thần và giảm đau

Qua thử nghiệm trên các loài vật nhỏ (thỏ, mèo), brahmoside và các saponin

glycoside của H asiatica có tác dụng làm an thần và giảm đau.[14] Ngoài ra, các

glycoside này khi tiêm vào mèo đã gây mê thì gây ra tác dụng giảm áp suất mạch

máu

Việc xác định hoạt tính của asiaticoside với hệ thần kinh được thử nghiệm

bằng một số loại thí nghiệm mô hình trên chuột nhắt đực (in vivo) chứng tỏ chất này

có khả năng làm giảm lo lắng.[67]

Năm 2003, Qin Luping và cộng sự[57] công bố thêm một cách tinh chế và ứng

dụng glycoside toàn phần của H asiatica làm thuốc giảm đau và đăng ký độc quyền

sáng chế ở Trung quốc

- Tính kháng khuẩn

Năm 2002, Minija và cộng sự[49]

nghiên cứu tinh dầu của hai loài

Hydrocotyle asiatica và Hydrocotyle rotundifolia, cho biết các cấu tử chính trong

tinh dầu Hydrocotyle asiatica là β-caryophyllene (96), dillapiole (97), geranyl acetate (102), còn trong tinh dầu Hydrocotyle rotundifolia là myristicin (98) Các

tinh dầu này được khảo sát tính kháng khuẩn và đều cho kết quả dương tính

- Khả năng kháng ung bướu

Theo Vogel H.G.[72] các triterpen của Hydrocotyle asiatica có tác dụng

kháng mô u hạt

Từ nghiên cứu của Chun Ching-Ling và cộng sự,[17]

2005, cho thấy acid asiatic có hiệu quả kháng tế bào ung thư phổi ở người Acid asiatic kìm hãm chu trình của tế bào ung thư và gây ra quá trình apoptosis (lên chương trình tự hủy) của

tế bào này

Nhóm nghiên cứu của Babu và cộng sự[12] đã xác định các cao trích của rau

má có độc tính với tế bào ung thư (in vitro và in vivo), khả năng kháng ung thư cao hơn hẳn so với cao tương ứng của các loài Coriandrum sativum, Cuminum siminum

và Foeniculum vulgare Cao methanol của Hydrocotyle asiatica và phân đoạn khi

sắc ký cột cao này với acetone diệt được các tế bào ung thư loại lymphoma Dalton, Ehrlich, và đã xác định giá trị IC50 của phân đoạn acetone trong mỗi thử nghiệm gây độc tế bào đều tốt, lần lượt là 22 và 17 g/ml

Nghiên cứu in vivo trên chuột bị chích tế bào lymphoma vào cơ thể, nhận

thấy việc cho chuột uống dịch chiết rau má (chứa các triterpenoid) với liều lượng 1g/kg thể trọng, trong 5 ngày, uống cách ngày, ức chế được sự tăng trưởng của bướu ung thư và kéo dài được thêm thời gian sống của chuột.[14] Sự ức chế rõ rệt hơn khi chuột được cho dùng dịch chiết rau má trước khi chích tế bào ung thư vào

cơ thể Kết quả không rõ rệt khi bắt đầu cho chuột dùng dịch chiết rau má 10 ngày sau bị chích tế bào ung thư Dựa trên các kết quả thực nghiệm và các số liệu dược lực học, một số liều trị liệu đã được đề nghị

- Khả năng khác

Theo Pointel J.P.[56] dịch trích của rau má có tác dụng điều trị bệnh yếu tĩnh mạch chi dưới

Nếu dùng rau má, H asiatica, ở những liều cao hơn 2,7g/kg thể trọng chuột,

có thể gặp phản ứng phụ Nước ép toàn cây tươi rau má có thể gây các tác động chống thụ thai ở chuột khi cho uống với liều tương đương 10 g.[14]

1.3.2 Hydrocotyle bonariensis Comm ex Lam

Cây được trồng để sử dụng trong dân gian làm thuốc tiêu độc Lá ăn được, tuy nhiên do đắng và thân khá dai nên thường dùng phần ngọn non nấu chín nhanh Chưa được nghiên cứu nhiều về dược tính và thành phần hóa học Hiện tại, đây là một trong hai đối tượng nghiên cứu của chúng tôi

1.3.3 Hydrocotyle nepalensis Hook

Từ Hydrocotyle nepalensis, Papaverfhoeras, Viola japonica, Prolis,

Sesamum indicium oil và Colophonium, đã điều chế được thuốc giảm đau dạng cao

dán giúp điều trị bệnh viêm khớp.[53]

1.3.4 Hydrocotyle sibthorpioides Lam

Dịch trích của H sibthorpioides là 1 trong 29 dược thảo, khi thử nghiệm

Ames cho thấy có hiệu quả kiềm chế bớt sự đột biến gen Trp-P-1.[51]

H sibthorpioides cũng là 1 thành phần trong 17 nguyên liệu dùng làm thuốc

điều trị sỏi thận, trong đó hàm lượng của cây này là khoảng 6 %.[27]

Cây được dùng chữa sỏi thận và các bệnh liên quan đến bài tiết Dùng cây chữa bệnh ho gà là một phương thuốc cổ truyền ở Đan Mạch

1.3.7 Các loài Hydrocotyle khác: có loài được sử dụng ở địa phương với những

công dụng truyền miệng, chưa có tài liệu ghi nhận rõ rệt và nghiên cứu kỹ

1.4 NHẬN XÉT

1.4.1 Nhận xét về thành phần hóa học

Trong các cây thuộc chi Hydrocotyle thường có các nhóm chất acetylenic,

chất béo sphingomyelin, lipid, steroid, saponin terpenoid, flavonoid và nhóm chất monoterpenoid, sesquiterpenoid trong tinh dầu

1.4.2 Nhận xét về hoạt tính sinh học

Từ lâu, một số cây Hydrocotyle thường được sử dụng làm rau ăn, sử dụng

theo y học cổ truyền để làm thuốc hạ sốt, lợi tiểu, giảm đau và trị cảm ho, một vài vùng sử dụng chúng làm thuốc trị lở loét, điều trị phỏng Tuy số thông tin về dược

tính trên các loài thuộc chi Hydrocotyle không nhiều, các nghiên cứu khoa học đã

ngày càng chứng minh dược tính của một số cây trong chi là rất khả quan Khi thử

nghiệm in vitro trên một vài nhóm hợp chất trích từ các cây trong chi Hydrocotyle

cho thấy hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus và kháng tế bào ung thư

Một dược tính nổi trội của các cây Hydrocotyle là kích thích hồi phục tế bào, làm

lành các vết thương

1.4.3 Phân tích đánh giá tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay trong nước, chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá

học cũng như khảo sát hoạt tính sinh học trên các cây rau má lá sen Hydrocotyle

bonariensis và Hydrocotyle vulgaris

 Thuốc thử hiện hình vết trên bản mỏng: H2SO4 20% trong methanol;

 Sắc ký lớp mỏng: pha thường: TLC Silica gel 60 F254 (250 m, MERCK); pha đảo: TLC Silica gel 60 RP18 F254 S (200 m, MERCK);

 Chất hấp phụ cho sắc ký cột pha thường: Silica gel 60 (0,0400,063 m, SCHALAU, MERCK); cột nhanh khô: Silica gel 60 G (MERCK); cột pha đảo: Silica gel 90 C18-Reversed phase (FLUKA);

 Sắc ký trao đổi ion: Diaion HP20 (MITSUBISHI);

2.1.1.2 Thiết bị

 Buồng soi UV (UVB, USA); tỷ khối kế (2 ml) ; khúc xạ kế (KRUSS) (c);

 Cân phân tích (SARTORIOUS BL 210S); bếp cách thủy (MEMMERT);

 Máy thu hồi dung môi dưới áp suất thấp (BUCHI, HEIDOLF);

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy (MEL-TEMP 1102D) 230V (c);

 Máy đo phổ hồng ngoại–ép mẫu trong KBr (Vector22 BRUKER) (c);

 Máy cộng hưởng từ hạt nhân (BRUKER AVANCE) với tần số 500 MHz cho phổ 1

HNMR và 125 MHz cho phổ 13

CNMR (a), (b);

 Máy đo khối phổ HRESIMS (Bruker MicrOTOF–Q 10187) (a);

 Máy đo năng lực triền quang P8100T (KRUSS)

(a) Thực hiện tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

(b) Thực hiện tại Phòng Phân tích Cấu trúc Hóa học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội

(c) Thực hiện tại Khoa Khoa học tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ

2.1.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong thử nghiệm hoạt tính sinh học

* Thử nghiệm Brine-Shrimp (thử hoạt tính với Artemia)

- Trứng Artemia salina, của khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại

học Cần Thơ

- Dimethyl sulfoxide (DMSO); nước biển 35o/oo

- Bình thủy tinh thiết kế hai ngăn: sáng, tối, có vách thông nhau; đèn soi

- Pipetman sử dụng 2 loại cone 5-500 µl và 1000-2000 µl

* Thử độc tính với tế bào ung thư

Thử độc tính tế bào ung thư vú và cổ tử cung

- Dòng tế bào ung thư vú (MCF–7) và dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI), Maryland, Mỹ;

Thử độc tính tế bào ung thư phổi, gan và cơ màng tim

- Dòng tế bào ung thư phổi (LU), gan (Hep-G2) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bioassay, trường Đại học Dược Illinois, Chicago, Hoa Kỳ;

- Dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), và dòng ung thư màng tim (Rhabdocarcoma- RD) từ viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương Việt Nam

* Thử hoạt tính làm lành vết thương trên chuột

- Madecassol (Bayer, Pháp)

- Nước muối tinh khiết 80 o/oo

- Chuột bạch đực thuần chủng, chuột nhắt, 4 tuần tuổi (Viện Pasteur TP HCM)

- Lồng nuôi, thức ăn viên chế biến sẵn, bình có ống thông cho chuột uống nước

* Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm:

+ Vi khuẩn Gr(-): Eseheriehia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC 12222)

+ Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae (SH 20) Nấm sợi: Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42)

- Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Saboraud dextrose broth –SDB

(SIGMA), còn vi khuẩn được duy trì trong Trypcase soya broth–TDB (SIGMA)

- Môi trường thí nghiệm với vi khuẩn: Eugon Broth LT 100 (Difco, Mỹ), với nấm: Mycophil agar (Difco, Mỹ)

- Các kháng sinh để pha mẫu đối chứng: Ampicillin 50 mM, Tetracycline 10 mM, Nystatin 0,04 mM Kháng sinh được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tách chiết, cô lập và định danh các hợp chất hữu cơ

Mẫu nguyên liệu được thu trên cùng một vùng, định danh và lưu tiêu bản Xác định độ ẩm của nguyên liệu, theo công thức

Độ ẩm (%) =

Phân chia nguyên liệu tươi thành các bộ phận để trích tinh dầu Khảo sát hai phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp và gián tiếp để chọn phương pháp chưng cất phù hợp Khảo sát điều kiện trích ly tinh dầu với hiệu suất ổn định nhất, trên các thông số: khối lượng nguyên liệu, lượng nước cho mỗi mẻ nguyên liệu và thời gian chưng cất, bằng cách thay đổi một thông số khi cố định các thông

số khác Dung dịch lôi cuốn bằng hơi nước được trích kiệt với diethyl ether, làm khan bằng Na2SO4, thu hồi dung môi để thu lấy tinh dầu Ghi nhận các thông số vật

lý cho từng loại tinh dầu và ghi phổ GC-MS để xác định thành phần cấu tử

Để tách chiết, cô lập các hợp chất hữu cơ sử dụng bột cây khô bằng cách hong gió nguyên liệu, sấy đến khô (60-80 C) và xay mịn Các loại bột nguyên liệu được trích nóng với ethanol ở khoảng 70 C hoặc ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, lặp lại nhiều lần để trích kiệt, lọc và thu gom dịch trích đem cô quay loại bỏ dung môi thu được cao trích thô ethanol Cao alcol ban đầu này được trích pha rắn hoặc trích phân bố lỏng-lỏng với các dung môi hữu cơ thường dùng để phân chia thành các dịch trích, khi cô cạn dung môi thu được các cao có tính phân cực khác nhau Sử dụng sắc ký cột thường hoặc cột nhanh khô để cô lập các hợp chất hữu cơ Tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh lại

Phân tích LC-MS, ESI-MS hoặc FT-MS để xác định khối lượng mol phân tử

X 100 Trọng lượng tươi – trọng lượng khô

Ghi phổ NMR, IR, UV và xác định các hằng số vật lý của các hợp chất cô lập được

để giải đoán cấu trúc, và so sánh với tài liệu đã công bố để định danh các chất

Khảo sát mạch của cerebroside theo tài liệu tham khảo: đun hoàn lưu cerebroside trong metanol-acid, trích hexane[32] hoặc chloroform[43] dung dịch sản phẩm và cô đuổi dung môi, làm khan để phân tích GC-MS xác định mạch acid béo Lớp nước còn lại được cô đặc rồi hòa tan tủa trở vào methanol và trích ethyl acetate, phân tích GC-MS để khảo sát mạch aminoalcol.[32] Khảo sát sự oxy hóa nối đôi trên mạch bằng cách cho tinh thể KMnO4 vào lượng aminoalcol được hòa tan vào hỗn hợp 10% H2SO4 trong acetone và khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng; sau đó trích hexane hoặc diethyl ether trên dung dịch sản phẩm của sự oxy hóa, cô đuổi dung môi và phân tích GC-MS để xác định các mảnh acid tạo thành từ nối đôi. [43]

2.2.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các nhóm hợp chất hữu cơ

2.2.2.1 Phương pháp thử nghiệm Brine-shrimp

Thử nghiệm Brine-shrimp xác định độc tính của mẫu cao hoặc hợp chất cô

lập được với ấu trùng Artemia salina (Artemia nauplius) Thử nghiệm với nồng độ mẫu thử (µg/ml) thay đổi, sau một thời gian nhất định, thí dụ 24 giờ, ghi nhận liều

LC50 Mẫu cao có giá trị LC50 ≤ 200 μg/ml được coi là dương tính với thử nghiệm

Liều LC50 này giúp dự đoán độc tính của mẫu thử với một số loài côn trùng,

với tế bào ung thư (in vitro), trong điều kiện phòng thí nghiệm nhỏ

2.2.2.2 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư (in vitro)

Theo phương pháp của Skehan P và cộng sự[56] (1990) và Likhiwitayawuid

và cộng sự[45]

(1993), hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Cách thử nghiệm

- Các mẫu thử nghiệm: mẫu cao hoặc mẫu hợp chất được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, mẫu đối chứng dương (dung dịch ellipticin), mẫu chứng âm (DMSO)

- Dung dịch huyền phù tế bào: Tế bào của các dòng (gây ung thư ở người: RD, KB,

LU, Hep-G2) được xử lý bằng trypsin –EDTA; hoà vào môi trường nuôi cấy sạch tạo ra dung dịch huyền phù tế bào, nồng độ 3 x 104

tế bào/ml

Cho vào mỗi giếng của phiến thử nghiệm 96 giếng các thể tích lần lượt là:

10 μl mẫu thử nghiệm và 190 μl dung dịch huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy Nhuộm tế bào có trong 200 μl/giếng để xác định lượng tế bào tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm Phiến nuôi cấy được ủ trong tủ nuôi cấy tế bào 5% CO2 Sau 3 ngày kết thúc qui trình nuôi cấy Tế bào sau khi nuôi cấy được cố định bằng TCA lạnh, rửa, để khô, nhuộm sulforhodamin B 0,4% và rửa lại bằng acid acetic 1% để loại màu thừa Sau đó tế bào được hoà lại vào dung dịch đệm Tris, và đo mật độ quang

Cách tính kết quả:

- Đọc mật độ quang (OD, optical density) của các mẫu trên máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm Dựa theo kết quả mật độ quang của các mẫu: lúc bắt đầu thí nghiệm: OD (ngày 0); mẫu chứng âm: OD (DMSO) và của mẫu trong điều kiện nghiên cứu (OD mẫu) để tìm giá trị CS% (tỷ lệ tế bào còn sống %, cell survival %) theo công thức sau:

OD (mẫu) – OD (ngày 0) CS% = x 100

X b a

1





2.2.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính làm lành nhanh vết thương (in vivo)

Thực hiện qui trình thử nghiệm chữa phỏng cho chuột dựa theo tài liệu đã công bố của Shukla Y N và cộng sự[68, 69]

nghiên cứu hoạt tính làm lành vết thương

của asiaticoside cô lập từ cây Centella asiatica

Trong đó: Y: nồng độ chất thử; X: tỷ lệ tế bào còn sống CS (%); a = 0,00954; b = 1,33210