Thử nghiệm Brine-shrimp xác định độc tính của mẫu cao hoặc hợp chất cô lập được với ấu trùng Artemia salina (Artemia nauplius). Thử nghiệm với nồng độ mẫu thử (µg/ml) thay đổi, sau một thời gian nhất định, thí dụ 24 giờ, ghi nhận liều LC50. Mẫu cao có giá trị LC50 ≤ 200 μg/ml được coi là dương tính với thử nghiệm.
Liều LC50 này giúp dự đoán độc tính của mẫu thử với một số loài côn trùng, với tế bào ung thư (in vitro), trong điều kiện phòng thí nghiệm nhỏ.
2.2.2.2Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ (in vitro)
Theo phương pháp của Skehan P. và cộng sự[56] (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự[45]
(1993), hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Cách thử nghiệm
- Các mẫu thử nghiệm: mẫu cao hoặc mẫu hợp chất được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, mẫu đối chứng dương (dung dịch ellipticin), mẫu chứng âm (DMSO). - Dung dịch huyền phù tế bào: Tế bào của các dòng (gây ung thư ở người: RD, KB, LU, Hep-G2) được xử lý bằng trypsin –EDTA; hoà vào môi trường nuôi cấy sạch tạo ra dung dịch huyền phù tế bào, nồng độ 3 x 104
Cho vào mỗi giếng của phiến thử nghiệm 96 giếng các thể tích lần lượt là: 10 μl mẫu thử nghiệm và 190 μl dung dịch huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy. Nhuộm tế bào có trong 200 μl/giếng để xác định lượng tế bào tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Phiến nuôi cấy được ủ trong tủ nuôi cấy tế bào 5% CO2. Sau 3 ngày kết thúc qui trình nuôi cấy. Tế bào sau khi nuôi cấy được cố định bằng TCA lạnh, rửa, để khô, nhuộm sulforhodamin B 0,4% và rửa lại bằng acid acetic 1% để loại màu thừa. Sau đó tế bào được hoà lại vào dung dịch đệm Tris, và đo mật độ quang.
Cách tính kết quả:
- Đọc mật độ quang (OD, optical density) của các mẫu trên máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm. Dựa theo kết quả mật độ quang của các mẫu: lúc bắt đầu thí nghiệm: OD (ngày 0); mẫu chứng âm: OD (DMSO) và của mẫu trong điều kiện nghiên cứu (OD mẫu) để tìm giá trị CS% (tỷ lệ tế bào còn sống %, cell survival %) theo công thức sau:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
- Giá trị CS% tính theo công thức trên được đưa vào tính toán Excel để tìm phần trăm trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn, theo công thức Duncan, phép thử lặp lại 3 lần.
Độ lệch tiêu chuẩn σ: σ = 1 ) ( 2 n x xi
- Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp nhằm xác định giá trị IC50. Dùng giátrị tỷ lệ tế bào sống tương ứng với các nồng độ (CS của 10 thang nồng độ), dựa vào đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử nghiệm để tính giá trị IC50 theo công thức:
X b a Y ln 1
2.2.2.3Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính làm lành nhanh vết thƣơng (in vivo)
Thực hiện qui trình thử nghiệm chữa phỏng cho chuột dựa theo tài liệu đã công bố của Shukla Y. N. và cộng sự[68, 69]
nghiên cứu hoạt tính làm lành vết thương của asiaticoside cô lập từ cây Centella asiatica.
- Thực hiện trên 3 lô chuột: Một lô để sàng lọc sơ bộ khả năng làm lành vết thương và lượng mẫu cần thiết đặt lên mỗi vết phỏng, phỏng mức độ 1. Một lô thử nghiệm hiệu quả chữa phỏng mức độ 2. Một lô thí nghiệm so sánh hiệu quả chữa phỏng mức độ 2 của các mẫu cao với các mẫu đối chứng.
- Mỗi ngày dùng 2 ml mẫu pha từ cao tẩm vào gạc tiệt trùng (2x2 cm2) và đặt lên vết thương của mỗi chuột. Sau khi thoa các mẫu thử hoặc thuốc lên vết phỏng, quan sát ghi nhận trạng thái mài, sẹo ở mặt ngoài vết thương. Theo dõi quá trình lên mài các vết thương, chụp hình, lưu và hệ thống kết quả thu được sau các thử nghiệm.
2.2.2.4Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật
Hoạt tính kháng vi sinh vật được thực hiện theo hai bước: Sàng lọc tìm mẫu có hoạt tính bằng cách thử theo phương pháp khuếch tán trên thạch, dùng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu có hoạt tính, theo phương pháp của Vanden Berghe và Vlietinck[71]
(1991), McKane L. và Kandel[51] (1996), tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng. Kháng sinh kiểm định (được sử dụng làm chất đối chứng dương) bao gồm: Ampicillin khi thử với vi khuẩn Gr(+), Tetracycline khi thử với vi khuẩn Gr(-), Nystatin khi thử với nấm sợi và nấm men.
Vi sinh vật sau khi được hoạt hoá được tiếp tục pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108
vsv/ml) rồi tiến hành thí nghiệm với các mẫu thử và các loại mẫu đối chứng. Ủ các phiến thử nghiệm trong tủ ấm, 37 o
C/24giờ đối với vi khuẩn, và 30 o
C/48giờ đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị nồng độ ức chế tối thiểu. Mẫu thô có giá trị MIC ≤ 200 μg/ml và mẫu tinh chất có giá trị MIC ≤ 50 μg/ml được coi là dương tính kháng vi sinh vật.
2.2.2.5Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá
Các mẫu có tác dụng kháng oxy hóa theo cơ chế loại bỏ gốc tự do sẽ làm giảm màu của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Xác định khả năng này bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng có độ hấp thu cực đại tại λ = 517 nm.
Cho 1 ml mẫu thử (pha trong DMSO) phản ứng với dung dịch DPPH nồng độ 200 μM (pha trong ethanol) thu dung dịch cuối cùng có nồng độ mẫu thử là
100 μg/ml và nồng độ DPPH là 190 μM. Hỗn hợp sau khi pha để ở nhiệt độ phòng 30 phút, rồi đo mật độ quang ở bước sóng đã định.
- Khả năng loại bỏ gốc tự do, tính theo phần trăm (SC%, scavenging capacity) được tính theo công thức sau:
[OD (mẫu thử) – OD (mẫu chứng)]
SC% = {100 – x 100 } ± σ OD (mẫu chứng âm tính)
- Các mẫu có SC% ≥ 50% (dương tính) sẽ được thử nghiệm tiếp tục bước 2, để tìm giá trị SC50 (SC50 là nồng độ μg/ml của chất kháng oxy hóa trung hòa 50% gốc tự do DPPH). Độ lệch σ cũng tính theo công thức Duncan, sau khi xử lý các giá trị SC% dựa vào chương trình xử lý số liệu excell của phép thử lặp lại 3 lần.