Tiến hành sắc kí cột (pha thường silica gel 60, pha đảo silica gel RP-18) trên các loại cao và sau đó trên những phân đoạn thu được để cô lập các chất. Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng với thuốc thử hiện hình là dung dịch acid sulfuric 20%, FeCl3, soi đèn UV. Sắc kí điều chế và tinh chế các chất.
2.3.4.1. Cô lập các hợp chất từ cây Hydrocotyle bonariensis
Cô lập các hợp chất từ bột khô toàn cây Hydrocotyle bonariensis
Từ toàn cây Hydrocotyle bonariensis đã cô lập được 14 hợp chất, có kí hiệu Hb-PE, Hb-Eter, Hb-A1, Hb-A3, Hb-Clo, Hb-C2, Hb-C10, Hb-C11, Hb-EA1.4, Hb-
* Đối với cao ether dầu hỏa của toàn cây H. bonariensis: Sử dụng 60 g cao để phân tích sắc ký cột, với 600 g chất hấp phụ silica gel 60 được nạp vào cột có chiều cao 84 cm, đường kính 8 cm. Hệ dung môi giải ly là ether dầu hỏa và tăng dần tính phân cực với acetone, đã thu được 6 phân đoạn khác nhau. Tiếp tục sắc ký cột đối với những phân đoạn có khối lượng đáng kể.
- Phân đoạn PE2 dạng dầu, được sắc ký cột nhiều lần đã cô lập được hợp chất Hb-Eter, 20 mg, dạng sáp, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi PE:C (8:2) cho 1 vết tím với Rf = 0,55. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-Eter là squalene.
- Phân đoạn PE3 dạng sáp có lẫn màu vàng lục (3,70 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-PE, 44 mg, tinh thể hình kim không màu, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi PE:C (1:1) cho 1 vết tím với Rf = 0,55. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-PE là β-sitosterol.
- Phân đoạn PE4 thu được khi giải ly cột sắc ký cao PE với hệ ether dầu hỏa: acetone (9:1) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-A1, 11 mg, dạng tinh thể không màu, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi PE:Ea (9:1) cho 1 vết tím với Rf = 0,55. Phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-A1 là lupeol.
- Phân đoạn PE5 dạng sáp xanh (7,20 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-A3, 10 mg, dạng sáp màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M (95:5) cho 1 vết hồng tím với Rf = 0,47. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-A3 là 2-(4′-methoxyphenyl)-1,3-dioxolane.
* Đối với cao chloroform của toàn cây H. bonariensis: Phân tích sắc ký cột trên 30 g cao, với 300 g silica gel 60 được nạp vào cột có chiều cao 84 cm, đường kính 5 cm. Hệ dung môi giải ly là ether dầu hỏa : chloroform (7:3) và tăng dần tính phân cực với chloroform, ethyl acetate, đã thu được 7 phân đoạn giải ly khác nhau. Trong số các phân đoạn vừa có, tiếp tục sắc ký cột đối với hai phân đoạn C1 và C7.
- Phân đoạn C1 dạng sáp màu xanh lục (4,18 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Clo, 26 mg, dạng dầu màu vàng lục, sắc ký lớp mỏng
giải ly trong dung môi C:M (95:5) cho 1 vết nâu đen với Rf = 0,47. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-Clo là hỗn hợp hinokinin và savinin tỷ lệ mol là (1:3).
Ngoài ra, trong phân đoạn này cũng cô lập được hợp chất Hb-C2, 18 mg, sau khi chấm sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản để so sánh với hợp chất stigmasterol đã cô lập được từ cây H. vulgaris (ký hiệu Hv-PE4), cho kết quả tương đồng, nên đề nghị Hb-C2 là stigmasterol .
- Phân đoạn C7 kết tinh màu vàng ngà (1,14 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hai hợp chất Hb-C10, 30 mg, và Hb-C11, 21 mg.
Hợp chất Hb-C10 là tinh thể không màu, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:Ea (8:2) cho 1 vết nâu đen với Rf = 0,41. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-C10 là β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside.
Hợp chất Hb-C11 là tinh thể không màu, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M (95:5) cho 1 vết hồng sen với Rf = 0,51. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-C11 là acid ursolic.
* Đối với cao ethyl acetate của toàn cây H. bonariensis: Sắc ký cột 37 g cao, với 400 g chất hấp phụ silica gel 60 được nạp vào cột có chiều cao 84 cm, đường kính 8 cm; hệ dung môi giải ly là chloroform:methanol (95:5) và tăng dần tính phân cực với ethyl acetate, đã thu được 7 phân đoạn giải ly khác nhau.
- Phân đoạn E1 dạng sáp màu vàng nhạt (5,12 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Ea1.4, 36 mg, tinh thể hình phiến, màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M (9:1) cho 1 vết nâu với Rf = 0,50. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-Ea1.4 là spinasterol.
- Phân đoạn E3 màu ngà (2,61 g) qua sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Ea5, 15 mg, dạng sáp trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M:N (7:3:0,3) cho 1 vết tím đen với Rf = 0,50. Ghi phổ NMR và FT-MS cho mẫu. Từ kết quả phân tích phổ nghiệm, đề nghị hợp chất Hb-Ea5 là 1-O-(β-D- galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,18E)-2-[(2R’)-2’-hydroxynonadecanoylamino]tricosa- 18-ene-1,3,4-triol.
- Phân đoạn E5 màu ngà (6,10 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Ea6, 18 mg, dạng kết tinh vô định hình màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M:N (7:3:0,3) cho 1 vết tím đen với Rf = 0,55. Từ kết quả phân tích phổ NMR, cho thấy hợp chất Hb-Ea6 cũng là cerebroside.
Để xác định cấu trúc của Hb-Ea6, theo tài liệu tham khảo,[43]
thủy giải 4 mg hợp chất trong methanol-acid (10 ml dung dịch 20% HCl 0,9 M trong methanol), đun hoàn lưu cách thủy trong 18 giờ. Sản phẩm thủy phân được trích với chloroform, đuổi dung môi, làm khan và phân tích GC-MS nhằm xác định mạch acid béo. Phần còn lại là lớp nước được đuổi bớt dung môi và phân tích LC-MS để xác định cấu trúc mạch đường. Kết quả phổ nghiệm và thủy phân cho phép đề nghị hợp chất Hb-Ea6 là 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,9’E)-2-(hexadeca-9’- enoylamino)octadecane-1,3,4-triol.
- Phân đoạn E6 màu ngà (6,41 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Ea8, 32 mg, dạng kết tinh vô định hình màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M:N (8:2:0,2) cho 1 vết tím nâu với Rf = 0,50. Từ kết quả phân tích phổ nghiệm, đề nghị Hb-Ea8 là hỗn hợp đẳng mol của stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside và spinasterol 3-O-β-D-glucopyranoside.
* Đối với cao methanol của toàn cây H. bonariensis: Chỉ sử dụng 100 g cao để sắc ký cột nhanh khô, với 200 g silica gel 60 G được nạp vào cột có chiều cao 15 cm, đường kính 14 cm. Hệ dung môi giải ly là ethyl acetate:methanol (99:1) và tăng dần tính phân cực với nước, sắc ký thu được 6 phân đoạn khác nhau.
- Từ phân đoạn M2 dạng lỏng màu vàng, 22,22 g, qua sắc ký cột nhiều lần đã cô lập được hợp chất Hb-M1, 19 mg, dạng lỏng không màu, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M:N (4:1:1) cho 1 vết đen với Rf = 0,55. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-M1 là sucrose.
- Phân đoạn M4 dạng lỏng vàng lục (13,05 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-M5, 22 mg, tinh thể hình phiến màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M:N (4:2:1) cho 1 vết tím với Rf = 0,50. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-M5 là dioscin.
Thu suất của các hợp chất đã cô lập được so với khối lượng bột toàn cây khô. Các kết quả sắc kí cột được trình bày trong Sơ đồ 2.1 và các Bảng 2.3-2.6.
Bảng 2.3 Sắc ký cột cao ether dầu hỏa (60 g) của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1
Phân đoạn
Dung môi giải ly
Trọng lƣợng cao (g)
Kết quả
SKLM Ghi chú
PE1 PE:A (99:1) 3,8 Nhiều vết Không khảo sát PE2 PE:A (99:1) 8,6 Vết rõ Khảo sát, thu được
Hb-Eter (20 mg; 0,0009%)
PE3 PE:A (95:5) 3,7 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-PE (44 mg; 0,0020%)
PE4 PE:A
(9:1→8:2) 10,4 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-A1 (11 mg; 0,0005%)
PE5 PE:A (7:3) 7,2 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-A3 (10 mg; 0,0005%)
PE6 (8:1→1:9) PE:A 20,5 Nhiều vết Không khảo sát
Bảng 2.4. Sắc ký cột cao chloroform (30 g) của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1
Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lƣợng cao (g) Kết quả SKLM Ghi chú C1 PE:C (7:3→ 6:4) 4,18 Vết rõ
Khảo sát, thu được
Hb-Clo (26 mg; 0,0004%)
C2-C3 PE:C
(1:1→3:7) 2,60; 1,03 Nhiều vết
Khảo sát, thu được
Hb-C2 (18 mg; 0,0003%)
C4-C5 C:Ea
(10:0→8:2) 4,51 Nhiều vết Không khảo sát C6 C:Ea (8:2) 1,14 Vết rõ
Khảo sát, thu được:
Hb-C10 (30 mg; 0,0004%) Hb-C11 (21 mg; 0,0003%)
C7 (7:3→0:10) C:Ea 0,70 Nhiều vết Không khảo sát
(Ghi chú: PE: ether dầu hỏa; C: chloroform; Ea: ethyl acetate; A: acetone; thu suất % so sánh với bột cây khô ban đầu)
Bảng 2.5. Sắc ký cột cao ethyl acetate (37 g) của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lƣợng cao (g) Kết quả SKLM Ghi chú
E1 C:M (95:5) 5,12 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-Ea1.4 (36 mg; 0,0006%)
E2 C:M
(95:5→9:1) 2,00 Nhiều vết Không khảo sát E3 C:M (9:1) 2,61 Vết rõ Khảo sát, thu được:
Hb-Ea5 (15 mg; 0,0002%)
E4 C:M (9:1) 0,91 Nhiều vết Không khảo sát E5 Ea 6,10 Vết rõ Khảo sát, thu được:
Hb-Ea6 (18 mg; 0,0005%)
E6
Ea:M
(95:5) 6,41 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-EA8 (32 mg; 0,0009%)
E7
Ea:M
(8:2→7:3) 7,23 Nhiều vết Không khảo sát
Bảng 2.6. Sắc ký cột cao methanol (100 g) của toàn cây H. bonariensis, sơ đồ 2.1
Phân đoạn
Dung môi giải ly
Trọng lƣợng cao (g)
Kết quả
SKLM Ghi chú
M1 Ea:M (99:1) 11,80 Nhiều vết Không khảo sát M2 Ea:M:N
(20:1:1) 22,22 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-M1 (19 mg; 0,0006%)
M3
Ea:M:N
(20:1:1) 17,23 Nhiều vết Không khảo sát M4 Ea:M:N
(20:2:1) 13,05 Vết rõ Khảo sát, thu được: Hb-M5 (22 mg; 0,0007%) M5 – M6 Ea:M:N (20:6:1→7:3:1) 18,05;
13,70 Nhiều vết Không khảo sát
(Ghi chú: C: chloroform; Ea: ethyl acetate; M: methanol; N: nước; thu suất % so sánh với bột cây khô ban đầu)
Cô lập các hợp chất từ lá của cây Hydrocotyle bonariensis
Từ cao ether dầu hỏa, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao butanol của lá cây H. bonariensis đã cô lập được 12 hợp chất và 1 hỗn hợp, kí hiệu là Hb-T1, Hb- T2, Hb-C3, Hb-C9, Hb-C1.1, Hb-Flaw1, Hb-Flaw2, Hb-Flaw3, Hb-Ea11, Hb-Bu1, Hb-Bu2, Hb-Bu3 và Hb-T4.
* Đối với cao ether dầu hỏa của lá cây H. bonariensis: Chỉ sử dụng 40 g cao để phân tích sắc ký cột, với 400 g chất hấp phụ silica gel 60 được nạp vào cột có chiều cao 84 cm, đường kính 8 cm, hệ dung môi giải ly là ether dầu hỏa và tăng dần tính phân cực với ethyl acetate, đã thu được 5 phân đoạn khác nhau. Tiếp tục sắc ký cột đối với những phân đoạn có khối lượng đáng kể, vết rõ.
- Phân đoạn L.PE3 dạng sáp (3,23 g), được sắc ký cột nhiều lần đã cô lập được hợp chất Hb-T1, 13 mg, dạng sáp, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi PE:Ea (8:2) cho 1 vết tím với Rf = 0,50. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho thấy hợp chất Hb-T1 là một ester béo, nhưng chưa đủ dữ kiện để đề nghị cấu trúc.
- Phân đoạn L.PE4 dạng sáp màu xanh lục (9,50 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-T2, 12 mg, tinh thể hình phiến màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi PE:C (1:1) cho 1 vết tím với Rf = 0,50. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-T2 là acid hexadecanoic.
* Đối với cao chloroform của lá cây H. bonariensis: Phân tích sắc ký cột trên 11,2 g cao, với 200 g chất hấp phụ silica gel 60 được nạp vào cột có chiều cao 84 cm, đường kính 5 cm. Hệ dung môi giải ly là ether dầu hỏa : ethyl acetate (8:2) và tăng dần tính phân cực, đã thu được 8 phân đoạn giải ly khác nhau. Tiếp tục sắc ký cột đối với ba phân đoạn L.C1, L.C6 và L.C7.
- Phân đoạn L.C1 dạng sệt màu lục (2,18 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-C3, 8 mg, tinh thể hình phiến, màu trắng ngà, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi PE:Ea (1:1) cho 1 vết màu tím hóa nâu, Rf = 0,50. Qua phân tích phổ nghiệm hợp chất Hb-C3 được đề nghị là stigmastan-3,6-dione.
- Phân đoạn L.C6 kết tinh màu vàng (1,14 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-C9, 12 mg và hợp chất Hb-C1.1, 16 mg.
Hợp chất Hb-C9 khi chấm sắc ký so sánh trên cùng một bản mỏng, với hợp chất spinasterol đã được cô lập từ bột khô toàn cây H. bonariensis (ký hiệu Hb- Ea1.4), cho kết quả tương đồng, nên được đề nghị là spinasterol.
Hợp chất Hb-C1.1, khi sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi Ea:M (95:5) cho 1 vết với Rf = 0,45 có màu tím hóa nâu khi hiện hình vết bằng acid sulfuric,
nhưng không hiện màu vết trong dung dịch FeCl3. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-C1.1 là alkaloid có tên là tetrahydropalmatine.
- Phân đoạn L.C7 kết tinh màu vàng ngà (1,14 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-T4, 20 mg. Hợp chất Hb-T4 là tinh thể màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi Ea:M (95:5) cho 1 vết nâu đen với Rf = 0,51. Kết quả phân tích phổ nghiệm NMR cho phép đề nghị hợp chất Hb-T4 là cerebroside, khi phân tích HPLC-MS cho thấy đây là hỗn hợp các cerebroside đồng đẳng với khối lượng mol phân tử là từ 838,6374 cho đến 922,7299 amu.
* Đối với cao ethyl acetate của lá cây H. bonariensis: Phân tích sắc ký cột trên 11,6 g cao, với 220 g chất hấp phụ silica gel 60 được nạp vào cột có chiều cao 84 cm, đường kính 5 cm; hệ dung môi giải ly là chloroform:methanol (95:5) và tăng dần tính phân cực, đã thu được 6 phân đoạn giải ly khác nhau.
- Phân đoạn L.E1 dạng sáp màu vàng (1,12 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Flaw1, 7 mg, dạng bột màu vàng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:Ea (1:1) cho 1 vết vàng đậm với Rf = 0,50, vết phát huỳnh quang ở bước sóng UV 365 nm. Kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-Flaw1 là esculetine.
- Phân đoạn L.E2 màu vàng (1,16 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Flaw2, 8 mg, tinh thể vô định hình, màu vàng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi Ea:M (9:1) cho 1 vết màu vàng với Rf = 0,55. Từ kết quả phân tích phổ nghiệm, đề nghị hợp chất Hb-Flaw2 là kaempferol.
- Phân đoạn L.E3 màu ngà (2,50 g) được sắc ký cột nhiều lần, kết quả cô lập được hợp chất Hb-Flaw3, 35 mg, cùng với Hb-Ea3, 34 mg, (phổ của hợp chất chưa đủ để biện luận định danh riêng).
Hợp chất Hb-Flaw3 là dạng kết tinh vô định hình vàng kem, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi Ea:M (9:1) cho 1 vết tím với Rf = 0,45, tuy nhiên trong dung dịch FeCl3 thì không hiện màu vết. Các kết quả phân tích phổ nghiệm cho phép đề nghị hợp chất Hb-Flaw3 là alkaloid: (S)-xylopinine.
chất Hb-Ea11, 14 mg, kết tinh vô định hình màu trắng, sắc ký lớp mỏng giải ly trong dung môi C:M:N (8:2:1) cho 1 vết tím với Rf = 0,50. Phổ NMR cho phép đề nghị Hb-Ea11 là cerebroside. Thực hiện metanol giải hợp chất Hb-Ea11 (3 mg) với dung dịch 20% HCl 0,9M trong methanol (10 ml), bằng đun hoàn lưu cách thủy trong 18 giờ. Dịch trích chloroform sản phẩm được phân tích GC-MS để xác định