Từ lâu, một số cây Hydrocotyle thường được sử dụng làm rau ăn, sử dụng theo y học cổ truyền để làm thuốc hạ sốt, lợi tiểu, giảm đau và trị cảm ho, một vài vùng sử dụng chúng làm thuốc trị lở loét, điều trị phỏng. Tuy số thông tin về dược tính trên các loài thuộc chi Hydrocotyle không nhiều, các nghiên cứu khoa học đã ngày càng chứng minh dược tính của một số cây trong chi là rất khả quan. Khi thử nghiệm in vitro trên một vài nhóm hợp chất trích từ các cây trong chi Hydrocotyle
cho thấy hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus và kháng tế bào ung thư. Một dược tính nổi trội của các cây Hydrocotyle là kích thích hồi phục tế bào, làm lành các vết thương.
1.4.3 Phân tích đánh giá tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện nay trong nước, chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học cũng như khảo sát hoạt tính sinh học trên các cây rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis và Hydrocotyle vulgaris.
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1 Hóa chất và thiết bị dùng trong tách chiết cô lập chất 2.1.1.1 Hóa chất 2.1.1.1 Hóa chất
Dung môi: ether dầu hỏa (6090 oC), hexane, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, acetone, butanol, methanol, ethanol 95 o (CHEMSOL);
Thuốc thử hiện hình vết trên bản mỏng: H2SO4 20% trong methanol;
Sắc ký lớp mỏng: pha thường: TLC Silica gel 60 F254 (250 m, MERCK); pha đảo: TLC Silica gel 60 RP18 F254 S (200 m, MERCK);
Chất hấp phụ cho sắc ký cột pha thường: Silica gel 60 (0,0400,063 m, SCHALAU, MERCK); cột nhanh khô: Silica gel 60 G (MERCK); cột pha đảo: Silica gel 90 C18-Reversed phase (FLUKA);
Sắc ký trao đổi ion: Diaion HP20 (MITSUBISHI);
2.1.1.2 Thiết bị
Buồng soi UV (UVB, USA); tỷ khối kế (2 ml) ; khúc xạ kế (KRUSS) (c);
Cân phân tích (SARTORIOUS BL 210S); bếp cách thủy (MEMMERT);
Máy thu hồi dung môi dưới áp suất thấp (BUCHI, HEIDOLF);
Máy đo nhiệt độ nóng chảy (MEL-TEMP 1102D) 230V (c);
Máy đo phổ hồng ngoại–ép mẫu trong KBr (Vector22 BRUKER) (c);
Máy cộng hưởng từ hạt nhân (BRUKER AVANCE) với tần số 500 MHz cho phổ 1
HNMR và 125 MHz cho phổ 13
CNMR (a), (b);
Máy đo khối phổ HRESIMS (Bruker MicrOTOF–Q 10187) (a);
Máy đo năng lực triền quang P8100T (KRUSS).
(a) Thực hiện tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
(b) Thực hiện tại Phòng Phân tích Cấu trúc Hóa học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.
2.1.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong thử nghiệm hoạt tính sinh học
* Thử nghiệm Brine-Shrimp (thử hoạt tính với Artemia)
- Trứng Artemia salina, của khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
- Dimethyl sulfoxide (DMSO); nước biển 35o/oo
- Bình thủy tinh thiết kế hai ngăn: sáng, tối, có vách thông nhau; đèn soi - Pipetman sử dụng 2 loại cone 5-500 µl và 1000-2000 µl
* Thử độc tính với tế bào ung thư
Thử độc tính tế bào ung thư vú và cổ tử cung
- Dòng tế bào ung thư vú (MCF–7) và dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI), Maryland, Mỹ;
Thử độc tính tế bào ung thư phổi, gan và cơ màng tim
- Dòng tế bào ung thư phổi (LU), gan (Hep-G2) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bioassay, trường Đại học Dược Illinois, Chicago, Hoa Kỳ;
- Dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), và dòng ung thư màng tim (Rhabdocarcoma- RD) từ viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương Việt Nam.
* Thử hoạt tính làm lành vết thương trên chuột
- Madecassol (Bayer, Pháp) - Nước muối tinh khiết 80 o/oo
- Chuột bạch đực thuần chủng, chuột nhắt, 4 tuần tuổi (Viện Pasteur TP. HCM) - Lồng nuôi, thức ăn viên chế biến sẵn, bình có ống thông cho chuột uống nước
* Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
- Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm:
+ Vi khuẩn Gr(-): Eseheriehia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923). Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis (ATCC 27212),
Staphylococcus aureus (ATCC 12222)
+ Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae
(SH 20). Nấm sợi: Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42).
(SIGMA), còn vi khuẩn được duy trì trong Trypcase soya broth–TDB (SIGMA). - Môi trường thí nghiệm với vi khuẩn: Eugon Broth LT 100 (Difco, Mỹ), với nấm: Mycophil agar (Difco, Mỹ).
- Các kháng sinh để pha mẫu đối chứng: Ampicillin 50 mM, Tetracycline 10 mM, Nystatin 0,04 mM. Kháng sinh được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp.
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Tách chiết, cô lập và định danh các hợp chất hữu cơ
Mẫu nguyên liệu được thu trên cùng một vùng, định danh và lưu tiêu bản. Xác định độ ẩm của nguyên liệu, theo công thức
Độ ẩm (%) =
Trọng lượng tươi
Phân chia nguyên liệu tươi thành các bộ phận để trích tinh dầu. Khảo sát hai phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp và gián tiếp để chọn phương pháp chưng cất phù hợp. Khảo sát điều kiện trích ly tinh dầu với hiệu suất ổn định nhất, trên các thông số: khối lượng nguyên liệu, lượng nước cho mỗi mẻ nguyên liệu và thời gian chưng cất, bằng cách thay đổi một thông số khi cố định các thông số khác. Dung dịch lôi cuốn bằng hơi nước được trích kiệt với diethyl ether, làm khan bằng Na2SO4, thu hồi dung môi để thu lấy tinh dầu. Ghi nhận các thông số vật lý cho từng loại tinh dầu và ghi phổ GC-MS để xác định thành phần cấu tử.
Để tách chiết, cô lập các hợp chất hữu cơ sử dụng bột cây khô bằng cách hong gió nguyên liệu, sấy đến khô (60-80 C) và xay mịn. Các loại bột nguyên liệu được trích nóng với ethanol ở khoảng 70 C hoặc ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, lặp lại nhiều lần để trích kiệt, lọc và thu gom dịch trích đem cô quay loại bỏ dung môi thu được cao trích thô ethanol. Cao alcol ban đầu này được trích pha rắn hoặc trích phân bố lỏng-lỏng với các dung môi hữu cơ thường dùng để phân chia thành các dịch trích, khi cô cạn dung môi thu được các cao có tính phân cực khác nhau. Sử dụng sắc ký cột thường hoặc cột nhanh khô để cô lập các hợp chất hữu cơ. Tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh lại.
Phân tích LC-MS, ESI-MS hoặc FT-MS để xác định khối lượng mol phân tử.
X 100 Trọng lượng tươi – trọng lượng khô
Ghi phổ NMR, IR, UV và xác định các hằng số vật lý của các hợp chất cô lập được để giải đoán cấu trúc, và so sánh với tài liệu đã công bố để định danh các chất.
Khảo sát mạch của cerebroside theo tài liệu tham khảo: đun hoàn lưu cerebroside trong metanol-acid, trích hexane[32] hoặc chloroform[43] dung dịch sản phẩm và cô đuổi dung môi, làm khan để phân tích GC-MS xác định mạch acid béo. Lớp nước còn lại được cô đặc rồi hòa tan tủa trở vào methanol và trích ethyl acetate, phân tích GC-MS để khảo sát mạch aminoalcol.[32] Khảo sát sự oxy hóa nối đôi trên mạch bằng cách cho tinh thể KMnO4 vào lượng aminoalcol được hòa tan vào hỗn hợp 10% H2SO4 trong acetone và khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng; sau đó trích hexane hoặc diethyl ether trên dung dịch sản phẩm của sự oxy hóa, cô đuổi dung môi và phân tích GC-MS để xác định các mảnh acid tạo thành từ nối đôi. [43]
2.2.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các nhóm hợp chất hữu cơ 2.2.2.1Phƣơng pháp thử nghiệm Brine-shrimp 2.2.2.1Phƣơng pháp thử nghiệm Brine-shrimp
Thử nghiệm Brine-shrimp xác định độc tính của mẫu cao hoặc hợp chất cô lập được với ấu trùng Artemia salina (Artemia nauplius). Thử nghiệm với nồng độ mẫu thử (µg/ml) thay đổi, sau một thời gian nhất định, thí dụ 24 giờ, ghi nhận liều LC50. Mẫu cao có giá trị LC50 ≤ 200 μg/ml được coi là dương tính với thử nghiệm.
Liều LC50 này giúp dự đoán độc tính của mẫu thử với một số loài côn trùng, với tế bào ung thư (in vitro), trong điều kiện phòng thí nghiệm nhỏ.
2.2.2.2Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ (in vitro)
Theo phương pháp của Skehan P. và cộng sự[56] (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự[45]
(1993), hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Cách thử nghiệm
- Các mẫu thử nghiệm: mẫu cao hoặc mẫu hợp chất được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, mẫu đối chứng dương (dung dịch ellipticin), mẫu chứng âm (DMSO). - Dung dịch huyền phù tế bào: Tế bào của các dòng (gây ung thư ở người: RD, KB, LU, Hep-G2) được xử lý bằng trypsin –EDTA; hoà vào môi trường nuôi cấy sạch tạo ra dung dịch huyền phù tế bào, nồng độ 3 x 104
Cho vào mỗi giếng của phiến thử nghiệm 96 giếng các thể tích lần lượt là: 10 μl mẫu thử nghiệm và 190 μl dung dịch huyền phù tế bào trong môi trường nuôi cấy. Nhuộm tế bào có trong 200 μl/giếng để xác định lượng tế bào tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Phiến nuôi cấy được ủ trong tủ nuôi cấy tế bào 5% CO2. Sau 3 ngày kết thúc qui trình nuôi cấy. Tế bào sau khi nuôi cấy được cố định bằng TCA lạnh, rửa, để khô, nhuộm sulforhodamin B 0,4% và rửa lại bằng acid acetic 1% để loại màu thừa. Sau đó tế bào được hoà lại vào dung dịch đệm Tris, và đo mật độ quang.
Cách tính kết quả:
- Đọc mật độ quang (OD, optical density) của các mẫu trên máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm. Dựa theo kết quả mật độ quang của các mẫu: lúc bắt đầu thí nghiệm: OD (ngày 0); mẫu chứng âm: OD (DMSO) và của mẫu trong điều kiện nghiên cứu (OD mẫu) để tìm giá trị CS% (tỷ lệ tế bào còn sống %, cell survival %) theo công thức sau:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
- Giá trị CS% tính theo công thức trên được đưa vào tính toán Excel để tìm phần trăm trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn, theo công thức Duncan, phép thử lặp lại 3 lần.
Độ lệch tiêu chuẩn σ: σ = 1 ) ( 2 n x xi
- Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp nhằm xác định giá trị IC50. Dùng giátrị tỷ lệ tế bào sống tương ứng với các nồng độ (CS của 10 thang nồng độ), dựa vào đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử nghiệm để tính giá trị IC50 theo công thức:
X b a Y ln 1
2.2.2.3Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính làm lành nhanh vết thƣơng (in vivo)
Thực hiện qui trình thử nghiệm chữa phỏng cho chuột dựa theo tài liệu đã công bố của Shukla Y. N. và cộng sự[68, 69]
nghiên cứu hoạt tính làm lành vết thương của asiaticoside cô lập từ cây Centella asiatica.
- Thực hiện trên 3 lô chuột: Một lô để sàng lọc sơ bộ khả năng làm lành vết thương và lượng mẫu cần thiết đặt lên mỗi vết phỏng, phỏng mức độ 1. Một lô thử nghiệm hiệu quả chữa phỏng mức độ 2. Một lô thí nghiệm so sánh hiệu quả chữa phỏng mức độ 2 của các mẫu cao với các mẫu đối chứng.
- Mỗi ngày dùng 2 ml mẫu pha từ cao tẩm vào gạc tiệt trùng (2x2 cm2) và đặt lên vết thương của mỗi chuột. Sau khi thoa các mẫu thử hoặc thuốc lên vết phỏng, quan sát ghi nhận trạng thái mài, sẹo ở mặt ngoài vết thương. Theo dõi quá trình lên mài các vết thương, chụp hình, lưu và hệ thống kết quả thu được sau các thử nghiệm.
2.2.2.4Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật
Hoạt tính kháng vi sinh vật được thực hiện theo hai bước: Sàng lọc tìm mẫu có hoạt tính bằng cách thử theo phương pháp khuếch tán trên thạch, dùng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu có hoạt tính, theo phương pháp của Vanden Berghe và Vlietinck[71]
(1991), McKane L. và Kandel[51] (1996), tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng. Kháng sinh kiểm định (được sử dụng làm chất đối chứng dương) bao gồm: Ampicillin khi thử với vi khuẩn Gr(+), Tetracycline khi thử với vi khuẩn Gr(-), Nystatin khi thử với nấm sợi và nấm men.
Vi sinh vật sau khi được hoạt hoá được tiếp tục pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108
vsv/ml) rồi tiến hành thí nghiệm với các mẫu thử và các loại mẫu đối chứng. Ủ các phiến thử nghiệm trong tủ ấm, 37 o
C/24giờ đối với vi khuẩn, và 30 o
C/48giờ đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị nồng độ ức chế tối thiểu. Mẫu thô có giá trị MIC ≤ 200 μg/ml và mẫu tinh chất có giá trị MIC ≤ 50 μg/ml được coi là dương tính kháng vi sinh vật.
2.2.2.5Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá
Các mẫu có tác dụng kháng oxy hóa theo cơ chế loại bỏ gốc tự do sẽ làm giảm màu của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Xác định khả năng này bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng có độ hấp thu cực đại tại λ = 517 nm.
Cho 1 ml mẫu thử (pha trong DMSO) phản ứng với dung dịch DPPH nồng độ 200 μM (pha trong ethanol) thu dung dịch cuối cùng có nồng độ mẫu thử là
100 μg/ml và nồng độ DPPH là 190 μM. Hỗn hợp sau khi pha để ở nhiệt độ phòng 30 phút, rồi đo mật độ quang ở bước sóng đã định.
- Khả năng loại bỏ gốc tự do, tính theo phần trăm (SC%, scavenging capacity) được tính theo công thức sau:
[OD (mẫu thử) – OD (mẫu chứng)]
SC% = {100 – x 100 } ± σ OD (mẫu chứng âm tính)
- Các mẫu có SC% ≥ 50% (dương tính) sẽ được thử nghiệm tiếp tục bước 2, để tìm giá trị SC50 (SC50 là nồng độ μg/ml của chất kháng oxy hóa trung hòa 50% gốc tự do DPPH). Độ lệch σ cũng tính theo công thức Duncan, sau khi xử lý các giá trị SC% dựa vào chương trình xử lý số liệu excell của phép thử lặp lại 3 lần.
2.3 THỰC NGHIỆM 2.3.1 Khảo sát nguyên liệu 2.3.1 Khảo sát nguyên liệu 2.3.1.1 Thu hái và xử lý mẫu
Các cây Rau má lá sen có tên khoa học là Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L., (Apiaceae) được nhận danh bởi Dược sĩ Phan Đức Bình, tạp chí Thuốc và sức khỏe- thành phố Hồ Chí Minh và Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Huê, bộ môn Sinh, khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Cần Thơ.
Mẫu khô của hai cây được lưu giữ trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu USA020 cho cây Hydrocotyle bonariensis và ký hiệu mẫu USA021 cho cây Hydrocotyle vulgaris, lưu tại bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
2.3.1.2 Xác định độ ẩm
Mẫu cây tươi sau khi làm sạch, được sấy khô ở nhiệt độ 80 C đến khi khối lượng không đổi. Thực hiện 3 lần, so sánh lượng mẫu lúc tươi và khô, suy ra độ ẩm trung bình của mẫu. Độ ẩm của các mẫu cây được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Độ ẩm của các bộ phận của hai loài H. bonariensis và H. vulgaris
Bộ phận cây Độ ẩm (%)
H. bonariensis H. vulgaris
Lá 87,8 86,5
Thân rễ 83,6 83,0
2.3.2 Điều chế các loại cao
2.3.2.1 Điều chế các loại cao từ toàn cây Hydrocotyle bonariensis
Toàn cây Hydrocotyle bonariensis (88 kg) được loại bỏ phần hư, sâu, rửa sạch, hong gió và sấy đến khô (60-80 C). Bột khô toàn cây H. bonariensis (6,7 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với ethanol ở nhiệt độ phòng, chiết và lọc sau 24 giờ ngâm, nhiều lần. Dịch lọc được cô quay loại bỏ dung môi thu được cao thô ethanol (cao A-Hb, 560 g). Trong khi cô quay có kết tinh trên thành bình cầu, lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ dạng tinh thể hình phiến (22 g).
Cao thô ethanol được tiến hành trích pha rắn với silica gel, dung môi giải ly đầu tiên là ether dầu hỏa (6090 oC) rồi đến chloroform, ethyl acetate, sau cùng là methanol. Các dung dịch sau khi trích được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, cho ra các cao tương ứng: cao ether dầu hỏa (Hbon-PE, 180 g), cao chloroform (Hbon- C, 30 g), cao ethyl acetate (Hbon-EA, 37 g) và cao methanol (Hbon-M, 200 g).
2.3.3.2 Điều chế các loại cao từ lá cây Hydrocotyle bonariensis
Bột khô lá cây H. bonariensis (2,2 kg) được tận trích bằng phương pháp chiết nóng với ethanol, ở 70 oC. Dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích thô ethanol (T-Hb, 145 g).
Cao thô ethanol (134 g) được hòa tan với một lượng tương đương nước để tạo dịch sệt, trích lỏnglỏng lần lượt với ether dầu hỏa (6090 oC), chloroform,
ethyl acetate, rồi n-butanol. Các dung dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất