Thử nghiệm khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định đối với tinh dầu của hai mẫu cây nguyên liệu, được trình bày trong Bảng 3.34.
Bảng 3.34. Kết quả thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu hai cây
Mẫu thử
MIC (µg/ml)
Khuẩn gram (-) Khuẩn gram (+) Nấm men Nấm mốc
E. coli P. aeru ginosa B. sub- tillis S. au- reus Asp. niger F. oxy- sporum S. cere- visiae C. al- bicans Tinh dầu H. bonariensis 100 200 (-) 100 (-) 100 (-) (-) Tinh dầu H. vulgaris (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Nhận xét kết quả thử nghiệm
3.4.4 Thử nghiệm khả năng làm lành vết thương trên chuột
Mẫu thử nghiệm là cao ethyl acetate và butanol của hai cây được pha vào dung dịch nước muối 8%o để đạt nồng độ dung dịch mẫu thử là 0,5%. Sử dụng dung dịch này, mỗi ngày dùng 2 ml mẫu thử mỗi loại, tẩm vào gạc tiệt trùng (2x2) cm2 và đặt lên vết thương của mỗi chuột. Sau khi thoa các mẫu thử hoặc thuốc lên vết phỏng, quan sát ghi nhận trạng thái mài, sẹo ở mặt ngoài vết thương. Theo dõi quá trình lên mài của các vết thương, chụp hình lưu và hệ thống kết quả thu được sau các thử nghiệm. Kết quả được trình bày trong Phụ lục 41a, 41b, 41c.
Nhận xét kết quả thử nghiệm
+ Trên lô chuột thứ nhất.
Quan sát chuột bị phỏng cấp độ 1, nhận thấy đến ngày thứ 7 các vết phỏng lên mài. Đến ngày thứ 11, vết thương lành hẳn. Kết quả lần thử nghiệm 1 cho thấy các mẫu cao đều có thể chữa phỏng.
+ Trên lô chuột thứ 2. Kết quả sau các ngày thoa mẫu thử được ghi trong hình 5, (trong phần phụ lục). Các cao có khả năng chữa phỏng độ 1, lành vết thương trong thời gian 10 - 12 ngày, tối đa 16 ngày sau khi bị phỏng, nếu có bị va chạm làm tróc mài thì mài thứ cấp cũng kịp lành hẳn.
+ So với thuốc Madecasol, các cao có hoạt tính làm mau liền sẹo, hiệu quả rất đáng kể, với kết quả vết thương lên mài và lành hẳn chậm hơn khi dùng thuốc chỉ 2-3 ngày, tuỳ từng nhóm. Mặt khác khi không dùng các mẫu cao pha để trị liệu, vết thương của lô chuột trong nhóm mẫu đối chứng âm chỉ lành sau 7 ngày kế tiếp.
3.4.5 Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa
Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do bằng thử nghiệm làm giảm màu DPPH, được gủi thực hiện trên hai mẫu chất flavonoid đã cô lập được từ hai cây. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong phụ lục 3.42.
Nhận xét kết quả thử nghiệm:
Hai hợp chất flavonoid có hoạt tính kháng oxy hóa rất tốt. Cả hai mẫu hợp chất Hb-Bu2 và Hv-A1 (36) đều có giá trị EC50 (µg/ml) nhỏ, xác định được lần lượt là 5,60 và 11,44, trong khi mẫu chứng dương (resveratrol) là 8,50.
3.4.6 Nhận định chung về hoạt tính của nhóm chất trích từ rau má lá sen
Hydrocotyle bonariensis và Hydrocotyle vulgaris
Với thử nghiệm Brine-shrimp, các cây rau má lá sen Hydrocotyle bonariensis và H. vulgaris có độc tính với ấu trùng Artemia. Kết quả cho thấy cao ether dầu hoả của hai cây, cao chloroform và các tinh dầu lá, thân của cây H.bonariensis có độc tính với ấu trùng rõ hơn.
Về khả năng gây độc các dòng tế bào ung thư: Tinh dầu và cao metanol của cây H. bonariensis có khả năng gây độc đối với ung thư cơ tim (RD) với giá trị IC50 (µg/ml) lần lượt là 16,10 và 9,90 cho thấy các mẫu từ cây H. bonariensis này có hoạt tính tốt, cần được nghiên cứu sâu hơn. Tinh dầu của cây H. bonariensis còn có độc tính với tế bào ung thư gan (Hep-G2), với giá trị IC50 là 19,93 (µg/ml). Do khả năng gây độc tế bào ung thư một cách chọn lọc, nên tinh dầu này đã được đánh giá rằng có khả năng ứng dụng. Trong số các loại cao thành phần của H. bonariensis có cao chloroform là có độc tính yếu đối với các tế bào ung thư vú.
Hợp chất acid ursolic [Hb-C11, Hv-C8, (139)] cô lập được từ cao chloroform của hai cây có khả năng gây độc tế bào với cả 3 dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), gan (Hep-G2) và phổi (Lu), với giá trị IC50 (µg/ml) xác định được lần lượt là 16,39; 24,0 ; 24,0.
Về hoạt tính chữa phỏng: Các cây rau má lá sen có khả năng làm lành nhanh hơn những vết phỏng cấp độ 1 và 2 trong thử nghiệm in vivo chữa phỏng trên chuột. Những cao có tính phân cực hơn mới thể hiện khả năng chữa phỏng, và cao của cây Hydrocotyle bonariensis cho thấy có hoạt tính trội hơn cây
Hydrocotyle vulgaris.
Về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Chỉ tinh dầu của cây H. bonariensis có tính kháng khuẩn, kháng được 2 dòng vi khuẩn Gram âm E. coli và P. aeruginosa (với khả năng kháng khuẩn P. aeruginosa không cao), 1 dòng khuẩn gram dương S. aureus và kháng nấm men F. oxysporum.
Hợp chất flavonoid (36) cô lập từ hai cây có khả năng kháng oxy hóa, mẫu chất Hb-Bu2 từ cây H. bonariensis và Hv-A1 từ cây H. vulgaris, có giá trị EC50 (µg/ml) trong thử nghiệm DPPH lần lượt là 5,60 và 11,44.
Kết quả các thử nghiệm đều cho thấy cây Hydrocotyle bonariensis có hoạt tính vượt trội hơn cây Hydrocotyle vulgaris. như độc tính với tế bào ung thư cơ màng tim (RD) và ung thư gan (Hep-G2), gây độc yếu với tế bào ung thư vú (MCF-7), có khả năng kháng vi khuẩn gram âm nhiều hơn khuẩn gram dương (E. coli, P.aeruginosa và S. aureus), kháng nấm men F. oxysporum.
3.5 NHẬN XÉT VỀ HÓA THỰC VẬT CỦA CHI HYDROCOTYLE
Từ các hợp chất cô lập được từ 2 loài Hydrocotyle bonariensis và
Hydrocotyle vulgaris cũng như các hợp chất trong các loài khác cùng chi, ở phần tổng quan, chúng tôi nhận thấy các cây thuộc chi Hydrocotyle có chứa những loại hợp chất sau:
* Các hợp chất acetylenic: trong các cây thuộc chi Hydrocotyle có các hợp chất acetylenic với đặc điểm như: mạch thẳng không phân nhánh, dài 15 hoặc 17 carbon, luôn có mang 2 nối ba tại C-4 và C-6, có thêm 1 hoặc 2 nối đôi tại hai trong số bốn vị trí: C-1, C-2, C-8, C-9. Ngoài ra, mạch có mang các nhóm –OH (thường gặp tại C-3, hoặc C-8), –OAc (thường gặp tại C-8, hoặc C-1, C-3, C-10), –OCH3
(tại C-1 hoặc C-10), hoặc có nhóm oxo tại C-3.
* Các hợp chất ceramide và cerebroside
Các hợp chất ceramide thường có mảnh aminoalcol là mạch bão hòa có 14 carbon, tạo liên kết amide nối với mảnh acid α-hydroxycarboxylic có chứa số carbon thay đổi (20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 carbon trong mạch).
Trong nhóm hợp chất leucocerebroside, cô lập được từ cây H. leucocephala, phân tử các hợp chất gồm có 3 mảnh, mảnh aminoalcol là mạch bão hòa dài 21 carbon có một nối đôi cấu hình E, vị trí nối đôi không xác định rõ; mảnh acid carboxylic có khi có mang thêm nhóm α-hydroxy, có mạch carbon thay đổi (16, 18, 22, 23, 24 carbon) và mảnh đường là galactose.
Trong luận án này chúng tôi cũng cô lập, xác định cấu trúc hai hợp chất cerebroside, một hỗn hợp của hai hợp chất cùng phân tử khối. Cấu trúc của các hợp chất đã cô lập cũng có những điểm tương đồng: mảnh amino alcol là mạch bão hòa hoặc có một nối đôi cấu hình E, vị trí nối đôi thay đổi, tại C-8 hay C-18; mảnh acid carboxylic có hoặc không có nhóm –OH kế nhóm carbonyl, có một nối đôi cấu hình
E, hoặc mạch bão hòa; mảnh đường là galactose.
* Các hợp chất butyrolactone lignan
Nhóm hợp chất này lần đầu tiên được phát hiện trong chi Hydrocotyle. Trong cấu trúc phân tử có 20 carbon, với hai nhân benzyl gắn trên khung butyrolactone, tại vị trí 2 và 3 của khung; hai mạch gắn vào có thể đều là mạch bão hòa, hoặc có thể một mạch có mang nối đôi C=C; hai nhân thơm đều thuộc nhóm benzodioxole (cấu trúc methylenedioxyphenyl).
* Các hợp chất flavonoid
Như các cây Hydrocotyle đã được nghiên cứu, trong luận án này cô lập được các flavonoid gồm quercetin, kaempferol và các glycoside tương ứng của các hợp chất này, với cầu nối glycosidic từ nhóm –OH tại C-3 hoặc C-7 .
Trong chi Hydrocotyle, các glycoside của những hợp chất flavonon (quercetin, kaempferol) có mạch đường là β-D-glucopyranose, β-D- galactopyranose, α-L-rhamnose; hoặc cấu trúc nhiều phân tử đường như gốc -D- (6"-caffeoylgalactoside); gốc (6-O-α-L-arabinopyranosyl)-β-D-galactopyranoside; gốc robinobioside: (6-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-galactopyranoside) Cũng có trường hợp cô lập được hợp chất flavonon có mang nhóm methoxy, như isorhamnetin (Hydrocotyle sibthorpioides).
Với hợp chất hesperidin (vitamin B2) đã cô lập được trong luận án này, ghi nhận thêm sự hiện diện của flavanon glycoside, với mạch đường là gốc rutin: (6-O-
α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside) vào danh mục các hợp chất flavonoid trong chi Hydrocotyle, đồng thời làm tăng khả năng ứng dụng cây nghiên cứu vào thực tiễn.
* Các hợp chất steroid
Từ các cây trong chi Hydrocotyle, các hợp chất sterol với khung sườn stigmastan và glucoside tương ứng đã được cô lập. Bên cạnh các sterol thông thường như β-sitosterol, stigmasterol, spinasterol, trong chi này còn có stigmasta- 7,25-dien-3-ol. Ngoài ra, trong luận án cô lập được hợp chất có khung sườn spirostanol và hợp chất stigmastan-3,6-dion.
* Các hợp chất acid triterpenic và saponin triterpen
Các triterpenoid trong chi Hydrocotyle thường có khung oleanan, ursan hoặc seco-oleanan, oxooleanan, oxooleandien, có nhiều –OH và nhiều đường trong phân tử. Các hợp chất saponin có trong cây thuộc chi này rất đa dạng với số lượng nhóm –OH trong khung triterpen dao động từ 1 nhóm (thường ở vị trí C-3) đến 6 nhóm trong phân tử (thường ở vị trí C-3, C-15, C-21, C-22, C-23, C-28). Có những triterpen mang nhóm thế alkoxyl ở các vị trí C-21, C-22 và C-28. Các đường thường gặp là glucose, rhamnose, arabinose, và thường có trên 2 phân tử đường nối với nhau ở các vị trí 2, 4 hay 6 trong phân tử đường. Các hợp chất saponin rất phân cực, và chúng tôi tập trung nghiên cứu trên các chất phân cực trung bình đến khá, chưa cô lập được các saponin như tài liệu của các cây cùng chi.
* Các hợp chất alkaloid
Theo các bài báo, công bố sự hiện diện của alkaloid có tên hydrocotylin (Hydrocotyle asiatica), tuy nhiên không tìm được tài liệu giúp biết rõ cấu trúc hóa học của hợp chất này. Trong luận án này, cấu trúc của các alkaloid có khung isoquinolin lần đầu tiên được cô lập, góp phần làm sáng tỏ sự hiện diện của các alkaloid trong chi Hydrocotyle. So với các cây cùng chi, hai cây nghiên cứu này đều có vị đắng, nhất là cây Hydrocotyle bonariensis, do vậy việc cô lập được hai hợp chất alkaloid có tính đắng này đã phần nào giải thích tính chất của cây.
* Các hợp chất trong tinh dầu
Tinh dầu của các cây trong chi Hydrocotyle có chứa các nhóm monoterpenoid và sesquiterpenoid, với thành phần chính có khác nhau tùy vào thổ nhưỡng nơi cây phát triển. Song, có thể nhận thấy thành phần chính chủ yếu là các
sesquiterpen, có sự hiện diện của trans-β-farnesene, copaene, caryophyllene, humulene, germacrene-D hay dillapiole, và hàm lượng khá lớn của một vài monoterpenoid như camphor, geranyl acetate.
Đối với hai cây được nghiên cứu trong luận án này, ngoài những hợp chất giống như trên (trans-β-farnesene, copaene, caryophyllene, humulene), trong thành phần chính của tinh dầu còn có các nhóm chất khác, gây mùi đặc trưng cho cây. Trong tinh dầu cây Hydrocotyle bonariensis, các cấu phần chính là monoterpen như: α-pinene, 2β-pinene, β-myrcene, p-cymene, dl-limonene, p-menth-2-en-1-ol, terpinen-4-ol, cryptone, α-terpineol, và có một vài chất khác như 4-methylphenol và các sesquiterpen: α-amorphene, caryophyllene. Trong tinh dầu cây Hydrocotyle vulgaris, các cấu phần chính là sesquiterpenoid như: santalene, α-bergamotene,
trans-β-farnesene, β-bisabolene và caryophyllene oxide, bên cạnh các monoterpen như: α-pinene, 2β-pinene và dl-limonene.
Tinh dầu hai cây rau má lá sen có nhóm chất cấu tử chính khác biệt so với các cây khác cùng chi Hydrocotyle là: α-pinene (4,0-10,0% tinh dầu cây H. bonariensis, tuỳ bộ phận; 21,5% tinh dầu thân cây H. vulgaris); 2β-pinene (khoảng 2,0% tinh dầu cây H. bonariensis, tuỳ bộ phận; 6,4% tinh dầu thân cây H. vulgaris) và dl-limonene (7,0-20,0% tinh dầu cây H. bonariensis, tùy bộ phận; 17,0-25,0% tinh dầu thân cây H. vulgaris, tùy bộ phận).
KẾT LUẬN
Luận án thực hiện nghiên cứu hóa học trên hai loài cây thuộc chi
Hydrocotyle, (Apiaceae), mọc ở Việt Nam là Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lamvà Hydrocotyle vulgaris L. Hai loài cây này được thu hái ở thành phố Mỹ Tho và thành phố Cần Thơ; được nhận danh khoa học bởi Dược sĩ Phan Đức Bình, công tác ở Ban biên tập tạp chí Thuốc và sức khỏe, thành phố Hồ Chí Minh và Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Huê, công tác tại khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Cả hai loài này chưa được nghiên cứu ở Việt Nam.
Việc nghiên cứu trên hai loài cây này đã đạt một số kết quả như sau:
Về kết quả khảo sát thành phần hóa học trên hai loài thuộc chi Hydrocotyle
Từ bột khô của cây, thực hiện phương pháp ngâm dầm và chiết nóng thu được cao alcol, sau đó tiếp tục trích pha rắn silica gel hoặc trích phân bố lỏng –lỏng thu được các loại cao có tính phân cực khác nhau. Thực hiện sắc ký cột pha thường, pha đảo, đã cô lập được 24 hợp chất và 4 hỗn hợp. Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại như IR, ESI-MS, LC-MS, GC-MS, NMR kết hợp so sánh với số liệu trong tài liệu tham khảo đã xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất này.
Trong số các hợp chất đã cô lập có hợp chất mới, cerebroside: 1-O-(β-D- galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,9′E)-2-(hexadeca-9′-enoylamino)octadecane-1,3,4- triol. Ngoài ra, hợp chất cerebroside 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,18E)-2- [(2′R)-2′-hydroxynonadecanoylamino]tricosa-18-ene-1,3,4-triol cũng là cerebroside mới, nhưng cần được cô lập thêm để thủy phân xác định kỹ các mạch béo trong phân tử. Các hợp chất còn lại tuy đã được cô lập từ những cây khác, nhưng đây là lần đầu tiên được biết đến có hiện diện trong các loài Hydrocotyle bonariensis và
Hydrocotyle vulgaris mọc ở Việt Nam.
Chúng tôi đã cô lập và xác định cấu trúc hai hợp chất alkaloid có cùng khung sườn isoquinoline (xylopinine, tetrahydropalmatin), hai hợp chất dibenzylbutyro lactone lignan (hinokinin và savinin) và một flavanon glycoside (hesperidin).
các hợp chất alkaloid, các cerebroside, các lactone, các flavonol và glycoside tương ứng, các sterol và glucoside tương ứng, các triterpen mạch hở, khung lupan và khung ursan, các hợp chất khác như hydratecarbon, ethylglucoside, dioscin, sterone, acid béo. Đối với cây Hydrocotyle vulagaris, cũng đã cô lập được các hợp chất trùng với chất tương ứng trong cây Hydrocotyle bonariensis, như các hợp chất flavonol và glycoside tương ứng, các sterol và glucoside tương ứng, triterpen khung ursan, butyrolactone lignan; ngoài ra cô lập được một hợp chất flavanol glycoside từ cao phân cực, (thực hiện cô lập chất từ lượng mẫu nguyên liệu ít hơn).
Từ các bộ phận lá, hoa, thân, rễ của nguyên liệu cây tươi, chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được 8 loại tinh dầu của các bộ phận. Sử dụng GC-MS xác định được thành phần hóa học và cấu tử chính của tinh dầu. Tinh dầu của hai cây –rau má lá sen- đều có nhóm chất gây mùi đặc trưng khác với các rau má thường, đó là các monoterpene như α-pinene, 2β-pinene, dl-limonene; đồng thời có mặt các sesquiterpenoid đặc trưng của chi Hydrocotyle như farnesene, caryophyllene oxide.. Từ các hợp chất đã cô lập được trong hai loài Hydrocotyle bonariensis và
Hydrocotyle vulgaris cũng như các hợp chất trong các loài khác cùng chi, trình bày ở phần tổng quan, chúng tôi rút ra được những nét đặc trưng về hoá–thực vật của chi Hydrocotyle. Chi Hydrocotyle có những nhóm hợp chất hữu cơ bậc hai như: tinh dầu, hợp chất acetylenic, ceramide, cerebroside, steroid (khung sườn stigmastan và spirostan), triterpenoid (khung sườn oleanan, ursan, secooleanan và lupan), flavonoid (khung sườn flavonol và khung sườn flavanol mà chúng tôi vừa phát hiện), và đặc biệt có nhóm chất alkaloid khung isoquinolin và nhóm dibenzylbutyrolactone lignan là các nhóm mới.
Về kết quả khảo sát hoạt tính sinh học trên hai loài thuộc chi Hydrocotyle
Với thử nghiệm Brine-shrimp: Các cao ether dầu hoả của hai cây H. bonariensis và H. vulgaris có độc tínhvới ấu trùng Artemia, giá trị LC50 nhỏ hơn 30 μg/ml. Ngoài ra, chỉ có cao chloroform, tinh dầu lá và tinh dầu thân của cây H. bonariensis có độc tính với ấu trùng, giá trị LC50 khoảng 50-57 μg/ml, chứng tỏ hoạt tính gây chết Artemia của cây H. bonariensis mạnh hơn của cây H. vulgaris.
Về khả năng gây độc các dòng tế bào ung thư ở người (in vitro): Tinh dầu