Mẫu nguyên liệu được thu trên cùng một vùng, định danh và lưu tiêu bản. Xác định độ ẩm của nguyên liệu, theo công thức
Độ ẩm (%) =
Trọng lượng tươi
Phân chia nguyên liệu tươi thành các bộ phận để trích tinh dầu. Khảo sát hai phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp và gián tiếp để chọn phương pháp chưng cất phù hợp. Khảo sát điều kiện trích ly tinh dầu với hiệu suất ổn định nhất, trên các thông số: khối lượng nguyên liệu, lượng nước cho mỗi mẻ nguyên liệu và thời gian chưng cất, bằng cách thay đổi một thông số khi cố định các thông số khác. Dung dịch lôi cuốn bằng hơi nước được trích kiệt với diethyl ether, làm khan bằng Na2SO4, thu hồi dung môi để thu lấy tinh dầu. Ghi nhận các thông số vật lý cho từng loại tinh dầu và ghi phổ GC-MS để xác định thành phần cấu tử.
Để tách chiết, cô lập các hợp chất hữu cơ sử dụng bột cây khô bằng cách hong gió nguyên liệu, sấy đến khô (60-80 C) và xay mịn. Các loại bột nguyên liệu được trích nóng với ethanol ở khoảng 70 C hoặc ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, lặp lại nhiều lần để trích kiệt, lọc và thu gom dịch trích đem cô quay loại bỏ dung môi thu được cao trích thô ethanol. Cao alcol ban đầu này được trích pha rắn hoặc trích phân bố lỏng-lỏng với các dung môi hữu cơ thường dùng để phân chia thành các dịch trích, khi cô cạn dung môi thu được các cao có tính phân cực khác nhau. Sử dụng sắc ký cột thường hoặc cột nhanh khô để cô lập các hợp chất hữu cơ. Tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh lại.
Phân tích LC-MS, ESI-MS hoặc FT-MS để xác định khối lượng mol phân tử.
X 100 Trọng lượng tươi – trọng lượng khô
Ghi phổ NMR, IR, UV và xác định các hằng số vật lý của các hợp chất cô lập được để giải đoán cấu trúc, và so sánh với tài liệu đã công bố để định danh các chất.
Khảo sát mạch của cerebroside theo tài liệu tham khảo: đun hoàn lưu cerebroside trong metanol-acid, trích hexane[32] hoặc chloroform[43] dung dịch sản phẩm và cô đuổi dung môi, làm khan để phân tích GC-MS xác định mạch acid béo. Lớp nước còn lại được cô đặc rồi hòa tan tủa trở vào methanol và trích ethyl acetate, phân tích GC-MS để khảo sát mạch aminoalcol.[32] Khảo sát sự oxy hóa nối đôi trên mạch bằng cách cho tinh thể KMnO4 vào lượng aminoalcol được hòa tan vào hỗn hợp 10% H2SO4 trong acetone và khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng; sau đó trích hexane hoặc diethyl ether trên dung dịch sản phẩm của sự oxy hóa, cô đuổi dung môi và phân tích GC-MS để xác định các mảnh acid tạo thành từ nối đôi. [43]
2.2.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các nhóm hợp chất hữu cơ 2.2.2.1Phƣơng pháp thử nghiệm Brine-shrimp