Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bốn loài địa y thu hái ở miền nam việt nam

Ngay từ thời cổ đại, địa y đã được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa, …Nhiều hợp chất trong địa y đã được cô lập và một vài hợp chất trong số đó

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



DƯƠNG THÚC HUY

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA BỐN LOÀI ĐỊA Y

THU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62 44 27 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh 2016

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Phản biện 3: PGS.TS Trần Công Luận

Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Trọng Tuân

Phản biện độc lập 2: TS Lê Hoàng Duy

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh vào hồi giờ ngày tháng năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên-HCM

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp HCM

Ngay từ thời cổ đại, địa y đã được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa, …Nhiều hợp chất trong địa y đã được cô lập và một vài hợp chất trong số đó được xác định có tính kháng khuẩn, kháng vi rút, kháng ung thư, giảm đau,

hạ sốt, …

Chi Parmotrema, họ Parmeliaceae, là loài địa y phiến, rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới

Trên thế giới có khoảng 220 loài thuộc chi này và có nhiều loài đã được khảo sát về mặt hóa

dược, cho kết quả rất khả quan Ngoài ra chi Roccella được nghiên cứu khá ít trên thế giới

về mặt hóa thực vật

Với những lý do trên chúng tôi đã chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của bốn loài địa y thu hái ở miền Nam Việt Nam”

2 Đối tƣợng nghiên cứu

Địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow được thu hái tại núi

Tà Cú, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận Địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale được thu hái tại chùa Hang, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận Địa y Parmotrema

planatilobatum (Hale) Hale và Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale được thu hái tại

thành phố Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Thu mẫu, xử lý, bảo quản và định danh đối tượng nghiên cứu

Ngâm, chiết các mẫu địa y để thu được các cao tương ứng

Sắc ký cột silica gel trên các cao để cô lập các hợp chất tinh sạch

Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp quang phổ

Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết, một số hợp chất cô lập

2

Hình 1.1: Địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale (trái)

và Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (phải)

Hình 1.2: Địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow)

Krog & Swincow

Hình 1.3: Địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale

3

4 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp chiết với các dung môi hữu cơ thông dụng để thu các cao

Các phương pháp sắc ký, kết tinh, để cô lập các hợp chất tinh khiết

Các phương pháp quang phổ NMR và MS để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết cô lập được từ loài địa y lựa chọn khảo sát

Các phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn, đóng góp mới của luận án

Luận án đã cô lập và xác định được 49 hợp chất trong đó có 15 hợp chất mới lần đầu tiên cô lập được trong tự nhiên cùng với 14 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong chi

Parmotrema và Roccella

Đã thử hoạt tính gây độc trên bốn dòng tế bào ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung

(HeLa), ung thư phổi (NCI-H460), ung thư gan (HepG2) Kết quả cho thấy hợp chất

6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (13), hopan-6α,16α,22-triol (15), parmosidone C (34),

parmoether B (32), montagnetol F (48) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế

bào ung thư và được xác định giá trị IC50 Kết quả IC50 cho thấy chỉ có hợp chất 32 cho hoạt

tính trung bình đối với NCI-H460, MCF-7 và HepG2

6 Bố cục luận án

Luận án gồm 117 trang trong đó có 19 bảng và 43 hình

Luận án bao gồm các phần sau:

Chương 1: Tổng quan (23 trang)

Chương 2: Thực nghiệm (14 trang)

Chương 3: Kết quả và thảo luận (61 trang)

Chương 4: Kết luận và kiến nghị (8 trang)

Danh mục các công trình liên quan luận án (1 trang)

Tài liệu tham khảo, đã sử dụng 75 tài liệu liên quan (7 trang)

Các phụ lục phổ (261 phổ, trình bày trong 147 trang)

Hỗn hợp 5+6+7

H0.1.4.1 (695,8 mg)

H0.1.4.2 (119,5 mg)

Địa y Parmotrema sancti-angelii (950,0 g bột)

Lichen Parmotrema plantạiilobtạium (350 g dry thallus)

C 100%

CC/A

C 100%

Hệ dung môi A Hexan: ethyl acetat: acid acetic 9:1:0.5

Hệ dung môi B Hexan: ethyl acetat : methanol 7:3:0.02

Hệ dung môi C Hexan: ethyl acetat : methanol 7:3:0.4

pTLC/C

CC/A

CC H:A 9:1

pTLC C:M 100:4

Bột không tan

P (30,0 g)

5

Chiết pha rắn, giải ly với petroleum ether - ethyl acetat

C 18 -Rp Sắc ký cột pha đảo C18

Địa y Parmotrema planatilobatum (350 g bột)

P6.2 (2,5 g)

Địa y Parmotrema tsavoense (1350 g bột)

Rửa bằng aceton

CC/H:A 9:1-0:10

Hệ dung môi A H:EA:AcOH 9:1:0.02

Hệ dung môi B C:EA:AcOH 85:15:0.02

Hệ dung môi C C:EA:AcOH 75:25:0.02

Hệ dung môi D C:M 88:12

Hệ dung môi E C:M 70:30

Hệ dung môi F C:EA 5:0.04

Hệ dung môi G H:C:EA 1:1:1

M (80,1 g)

EA1.2.2 (3,4 g)

EA2.1.1 (8,0 g)

EA2.1.2 (2,5 g)

Địa y Roccella sinensis (1.700 g bột)

Cao methanol thô (450 g)

CC/H:A 9:1-0:10

CC/H:A:AcOH 9:1:0.02-0:10:0.02 CC/H:A:AcOH 9:1:0.02-0:10:0.02 CC/H:A:AcOH 7:3:0.02-0:10:0.02

CC/A pTLC/A

49 (7,8 mg)

pTLC/C CC/B

39 (6,1 mg)

Hệ dung môi A H:EA:AcOH 9:1:0.05

Hệ dung môi B C:EA:Ac 9:1:3

Hệ dung môi C C:EA:Ac:AcOH 9:1:3:0.02

Hệ dung môi D H:EA:AcOH 7:3:0.02

Hệ dung môi E H:EC:A 1:1:1

Sơ đồ 4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ địa y từ Roccella sinensis

EA2.1.3 (10,2 g)

CC/D pTLC/E

EA4.1.1-3 (8,1 g)

EA4.1.4 (6,4 g)

Methanol

EA1.3 (1,1 g) EA1.1 (2,8 g)

CC/B

EA2.1 (22,1 g) EA2.2 (33,9 g) EA1.2 (15,1 g)

CC/A

EA1.1.3 (1,2 g)

Ghi chú:

EA: ethyl acetat Ac: aceton C: chloroform M: methanol W: nước

8

II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Phần tổng quan của luận án trình bày về:

 Định nghĩa, ứng dụng, hoạt tính sinh học và sinh tổng hợp của các hợp chất địa y

 Tổng kết các công trình nghiên cứu ở trong nước cũng như trên thế giới về hóa học và

hoạt tính sinh học của các loài địa y thuộc chi Parmotrema và chi Roccella

2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc tế bào kháng lại 4 dòng tế bào ung thư (Hela, MCF-7, HepG2 và H460) của các mẫu là các hợp chất tinh sạch được thực hiện ở nồng độ 100 µg/mL, sử dụng chất nhuộm Sulforhodamine B (SRB) và chất chứng dương là camptothecin

NCI-Mẫu được gửi thử nghiệm tại Bộ môn Di truyền Khoa Sinh Trường Đại học Khoa Học

Tự Nhiên 227 đường Nguyễn Văn Cừ Quận 5, TP Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập

Từ bốn loài địa y khảo sát như trình bày trong chương 2, chúng tôi đã cô lập được 49 hợp chất, trong đó có 15 hợp chất mới

Cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu phổ nghiệm IR, MS, 1D và 2D–NMR, đo năng lực triền quang và nhiệt độ nóng chảy, kết hợp so sánh với số liệu trong tài liệu tham khảo, đã được trình bày chi tiết trong quyển luận

án

9

Các hợp chất được phân loại theo 8 nhóm được trình bày trong bảng 3.1

Quyển tóm tắt luận án chỉ trình bày khảo sát cấu trúc hóa học của một vài hợp chất thuộc các khung sườn depsidone, diphenyl ether và dẫn xuất erythritol

tại δ 4.49 (2H, s) và hai nhóm methyl tại δ 2.41 và 2.62 (mỗi nhóm 3H, s) Phổ 13C NMR và

HSQC của 38 (Bảng 3.3) cho thấy sự hiện diện của 18 carbon bao gồm một nhóm formyl (192.2), hai nhóm carbonyl ( 170.6 và 162.2), 12 carbon nhân thơm, trong đó có 5 carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng 164111 ppm, một carbon oxymethylene tại  52.5 và hai nhóm methyl tại  21.4 và 14.2 Trong phổ HMBC (Hình 3.5), proton aldehyde tại 

10.61 cho tương quan với các carbon tại  111.6 (C-3), 116.7 (C-5), 164.1 (C-4) Tín hiệu proton nhân thơm ( 6.78, H-5) cho tương quan với các carbon tại  111.6 (C-3), 164.1 (C-4) và với nhóm methyl (C-9) và đồng thời các proton này ( 2.41, H3-9), cũng có tương quan với các carbon tại  116.7 (C-5), 112.5 (C-1), và 151.9 (C-6) Vì thế, vòng A của 38

được xác định là 3-formyl-4-hydroxy-6-methyl-2-O-aryl-1-carbonyl

Trong vòng B, phổ HMBC của 38 cho thấy sự tương quan của proton của nhóm

oxymethylene tại  4.49 (H2-8') với các carbon tại  117.5 (C-3'), 143.8 (C-4'), 162.2 (C-2')

10

và của proton của nhóm methyl thứ hai tại ( 2.62, H3-9') với các carbon tại  115.6 (C-1'), 131.6 (C-5'), 139.6 (C-6'), 162.2 (C-2'), và 170.6 (C-7') Hai tương quan 4J của H3-9' giúp xác định vị trí lân cận giữa nhóm methyl và nhóm carboxyl trên vòng B Vì thế, vòng B của

38 được xác định là 2',4',5'-trihydroxy-3'-hydroxymethylene-6'-methyl-1'-carbonyl

Trong quá trình xác định cấu trúc của 38, chúng tôi nhận thấy dữ liệu phổ của 38 có sự

tương đồng với dữ liệu phổ của acid protocetraric (Brandao L F G et al., 2013 [10]) Tuy nhiên, sự so sánh chi tiết dữ liệu phổ 13C NMR của 38 và acid protocetraric cho thấy có sự

khác nhau của những tín hiệu thuộc vòng B giữa chúng, cụ thể với các carbon C-2' (C = +7.8), C-5' (C = 10.3), và C-6' (C = +10.3) mặc dù chúng được đo trong cùng dung

môi DMSO-d6 Sự thay đổi về dữ liệu phổ 13C có thể xuất phát từ sự thay đổi vị trí của các nhóm thế trên nhân thơm B Kết hợp tất cả các dữ liệu phổ MS, 1D và 2D-NMR giúp xác

định trên nhân B của 38, nhóm methyl đã tráo đổi vị trí với nhóm hydroxymethylene Ngoài

ra, từ sự phân tích về sự lân cận của nhóm methyl và nhóm carboxyl giúp xác định nhóm carboxyl cũng đã tráo đổi vị trí với nhóm hydroxyl, khi so sánh với acid protocetraric, một

para-depsidone đã biết Như vậy, 38 được đề nghị là một meta-depsidone, được đặt tên là

parmosidone A, với công thức được trình bày trong hình 3.5

Hình 3.5: Một số tương quan HMBC của 31, 37, và 38

12

Parmoether A (33)

Hợp chất 33 được cô lập dưới dạng vô định hình, màu trắng Phổ HR-ESI-MS giúp xác

định công thức phân tử của 33 là C28H28O11, trong đó có ít hơn một nguyên tử oxygen và có

nhiều hơn 4 nguyên tử hydrogen khi so sánh với 34

Phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC của 33 cho thấy sự hiện diện của 15 tín hiệu

singlet, bao gồm một nhóm aldehyde (δ 10.31), hai proton nhân thơm (δ 6.55 và 6.11), hai nhóm methoxy (δ 3.06 và 3.78), một nhóm methylene (δ 3.78), bốn nhóm methyl (δ 2.35, 2.08, 1.98, và 1.89), và năm nhóm hydroxy (δ 11.94, 9.89, 9.62, 9.23 và 8.82) Phổ 13C-

NMR cho thấy sự hiện diện của 28 carbon bao gồm một nhóm aldehyde (δ 194.4), hai nhóm carboxyl ester (δ 170.6 và 165.4), 18 carbon nhân thơm cộng hưởng trong vùng 162-107 ppm, trong đó có hai nhóm methine tại δ 111.7, và 107.3 Ở vùng từ trường cao, phổ 13C-

NMR còn cho thấy hai nhóm methoxy (δ 51.6 và 51.3), một nhóm methylene (δ 20.4), và bốn nhóm methyl (δ 19.9, 17.5, 16.1 và 8.9)

So sánh dữ liệu phổ NMR và MS giữa 33 và 34 cho thấy 33 cũng chứa ba nhân thơm

nhưng mất đi một carbon carboxyl và chứa nhiều hơn một nhóm methoxy và một nhóm methine nhân thơm Trên vòng A, phổ HMBC (Hình 3.8) cho thấy sự tương quan của H-5

tại δ 6.55 với các carbon tại δ 113.7 (C-1), 109.7 (C-3), 162.3 (C-4), và 19.9 (C-9); của H3-9

tại δ 2.08 với C-1, C-2, và C-3, và của nhóm aldehyde tại δ 10.31 (H-8) và 4-OH tại δ 11.94

với C-3, C-4, và C-5 Những tương quan này giúp xác định hợp chất 33 phải sở hữu đặc điểm cấu trúc vòng A tương tự như atranorin (2), hay vòng A của các hợp chất 29, 31, 37,

và 38 Tuy nhiên, những khác biệt rõ rệt trong độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của proton thơm (H-5), proton aldehyde (H-8), và proton nhóm methyl (H3-9) của 33 khi so sánh với những nhóm thế tương tự trong các hợp chất 29, 31, 37, và 38 mặc dù chúng được đo trong

cùng dung môi DMSO-d6 (Bảng 3.5), như vậy có sự thay đổi trong khung sườn của vòng A của 33 và những dẫn chứng trên còn chứng tỏ 33 không phải là một depsidone Cụ thể, vòng lactone bảy cạnh như trong các hợp chất 29, 31, 37, và 38 đã bị mở vòng để thành nhóm

methoxycarbonyl gắn tại C-1 của nhân A và nhóm hydroxyl gắn tại C-4' của nhân B Hơn nữa các đặc điểm cấu trúc này được xác định bởi tương quan HMBC của nhóm methoxy tại

δ 3.06 với carbon carboxyl tại δ 165.4 Vì thế, 33 phải có cấu trúc của một diphenyl ether

7-OCH 3 3.08 (3H, s) 51.3 3.28 (3H, s) 51.9 3.23 (3H, s) 52.2 7''-OCH 3 3.77 (3H, s) 51.6 3.94 (3H, s) 52.7 12.03 (1H, s)

Sự so sánh dữ liệu NMR của 33 và 34 cho thấy vòng C của 33 có thể là một dẫn xuất

của methyl -orsellinate Hơn nữa, đặc điểm cấu trúc này được tái xác định bởi phổ HMBC

của 33 (Hình 3.8) với tương quan của nhóm H3-8'' tại δ 1.98 với các carbon tại δ 109.0

(C-3''), 154.2 (C-2''), và 156.1 (C-4''); của H3-9'' tại δ 2.35 với các carbon tại δ 111.7 (C-1''),

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của 25, 32, và 33

Phổ NMR được ghi ở a 400 MHz, b 500 MHz

14

118.0 (C-5''), và 134.5 (C-6''); của 2''-OH tại δ 9.62 với các carbon tại δ 111.7 (C-1''), 154.2 (C-2''), và 109.0 (C-3'') và của nhóm methoxy tại δ 3.78 (7''-OCH3) với carbon carboxyl tại

δ 170.6 Như vậy, vòng A và C của 33 được xác định Vì thế, khi so sánh với hợp chất 34,

sự biến mất của một carbon carboxyl và đồng thời với sự xuất hiện của một nhóm methine

thơm của 33 tại vòng B đã giúp suy ra sự thay thế nhóm carbonyl bằng nhóm methine trong

33 Trên vòng B, tương quan HMBC của H-1' tại δ 6.11 với các carbon tại δ 151.9 (C-2'),

134.0 (C-5'), 112.1 (C-3'), và 16.1 (C-8') và của H3-8' tại δ 1.89 với các carbon tại δ 107.3

(C-1'), 128.4 (C-6'), và 134.0 (C-5') Ngoài ra, tương quan NOESY giúp xác định sự lân cận giữa H-1' và H3-8' Proton của H2-7' tại δ 3.78 cho tương quan HMBC với các carbon tại δ 112.1 (C-3'), 148.0 (C-4'), và 151.9 (C-2') trên vòng B, và với các carbon tại δ 118.0 (C-5''),

134.5 (C-6''), 156.1 (C-4'') của vòng C Vì thế, vòng C phải kết nối với vòng B thông qua carbon nhóm methylene (C-7')

Dựa vào đặc điểm trên, cấu trúc phù hợp nhất của 33 là dẫn xuất ether xuất phát từ acid

furfuric (một para-depsidone) (Cấu trúc 33x, Hình 3.8) hay dẫn xuất của parmosidone C (một meta-depsidone) (cấu trúc 33y, Hình 3.8) May mắn thay, tương quan HMBC của hai

nhóm hydroxyl tại δ 9.89 (2'-OH) và 9.23 (4'-OH) cũng như của nhóm methylene tại δ 3.78

(H2-7') với cùng carbon tại δ 112.1 (C-3') giúp xác định cấu trúc của 33 là dẫn xuất của acid

furfuric với vòng bảy cạnh bị mở và với sự mất đi của một nhóm carboxyl trên nhân B Như vậy, cấu trúc hoá học của 33 được xác định như trình bày trong hình 3.8 và được đặt tên là

parmoether A

Hình 3.8: Một số tương quan HMBC và NOESY của 25, 32, và 33

15

Montagnetol A (41) Hợp chất 41 được cô lập dưới dạng bột màu trắng Công thức phân tử được xác định là

C12H14O6, dựa trên phổ HR-ESI-MS (tại m/z 277.0739 [M-H]-, với tính toán 277.0688), chứa 6 độ bất bão hòa Phổ 1H NMR kết hợp với phổ 13C và HSQC cho thấy sự hiện diện của một nhóm methyl H3-8' (δH 2.50, δC 24.2) và hai nhóm methine ghép meta với nhau, CH-3' (δH 6.23, d, 2.0 Hz; δC 101.6) và CH-5’ (δH 6.27, d, 2.0 Hz; δC 112.3), tương ứng cho một đơn vị orsellinyl (C8H7O4) và những tín hiệu của một đơn vị butanetetraol, bao gồm hai

nhóm methylene sp3 mang oxygen, CH2-1 (δH 4.10, dd, 10.0, 5.5 Hz, H-1a; δH 3.94, dd, 10.0, 4.0 Hz, H-1b; δC 72.7) và CH2-4 (δH 4.00, dd, 9.0, 6.0 Hz, H-4a; δH 3.70, dd, 9.0, 6.0

Hz, H-4b; δC 75.4) và hai nhóm methine sp3 mang oxygen, CH-2 (δH 5.45, m; δC 70.9) và

CH-3 (δH 4.59, m; δC 71.0) Những đặc điểm cấu trúc này tương đồng với dữ liệu của hợp

chất D-(+)-montagnetol (43) Độ dịch chuyển hóa học của H-2 (5.45, m) dời về vùng từ

trường thấp giúp xác định đơn vị orsellinyl tại C-2, và được tái xác định nhờ tương quan

HMBC của H-2 với C-7' Kết hợp với công thức phân tử, 41 sở hữu nhiều hơn một độ bất bão hòa so với 43 và cùng với việc mất đi một đơn vị H2O giúp xác định sự đóng vòng giữa

hai nhóm hydroxyl tạo thành ether trong 41 khi so sánh với 43 Ngoài ra, proton H-1 cho tương quan HMBC với C-4 và ngược lại, củng cố khung sườn tetrahydrofuran của 41

Trong trường hợp của 41, hằng số ghép cũng như tương quan NOESY không đủ tin cậy

để xác định hóa lập thể của 41, vì thế, những ảnh hưởng của nhóm thế trên cyclopentane

(Edwards D M., 1992)[22] được vận dụng để xác định hóa lập thể của 41 Về nguyên tắc,

các proton không tương đương diastereotopic của nhóm methylene sở hữu độ dịch chuyển hóa học 1H khác nhau Cụ thể hơn, một proton vị trí cis với một nhóm thế sẽ chuyển dịch về vùng từ trường cao hơn so với khi nó ở tương quan cis với một proton khác Trong trường

Hình 3.14: Một số tương quan HMBC, NOESY của 41