Khảo sát thành phần hóa học của lá sen được thu hái ở huyện điện bàn, tỉnh quảng nam

MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu về cây sen 4 1.2. Các hợp chất hóa học chính có trong lá sen 5 1.3. Một số ứng dụng của lá sen trong y học dân gian 10 1.4. Tình hình nghiên cứu các loài sen trên thế giới 11 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên liệu, dụng cụ và hóa chất 13 2.1.1. Nguyên liệu 13 2.1.2. Xử lí nguyên liệu 13 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất. 13 2.2. Xác định chỉ số hóa lí 14 2.2.1. Các phương pháp xử lí mẫu 14 2.2.2. Xác định độ ẩm 15 2.2.3. Xác định hàm lượng hữu cơ tổng bằng phương pháp tro hóa mẫu 15 2.2.4. Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp 16 thụ nguyên tử AAS 2.3. Phương pháp ngâm chiết 17 2.4. Phương pháp sắc kí lỏng – khối phổ 18 2.4.1. Sắc kí lỏng (LCLiquid Chromatography) 18 2.4.2. Khối phổ (MSmass spectrometry) 18 2.4.3. Sắc kí lỏng ghép khối phổ (LCMSliquid chromatography mass spectrometry) 19 2.5. Phương pháp sắc kí khí – khối phổ 19 2.5.1. Sắc ký khí (GC Gas Chromatography) 20 2.5.2. Sắc kí khí ghép khối phổ (GCMS_Gas Chromatography Mass Spectometry) 20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1. Quy trình nghiên cứu 22 3.2. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của lá sen 23 3.2.1. Độ ẩm 23 3.2.2. Hàm lượng hữu cơ 24 3.3. Xác định hàm lượng kim loại có trong lá sen bằng phương pháp 26 quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 3.4. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của các dịch chiết lá sen 28 3.4.1. Thành phần hóa học của dịch chiết lá sen trong nhexane 28 3.4.2. Thành phần hóa học của dịch chiết lá sen trong ethyl acetate 34 3.4.3. Thành phần hóa học của dịch chiết lá sen trong methanol 38 3.5. Hiệu suất chiết 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Đà Nẵng - 2012

TRƯỜNG ĐHSP Đôc lập – Tự do – Hạnh phúc

***

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Văn Quốc Hoàng

Lớp: 08SHH

1 Tên đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của lá sen đƣợc thu hái ở huyện Điện

Bàn, tỉnh Quảng Nam”

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị:

- Nguyên liệu: lá sen được lấy ở huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam

- Dụng cụ và thiết bị: Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy đo sắc kí

lỏng kết hợp khối phổ LC-MS, máy đo sắc kí khí kết hợp khối phổ GC-MS

Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc sứ, bình định mức, giấy lọc

3 Nội dung nghiên cứu: khảo sát thành phần hóa học lá sen với các dung môi hexane, ethyl acetate, methanol

n-4 Giáo viên hướng dẫn: Ths Giang Thị Kim Liên

5 Ngày giao đề tài: 01/08/2011

6 Ngày hoàn thành: 20/05/2012

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho khoa ngày tháng năm 2012

Kết quả đánh giá:

Ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ

để em hoàn thành bài luận văn này

Em xin cám ơn Cô Giang Thị Kim Liên là người trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình nghiên cứu đề tài

Em xin chân thành cám ơn thầy cô quản lý phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện cho em về phòng thí nghiệm, dụng cụ trong quá trình làm thực nghiệm

Em mong muốn tiếp tục nhận được sự giúp đỡ của cô Giang Thị Kim Liên cùng các thầy cô trong khoa trong quá trình học tập và nghiên cứu sau này

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2012 Sinh viên thực hiện

Văn Quốc Hoàng

MỤC LỤC

Trang

1.2 Các hợp chất hóa học chính có trong lá sen 5 1.3 Một số ứng dụng của lá sen trong y học dân gian 10 1.4 Tình hình nghiên cứu các loài sen trên thế giới 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.4.1 Sắc kí lỏng (LC-Liquid Chromatography) 18

2.4.3 Sắc kí lỏng ghép khối phổ (LC/MS-liquid chromatography

(GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) 20

3.2 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của lá sen 23

3.3 Xác định hàm lượng kim loại có trong lá sen bằng phương pháp 26 quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

3.4 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của các dịch chiết lá sen 28 3.4.1 Thành phần hóa học của dịch chiết lá sen trong n-hexane 28 3.4.2 Thành phần hóa học của dịch chiết lá sen trong ethyl acetate 34 3.4.3 Thành phần hóa học của dịch chiết lá sen trong methanol 38

LSH Dịch chiết của lá sen trong n-hexane

LSE Dịch chiết của lá sen trong ethyl acetate

LSM Dịch chiết của lá sen trong methanol

TR Thời gian lưu

CTPT Công thức phân tử

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 17

Hình 3.2 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 26 Hình 3.3 Sắc kí đồ của dịch chiết lá sen trong dung môi n-hexan 27

Hình 3.10 Sắc kí đồ của dịch chiết lá sen trong etyl axetat 33

Hình 3.12 Sắc kí đồ của dịch chiết lá sen trong methanol 37 Hình 3.13 Dịch chiết lá sen với các dung môi n-hexane,

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.4 Thành phần hóa học của dịch chiết với dung môi n-hexane 28 Bảng 3.5 Thành phần hóa học của dịch chiết với dung môi ethyl acetate 34 Bảng 3.6 Thành phần hóa học của dịch chiết với dung môi methanol 38

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Sen là một loài cây đã quá quen thuộc với con người Việt Nam Sen còn là biểu

tượng về tinh thần của dân tộc Việt : “Gần bùn mà chẳng hôi tanh mùi bùn”

Cây sen thuộc loài Nelumbo nucifera Gaertn, ngành Ngọc Lan (magno

liophyta), lớp Ngọc Lan (magno liopsida), phân lớp Sen (Nelumbonidae), bộ Sen (Nelumbonales), họ Sen (nelumbonaceae), chi Nelumbo Adans

Ngoài ra còn có tên khác như: Liên, Ngậu (Tày)

Tên khoa học: Nelumbo nuciferagaertn

Tên nước ngoài: sacred lotus, chinese water-lily, Indian lotus, Egypian bean Không chỉ có vẻ đẹp, hương thơm mà sen còn có nhiều công dụng, tác dụng quý báu Hải Thượng Lãn Ông đã viết về cây sen như sau: “cây sen mọc dưới bùn đen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của đất trời; nên củ, lá, hoa, tua,

vỏ, quả, ruột đều là thuốc hay” Nhưng từ trước đến nay, người ta chỉ chú ý đến sử dụng hạt sen (liên nhục) để nấu chè, tâm sen (liên tâm) làm thuốc an thần, tua sen (liên tu) dùng ướp chè, ngó sen (liên ngẫu) làm thực phẩm Còn lá sen chỉ được dùng để gói thức ăn, ít người nghĩ rằng lá sen có nhiều tác dụng quý để chữa bệnh

Ngày nay, nhờ công nghệ hiện đại, các nhà khoa học đã phát hiện ra một chất đặc biệt của cây sen, chất nuciferine có tác dụng chống viêm, giảm đau, trị béo phì, hạ cholesterol trong máu và hoạt tính chống lại serotonin Lá sen chứa nhiều nuciferine nhất Nuciferine chiết ra từ lá sen có công dụng kéo dài giấc ngủ Ngoài ra, lá sen còn chứa nhiều vitamin C, alkaloid tác dụng an thần mạnh hơn tâm sen

Về hóa học, lá sen chứa 0,2-0,3% tanin, 0,77-0,84% alkaloid trong đó có nuciferine, nor-nuciferine, roemerine, anonain, liriodenin, pro-nuciferine, O-nor-nuciferine, armeparin, N-nor-amepavin, metyl-coclaurin, nepherin, dehydro roemerine, dehydro nuciferine, dehydro anonain, N-metyl lisococlaurin, Trong đó, nuciferine là alkaloid chính [1]

Về dược lý, lá sen được nghiên cứu có tác dụng an thần, chống co thắt cơ trơn, chống thoáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, từ lâu đã được y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa bệnh Về sau này khi bệnh béo phì trở nên phổ biến, thì lá sen được sử dụng rất hiệu quả để chống lại căn bệnh này

Chính vì những lý do trên, tôi đã chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học của lá sen được thu hái ở huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam” làm đề tài khoá luận tốt nghiệp cử nhân sư phạm Hoá học của mình

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá sen và khảo sát thành phần hoá học của các dịch chiết từ lá sen với các dung môi khác nhau

3 Đối tượng nghiên cứu

Lá sen được lấy từ huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Dịch chiết lá sen bằng các dung môi n-hexane, ethyl acetate, methanol

4 Các phương pháp nghiên cứu

- Xác định hàm lượng hữu cơ bằng phương pháp tro hóa mẫu khô ướt kết hợp

- Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ nguyên

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Cung cấp thêm thông tin khoa học về lá sen tạo cơ sở nghiên cứu cho các đề tài liên quan đến lá sen, ứng dụng của lá sen trong lĩnh vực y học

6 Bố cục của đề tài

Luận văn gồm 44 trang trong đó có 7 bảng và 11 hình Phần mở đầu (3 trang), kết luận và kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (2 trang), và phụ lục (8 trang)

Nội dung luận văn gồm 3 chương:

Chương 1- Tổng quan tài liệu (9 trang)

Chương 2- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (9 trang) Chương 3- Kết quả và thảo luận ( 19 trang)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây sen

Sen gọi theo tiếng địa phương là liên, ngậu

Danh pháp khoa học : Nelumbo nucifera Gaertn

Họ (familia) : Sen (Nelumbonaceae)

Chi (genus) : Nelumbo Adans

Loài (species) : Nelumbo nucifera Gaertn

Mô tả cây: sen là một loại cậy mọc ở dưới nước, sống dai nhờ thân rễ Ngó

sen màu trắng, tiết diện gần tròn Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi

trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong có nhiều khuyết rộng Lá hình lọng có 2

thùy sâu đối xứng nhau, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng, mặt dưới xanh nhạt, nhám

Cuống lá màu xanh, hình trụ, có nhiều gai Hoa to, màu hồng hay trắng Cuống hoa

màu xanh, dài già chuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn Cuống lá và cuống hoa có

nhiều khoang rỗng bên trong Đế hoa rất lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp,

non màu vàng, già màu xanh Quả màu xanh, nhẵn, hình bầu dục Hạt màu trắng 2 lá

mầm dày mập màu trắng , bên trong có tâm sen màu xanh Tâm sen gồm rễ mầm, thân

mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên

Hình 1.1 Lá sen Hình 1.2 Hoa sen

Hình 1.3 Nhị sen

Hình 1.4 Quả sen Hình 1.5 Hạt sen

Phân bố: Chi Nelumbo Adans phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Mỹ

Mùa hoa: tháng 5-6, mùa quả: tháng 7-9

1.2 Các hợp chất hóa học chính có trong lá sen

Theo Giáo sư Tiến sĩ Đỗ Tất Lợi thì trong lá sen-hà diệp có nhiều alkaloid, trong đó nuciferine là alkaloid chính [1]

+ nuciferine:

- Công thức phân tử: C19H21O2N

- Khối lượng phân tử: 295

- Tên IUPAC dibenzo[de,g]quinoline

:(6aR)-1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H Công thức cấu tạo

+ N- nornuxiferin:

- Công thức phân tử: C18H19O2N

- Khối lượng phân tử: 281

- Công thức cấu tạo:

N H O

-Tên IUPAC:(7ar)-6,7,7a,8-tetrahydro-5h-[1,3]benzodioxolo[6,5,4-de] benzo[g]quinoline

- Công thức cấu tạo:

N H O

- Khối lượng phân tử: 279

-Tên IUPAC:

[7aR,(-)]-6,7,7a,8-Tetrahydro-7-methyl-5H-benzo[g]-1,3benzodioxolo[6,5,4-de]quinoline

- Công thức cấu tạo:

N CH3

O O

C

H2

+ armepavin

- Công thức phân tử: C19H23O3N

- Khối lượng phân tử: 313

-Tên IUPAC

:4-[[(1R)-1,2,3,4-Tetrahydro-6,7-dimethoxy-2-methyl-1-isoquinolinyl]methyl]phenol

- Công thức cấu tạo:

N CH3O

- Khối lượng phân tử: 299

-Tên IUPAC dihydro-1H-isoquinolin-7-ol

:(1S)-1-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-6-methoxyl-2-methyl-3,4 Công thức cấu tạo:

N CH3O

- Khối lượng phân tử: 287

- Công thức cấu tạo:

N CH3O

O H

H3C

+ pronuxiferin

- Công thức phân tử: C19H21O3N

- Khối lượng phân tử: 311

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 275

- Tên IUPAC: 8H-Benzo[G]-1,3-benzodioxolo[6,5,4-de]quinolin-8-one

- Công thức cấu tạo:

O

NO

O

Ngoài ra còn có một số hợp chất khác: vitamin C, axit xitric, axit tartric, axit oxalic…

1.3 Một số ứng dụng của lá sen trong y học dân gian

Theo đông y lá sen có vị đắng tính bình, vào 3 kinh can, tỳ và vị Có tác dụng thăng thanh tán ứ, thanh thử hành thủy Dùng chữa thử thấp tiết tả, thủy chí phù thủng, lôi đầu phong, nôn ra máu, máu cam, băng trung huyết lỵ [18]

Một số bài thuốc nam có sử dụng lá sen:

- Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc hoặc hãm uống

- Chữa tăng huyết áp: Đẳng sâm 6g, bán hạ 10g, tuyền phúc hoa 10g, thiên ma 6g, lá sen 10g, trần bì 6g, thạch quyết minh 10g, uống ngày 1 thang chia hai lần sớm, tối Dùng cho người cao huyết áp, mắt hoa tai ù, mơ nhiều mất ngủ

- Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40g để sống, rau má 12g sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày

- Chữa chảy máu não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp:

Lá sen 15g, cam thảo 15g, đỗ trọng 12g; sinh địa, mạch môn, tang ký sinh, bạch thược mỗi vị 10g Sắc uống ngày một thang

- Chữa chảy máu cam: Lá sen 15g, hoàng liên 2g, thanh hao 6g, lá tre 10g, mộc thông 10g, đan bì 10g, liên kiều 5g, hoàng cầm 3g, sơn chi 6g, rễ cỏ tranh 10g Sắc uống ngày 1 thang Dùng cho người bị đổ máu cam, lượng nhiều, máu đỏ tươi hoặc sẫm, mũi khịt khô, miệng hôi, đại tiện táo, tiểu dắt

- Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao cho thơm 30g tán nhỏ, uống với nước hoặc sắc với 200ml nước còn 50ml, uống một lần trong ngày

- Chữa di tinh: Lá sen nghiền bột mịn (1kg) Uống ngày 2 lần sớm, tối với nước sôi, mỗi lần 5g

- Chữa váng đầu: Hạch đào nhân 6g, lá sen 10g, đỗ trọng tươi 10g Hạch đào nhân sao vàng giã nát, sắc chung với lá sen, đỗ trọng, bỏ bã lấy nước uống Dùng cho người đầu váng, mắt hoa, tai ù, tai điếc

- Chữa tiêu chảy mãn tính: Gồm liên nhục 12 g, đẳng sâm 12g, hoàng liên 5g

Các vị sắc uống hoặc tán bột uống mỗi ngày 10g

- Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40g, rau má 30g, hạt

mã đề 20g, sắc uống ngày một thang Nếu xuất huyết nhiều có thể tăng liều của lá và ngó sen lên 60g

- Chữa béo phì, hạ cholesterol trong máu: Đây là công dụng mới được phát hiện của lá sen Trên thị trường hiện có bán nhiều loại trà giảm béo có lá sen, song có thể tự dùng bằng cách nấu lá sen tươi uống thay nước hàng ngày, mỗi ngày 1 lá

1.4 Tình hình nghiên cứu các loài sen trên thế giới và tại Việt Nam

Theo nghiên cứu của Lin HY, Kuo YH, Lin YL, và Chiang W, dịch chiết từ lá

sen của loài Nelumbo nucifera có khả năng chống oxy hóa Trong đó, dịch chiết của lá

sen với hệ dung môi: ethyl acetate – methanol và hệ dung môi: methanol – n-butanol

có tác dụng chống oxy hóa cao hơn hệ dung môi: methanol – nước nghiên cứu còn phân lập được bảy flavonoid bằng sắc kí cột Các hợp chất này được xác định là catechin, quercetin, quercetin-3-O-glucopyranoside, quercetin-3-O-glucuronide, quercetin-3-O-galactopyranoside, kaempferol-3-O-glucopyranoside và myricetin-3-Oglucopyranoside Trong đó quercetin, quercetin-3-O-galactopyranoside và myricetin-3-Oglucopyranoside có tác dụng ức chế mạnh quá trình oxy hóa Kết quả cho thấy, khả năng chống oxy hóa của lá sen được giải thích bởi các flavonoid [11]

Theo nghiên cứu của Huang CF, Chen YW, Yang CY, Lin HY, Way

TD, Chiang W và Liu SH, dịch chiết từ lá sen của loài Nelumbo nucifera có khả

năng điều chỉnh nồng độ đường trong máu ở những con chuột bình thường và chuột mắc bệnh tiểu đường Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất catechin trong dịch chiết lá sen làm quá trình sản sinh ra insulin được nhanh hơn đồng thời làm giảm khả năng hấp thụ glucose ở chuột mắc bệnh tiểu đường Dịch chiết của lá sen mở ra một hướng nghiên cứu cho việc kiểm soát tăng đường huyết ở người mắc bệnh tiểu đường mà không phụ thuộc vào insulin [10]

Theo nghiên cứu của Ohkoshi E,Miyazaki H,K Shindo,Watanabe

H,Yoshida A và Yajima H; lá của loài sen Nelumbo nucifera có tác dụng lợi tiểu và

được sử dụng để điều trị bệnh béo phì Dịch chiết từ lá sen với ethanol có tác dụng sản sinh ra lipolysis và các thụ thể beta-adrenergic , đây là các chất có tác dụng trong việc chống béo phì Thí nghiệm được thực hiện bằng cách bổ sung dịch chiết lá sen vào chế

độ ăn uống giàu chất béo của chuột Kết quả cho thấy trọng lượng của chuột đã giảm

đi đáng kể Bằng phương pháp sắc kí , đã xác định được các hợp chất flavonoid gồm: quercetin 3-O-alpha-arabinopyranosyl -beta-galactopyranoside, rutin ,catechin , hyperoside, isoquercitrin, quercetin và astragalin Như vậy, tác dụng của lá sen trong việc ngăn ngừa bệnh béo phì được giải thích bởi các flavonoid khác nhau có trong lá sen có tác dung kích hoạt các beta- adrenergic và lipolysis được tham gia vào quá trình chống béo phì [12]

Theo nghiên cứu của Takefumi Sagara, Naoyoshi Nishibori, Manami Sawaguchi, Takara Hiro, Mari Itoh, Song Her và Kyoji Morita, thì các tế bào thần kinh đệm có tác dụng để duy trì tính toàn vẹn của chức năng não thông qua việc bảo

vệ các tế bào thần kinh chống lại yếu tố độc hại khi sắt tích tụ trong mô não Do đó, việc bảo vệ các tế bào thần kinh đệm có ý nghĩa đối với phòng chống bệnh thoái

hóa thần kinh Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ gốc sen (thân rễ của Nelumbo

nucifera) với nước có tác dụng bảo vệ các tế bào thần kinh đệm chống lại các tế bào

đôc hại Điều này được giải thích bởi hợp chất polyphenolic có trong rễ sen, có tác dụng chống oxy hóa mạnh Trên thực tế, chiết xuất rễ sen ngăn chặn sắt gây ra quá trình oxy hóa, nhưng không làm thiếu oxy đến các tế bào [13]

Như vậy, hoạt tính dược lý của cây sen đã được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên các công trình về thành phần hóa học của cây sen hầu như vẫn còn rất ít Đặc biệt ở Việt Nam sen đã được sử dụng rất nhiều trong y học

CHƯƠNG 2.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dụng cụ và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu được lấy ở huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Trước đây lá sen chủ yếu dùng để gói bánh, nhưng trong những năm gần đây nhiều công trình nghiên cứu cho thấy lá sen còn có thể chữa nhiều chứng bệnh như: chữa mất ngủ, băng huyết, chảy máu cam…

2.1.2 Xử lí nguyên liệu

Nguyên liệu là lá sen tươi, sau khi hái về, rửa sạch phơi khô, xay thành bột

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

* Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có:

- Tủ sấy, lò nung, bếp điện, cân phân tích

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS ( phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng)

- Sắc ký lỏng - khối phổ liên hợp (LC/MS) được thực hiện trên máy Xevo TQ hãng Waters, Mỹ (tại phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện hóa học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội) Hệ dung môi: methanol - nước Tốc độ dòng: 0,25ml/phút Nguồn ion hoá của máy phổ khối: phun mù điện tử

- Sắc ký khí- khối phổ liên hợp (GC/MS) được thực hiện trên máy Agilent 7890A/5975C (tại Trung tâm Đo lường kỹ thuật chất lượng kỹ thuật, số 2, Ngô Quyền, Quận 3, TP Đà Nẵng) Cột sắc ký HP5MS (dài 30m; đường kính trong 0,25mm; lớp phim dày 0,25μm) Khí mang Heli (7 psi), thể tích tiêm 1μl, split 10:1, nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 280o

C Chương trình nhiệt độ lò: nhiệt độ đầu 80oC, giữ ở 0 phút, sau đó tăng lên 290o

C với tốc độ gia nhiệt 10o

C/phút, giữ ở nhiệt độ này trong 20 phút Điều

kiện khối phổ: nguồn ion hoá (EI), năng lượng ion hoá (70eV), nhiệt độ MS source (230oC), nhiệt độ MS Quad (150oC), nhiệt độ giao diện sắc ký khí với detector khối phổ (280oC), chế độ quét Fullscan (Thời gian trễ 0-3 phút; thời gian quét: 3-50 phút, khoảng khối quét: 35-600amu)

- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá tình thí nghiệm gồm có: bình tam giác

100 mL, 250 mL, cốc thủy tinh loại 100 mL, loại 250 mL, pipet, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, giá thí nghiệm, bình đựng mức 10 mL, 10 mL, nhãn hóa chất

* Hóa chất

Các dung môi: n–hexane, ethyl acetate, methanol, nước cất

Hóa chất vô cơ: dung dịch H2SO4 98%, HNO3, các dung dịch chuẩn của các muối: Pb2+

xử lí theo phương pháp khô, phương pháp ướt và phương pháp khô ướt kết hợp [2]

* Xử lí theo phương pháp khô:

Cách này thường dùng và đơn giản nhất, ta không dùng dung môi mà dùng nhiệt

độ để phân hủy mẫu, đem nung mẫu ở 450-5000

C trong chén plantin hay thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi Cần chú ý rằng trong quá trình nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi như các haogen, thủy ngân, lưu huỳnh…Cũng có thể chỉ cần đốt cháy các chất hữu cơ trong bình kín, dưới áp suất cao hoặc khi phân hủy bằng cách nung chảy như đối với các chất vô cơ nhưng phải thêm chất oxi hóa: HNO3, H2O2

Ưu điểm: - Không tốn dung môi

- Tốn ít thời gian hơn so với phương pháp ướt Hạn chế: - Ở nhiệt độ cao nhiều chất bay hơi, ví dụ ở 5000C lượng Pb, Cd

bay hơi xấp xỉ 20% dẫn đến sai số kết quả lớn

Ưu điểm: - Hạn chế được việc bay hơi của các chất trong mâu phân tích, kết

quả phân tích gần với kết quả thực hơn

Hạn chế: - Rất tốn dung môi, dung môi phải tinh khiết

- Hàm lượng phân tích có khi lớn hơn lượng thực dẫn đến hiệu suất thu hồi lớn hơn 100%

* Xử lí theo phương pháp khô ướt kết hợp:

Cho lượng dung môi rất ít vào mẫu, mục đích phá vỡ các liên kết yếu rồi đưa vào lò nung ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ của phương pháp khô

Ưu điểm: - Nung ở nhiệt độ thấp nên hạn chế các chất bay hơi

- Lượng dung môi dùng ít hơn Trong đề tài này, tôi sử dụng phương pháp khô ướt kết hợp để xử lý mẫu

2.2.2 Xác định độ ẩm

Cân chính xác một khối lượng mẫu lá sen tươi cho vào chén sứ đã sấy đến khối lượng không đổi, cho chén sứ đựng mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 60-700C trong thời gian

từ 4-6 tiếng đến khi khối lượng chén và mẫu không đổi để xác định độ ẩm

2.2.3 Xác định hàm lượng hữu cơ tổng bằng phương pháp tro hóa mẫu

Để xác định hàm lượng hữu cơ tổng và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động thực vật người ta dùng phương pháp tro hóa mẫu

Trong đề tài này tôi dùng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp khô ướt kết hợp Mẫu xử lí sơ bộ, có thể phân hủy các chất hữu cơ bằng H2SO4, HNO3…hoặc thêm H2O2, KMnO4 để làm tăng nhanh quá trình phân hủy

Sau đó nung 450-5000C trong chén thạch anh hay platin, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi

2.2.4 Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên

tử AAS

*Nguyên tắc phép đo AAS [2, 4]

Trên cơ sở xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy phổ nguyên tử chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi Và do vậy muốn thực hiện phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các bước sau:

- Hóa hơi mẫu phân tích đưa về trạng thái khí Mục đích của quá trình này là tạo

ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích Có thể nguyên tử hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc kỹ thuật nguyện tử hóa không ngọn lửa Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến phép đo AAS

- Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tố cần phân tích, chiếu chùm tia sáng đơn sắc đó vào đám hơi của nguyên tố cần phân tích

- Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi qua môi trường hấp thụ, phân li chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích vào khe đó để đo cường độ của chúng

- Ghi nhận tín hiệu và đo kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết

bị thích hợp

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

* Nguồn đơn sắc

Là nguồn phát ra chùm bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần phân tích, nguồn này

sẽ chiếu vào đám hơi nguyên tử tự do và nó phải thỏa mãn các điều kiện sau:

- Nguồn phát ra tia bức xạ đơn sắc phải tạo ra các tia bức xạ nhạy của nguyên tố cần phân tích Chùm tia phát xạ phải có cường độ ổn định, lặp lại được nhiều lần đo khác nhau trong cùng một điều kiện và phải điều chỉnh được để có cường độ cần thiết cho mỗi phép đo

- Phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch nhạy của nguyên tố cần phân tích, phổ nền của nó không đáng kể

- Phải có cường độ cao nhưng bền với thời gian

* Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích

Bộ phận nguyên tử hóa mẫu chuyển mẫu cần phân tích từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi của nguyên tử tự do dưới tác dụng của nhiệt độ Đám hơi của các nguyên tử tự do này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên

tử

2.3 Phương pháp ngâm chiết

Phương pháp hoá học dùng để tách một hoặc nhiều cấu tử ra khỏi một hỗn hợp bằng cách ngâm hỗn hợp vào một dung môi thích hợp để hoà tan cấu tử định tách trước khi chiết Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong hoá dược để tách các hoạt chất

Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng,trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hoá học lập thể

Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị) Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector

Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa

(mass spectrometry) Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng, do đó chúng bị vỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ Những mảnh vụn thực tế là các ion, tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi vào đầu

dò detector

Về việc phân tích kết quả máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét Trục hoành biểu diễn tỉ lệ M/Z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector

Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này có thể giúp

họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ

sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng)

Phương pháp sắc kí lỏng – khối phổ (LC-MS) dựa trên cơ sở “ nối ghép” máy sắc kí lỏng với máy phổ khối lượng

Sắc kí phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tích các hỗn hợp phức tạp, đặc biệt là nhiều hợp phần trong hỗn hợp có độ phân cực lớn

Phương pháp phổ khối lượng có độ nhạy tuyệt vời (10-6

-10-9g) và tốc độ ghi nhanh sẽ cho thông tin xác định cấu trúc từ những lượng tách ra được như phương pháp sắc kí lỏng

Việc liên kết hai kĩ thuật đó đã tạo ra một công cụ mạnh mẽ để tách biệt và nhận biết các hợp phần của các hỗn hợp tự nhiên và tổng hợp Nhờ có sự liên kết chặc chẽ này người ta có thể thu được phổ khối lượng đủ chấp nhận đối với tất cả các hợp phần

mà sắc kí lỏng tách được, kể cả những hợp phần với khối lượng chỉ cỡ picrogam và có mặt trong vài giây

Ở hệ thống LC-MS người ta phải áp dụng những kĩ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc kí lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng

toàn bộ quá trình vận hành và ghi kết quả đều được tự động điều khiển bởi computer [2,4]

2.5 Phương pháp sắc kí khí – khối phổ

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS - Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất

và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS - Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng

và có cách giải quyết đối với một số hóa chất Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm… [2,4]

2.5.1 Sắc ký khí (GC - Gas Chromatography)

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng

lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động

Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích thước, kích cỡ rất đa dạng Độ dài cột GC có thể là 25m, 30m, 50m, 100m và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tráng bằng một lớp polimer đặc biệt như phenyl

5% + dimetylsiloxane polymer 95%, đường kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn

Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ Đây gọi là sắc kí đồ, mỗi một peak trong sắc kí đồ sẽ miêu tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký

và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu

2.5.2 Sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay) Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1 dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới này

Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định nồng độ của mỗi thành phần hóa chất

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được mô tả khái quát trên hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Thu nguyên liệu

Ngâm trong dung môi n-hexane